Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling af virusberiget inokulum til oral infektion af honningbier (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

Her beskriver vi to protokoller: for det første at formere, udtrække, rense og kvantificere store mængder honningbi-ikke-indhyllede viruspartikler, herunder en metode til fjernelse af honningbipupper og for det andet at teste virkningerne af virusinfektion ved hjælp af et meget repeterbart burbioassay med høj gennemstrømning.

Abstract

Honningbier er af stor økologisk og landbrugsmæssig betydning rundt om i verden, men er også udsat for en række pres, der påvirker biernes sundhed negativt, herunder eksponering for virale patogener. Sådanne vira kan forårsage en lang række ødelæggende virkninger og kan ofte være udfordrende at studere på grund af flere faktorer, der gør det vanskeligt at adskille virkningerne af eksperimentelle behandlinger fra allerede eksisterende baggrundsinfektion. Her præsenterer vi en metode til masseproduktion af store mængder viruspartikler sammen med et bioassay med høj gennemstrømning for at teste virusinfektion og effekter. Nødvendiggjort af den nuværende mangel på en kontinuerlig, virusfri honningbicellelinje forstærkes virale partikler in vivo ved hjælp af honningbipupper, der ekstraheres fra bikuben i store mængder ved hjælp af minimalt stressende metode. Disse viruspartikler kan derefter anvendes i honningbibur bioassays til at teste inokula levedygtighed, samt forskellige andre virusinfektionsdynamikker, herunder interaktioner med ernæring, pesticider og andre patogener. En stor fordel ved at bruge sådanne partikler er, at det i høj grad reducerer chancerne for at indføre ukendte variabler i efterfølgende eksperimenter sammenlignet med nuværende alternativer, såsom infektion via inficeret bi-hæmolymfe eller homogenat, selvom man stadig skal være forsigtig, når man køber bierne, for at minimere baggrundsvirusforurening. Buranalyserne er ikke en erstatning for store, feltrealistiske eksperimenter, der tester virusinfektionseffekter på koloniniveau, men fungerer i stedet som en metode til at etablere baseline virale responser, der i kombination med de halvrene viruspartikler kan tjene som vigtige værktøjer til at undersøge forskellige dimensioner af honningbivirus fysiologiske interaktioner.

Introduction

Honningbier (Apis mellifera) spiller en afgørende rolle i det moderne globale landbrugslandskab, men lider i øjeblikket af en kombination af biotiske og abiotiske stressfaktorer, herunder pesticideksponering, dårligt foder, parasitter og patogener 1,2. Et af de vigtigste patogener, der er bekymrende, er vira, hvoraf mange er vektoreret af en anden af de største honningbi-stressorer, den parasitære Varroa-mide (Varroa destructor). Disse vira kan forårsage en række negative virkninger hos honningbier, herunder nedsat yngleoverlevelse, udviklingsfejl og lammelse, der kan føre til total bikubekollaps både før og efter overvintringsperioder 3,4,5. Selvom der har været lovende fremskridt i udviklingen af teknologier, der bruges til at bekæmpe virusinfektion 6,7,8,9, er den dynamik, hvormed mange vira formerer sig, spredes og interagerer inden for en honningbi eller koloni, stadig dårligt forstået 5,10 . Forståelse af den grundlæggende biologi af honningbi- og virusinteraktioner og deres forhold til andre miljøfaktorer er afgørende for at udvikle effektive virushåndteringsteknikker.

At studere honningbi-virus-interaktioner udgør imidlertid udfordringer med mange kendte og ukendte faktorer, der komplicerer processen. Disse omfatter interaktioner med kost11,12, pesticideksponering13 og bigenetisk baggrund14,15. Selv når man fokuserer på virusinfektion alene, er komplikationer almindelige, fordi honningbipopulationer, både styrede og vilde, altid har en vis grad af baggrundsvirusinfektion, men ofte uden at manifestere akutte symptomer16,17, og virkningerne af virusseksfektion er ikke godt forstået18. Dette har gjort undersøgelsen af honningbiviruseffekter vanskelige at adskille.

Mange honningbivirusundersøgelser har brugt omstændelige virusinfektioner til at lede efter interaktioner med andre stressfaktorer og observere, hvordan baggrundsinfektioner ændres med andre behandlinger 12,19,20,21. Mens denne tilgang har haft succes med at identificere vigtige effekter, især at opdage, hvordan pesticid- eller diætbehandlinger påvirker virusniveauer og replikation, er podning med en virusbehandling af kendt indhold og koncentration afgørende for eksperimentel test af virusinfektionsdynamik. Alligevel kan det også give udfordringer at adskille eksperimentel behandling fra baggrundsinfektion. I feltstudier har forskere differentieret stammer af deformeret vingevirus (DWV) for at give bevis for virusoverførsel fra honningbier til humlebier22, men det ville være vanskeligt at bruge denne tilgang inden for honningbier alene. Virusinfektiøse kloner er et kraftfuldt værktøj, ikke kun til sporing af infektion 23,24,25, men til omvendte genetikundersøgelser af honningbivirus og til virus-værtsinteraktionsforskning 26,27,28. I de fleste tilfælde kræves der dog stadig infektiøse kloner for at opfylde infektionscyklussen inde i celler for at producere partikler. Sådanne partikler foretrækkes som inokuler til eksperimentelle behandlinger, fordi deres smitsomhed er højere end det nøgne virale RNA, og podning med indkapslede genomer efterligner en naturlig infektion.

Produktionen af ren, uforurenet honningbivirus inocula (vildtypevirusstammer eller dem, der stammer fra infektiøse kloner) giver også udfordringer. Disse skyldes primært vanskelighederne med at opnå en pålidelig, kontinuerligt replikerende, virusfri honningbicellelinje til fremstilling af rene stammevirus29,30. Mens nogle cellelinjer er blevet produceret, forbliver disse systemer ufuldkomne; Der er stadig håb om, at der kan produceres en levedygtig cellelinje29, hvilket ville give mulighed for finere kontrol med virusproduktion og -undersøgelse. Indtil en sådan linje bliver bredt tilgængelig, vil de fleste virusproduktionsprotokoller fortsat være afhængige af brugen af in vivo-virusproduktion og -rensning 18,31,32,33,34. Disse tilgange indebærer at identificere og rense viruspartikler af interesse (eller producere en infektiøs klon) og bruge dem til at inficere honningbier, normalt som pupper. Pupperne injiceres med målvirussen og ofres derefter, og yderligere partikler ekstraheres og renses. Men fordi ingen bier er virusfrie til at begynde med, er der altid en vis grad af forurening fra spor af andre vira i et sådant koncentrat, og derfor skal der udvises stor omhu ved valg af bier med lav sandsynlighed for baggrundsinfektioner. Endvidere er metoder til fjernelse af pupperne fra kamcellerne til brug i disse protokoller33 meget arbejdskrævende og kan fremkalde stress hos bierne, hvilket begrænser produktionen på disse måder18,32. Her rapporterer vi om en alternativ metode, der giver mulighed for storstilet fjernelse af larver med lidt arbejde og mindre mekanisk belastning på bierne.

Når pupper er opnået og injiceret med startvirusinokulumet, skal de inkuberes for at give virussen tid til at replikere. Efterfølgende kan producerede viruspartikler forarbejdes til en form, der kan bruges til at inficere eksperimentelle bier. Der er flere enkle metoder til at opnå dette, herunder anvendelse af et råhomogenat 35,36 eller hæmolymfe genereret fra viralt inficerede bier som en kilde til infektion37. Disse metoder er effektive, men løber ind i en større chance for at indføre ukendte variabler fra baggrundssubstratet (f.eks. Andre faktorer i de døde bi-homogenater). Derudover er det ønskeligt at koncentrere partiklerne, hvis et forsøg kræver at give en stor, kendt dosis af en virus på kort tid. For bedre kontrol foretrækkes det derfor at anvende metoder, der muliggør en vis grad af oprensning og koncentration af viruspartiklerne. Generelt vil en række nedbørs- og centrifugeringstrin resultere i fjernelse af næsten alt muligt virusmateriale uden for målet33.

Efter fremstilling af dette koncentrerede inokulum er det gavnligt at kvantificere de virale titre (qPCR) og karakterisere det med in vivo-bioassays for at teste dets levedygtighed og evne til at forårsage dødelighed samt at bekræfte, at øgede virustitre opnås efter infektion. Dette kan opnås gennem injektionsforsøg (enten i pupper eller voksne) eller fodringsforsøg (i larver eller voksne). Mens alle disse tilgange er mulige, er fodring til grupper af voksne bier i et bur ofte den hurtigste og enkleste. Buranalysemetoden anvendes også i vid udstrækning til at teste forskellige andre behandlinger på bier, herunder pesticidtoksicitet38, æggestokudvikling39 og ernæringsmæssig indflydelse på adfærd40,41 og kan derfor danne et godt grundlag for eksperimenter, der forbinder virusinfektion med andre faktorer42.

Her beskriver vi en pålidelig metode til fremstilling af store mængder halvrene, højt berigede viruspartikler uden brug af en dyr ultracentrifuge, herunder en metode til fjernelse af pupper, der reducerer arbejdskraft og mekanisk belastning på bierne og et meget repeterbart bioassay med høj gennemstrømning til test af virusinfektion og effekter. Ved nøje at kontrollere renheden af den virale inokuula er efterforskere i stand til at reducere variationen i honningbi viral respons i forhold til andre virale podningsmetoder. Desuden kan bioassay screene for virale effekter på et lille gruppeniveau ved hjælp af meget repeterbare eksperimentelle enheder, før de skaleres til feltrealistiske indstillinger, hvilket er langt mere arbejdskrævende at administrere. I kombination giver disse to metoder de nødvendige værktøjer til undersøgelser, der kan bidrage til at forbedre vores overordnede forståelse af honningbi-virus fysiologiske interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mulighed for ekstraktion af masselever 1: selvfjernelse af larver

  1. Bur en honningbidronning på en tom, langtrukken Langstroth-ramme og returner hende til sin koloni. Lad dronningen lægge æg på denne ramme i 24 timer.
    1. Kontroller rammen efter 24 timer for at sikre, at de fleste kamceller indeholder nylagte æg. Afhængigt af dronningen og kolonien lægges æg undertiden ikke særlig godt i de første 24 timer. Hvis dette sker, skal du tillade yderligere 24 timer og justere tiden efter behov.
  2. Efter 24 timers æglægningsperioden frigives dronningen. Marker rammen tydeligt og returner den til kolonien.
  3. Præcis 192 timer (8 dage) efter at have buret dronningen (forudsat normal æglægning inden for de første 24 timer; 8 dage markerer punktet lige før hvalp), skal du fjerne den markerede ramme fra kolonien. Børst alle voksne bier af, og overfør rammen til en inkubator, der matcher de indre forhold i en bikube (34 °C og 50 % relativ luftfugtighed (RH)).
    1. Kontroller, at det meste af rammen er fyldt med 5. instarlarver, som kan genkendes af deres store, hvide, c-formede kroppe, der presses tæt mod kamcellernes bundkanter. Der vil sandsynligvis også være et par celler, der allerede er dækket af en vokshætte, især nær midten af rammen.
  4. Forbered beholdere, der matcher højden og bredden af den larvefyldte ramme for at modtage de 5. instarlarver ved grundigt at rengøre de indre og ydre overflader med sæbe og vand efterfulgt af en blegemiddelopløsning og til sidst ethanol. Tør beholderen grundigt, inden du fortsætter.
    1. Liny bunden af beholderne med flere lag papirhåndklæder. Tilsæt derefter flere overlappende lag tyndere, absorberende rengøringsservietter (f.eks. Delikate opgaveviskere) eller filterpapir. Materialet skal være absorberende. Undgå at overlappe det øverste lag for at forbedre letheden ved fremtidig larveoverførsel.
  5. Placer rammer med forsiden nedad (med fokale larver nedad) oven på beholderne, så larverne kan falde ned på laget af rengøringsservietter.
    1. Dæk beholderen og rammen med et teltstykke aluminiumsfolie eller anden belægning for at bevare fugt og returnere opsætningen til inkubatoren. Lad opsætningen stå natten over. Larvernes naturlige fødesøgende tendenser vil få dem til at kravle ud af deres celler og falde ned på den polstrede overflade nedenunder.
  6. Forbered separate overførselsbakker ved at rengøre dem grundigt ved hjælp af de samme trin, der er beskrevet i 1.4. Lad bakkerne tørre og lag bunden med rengøringsservietter. Bakkerne behøver ikke at matche nogen specifikke dimensioner, men lavere bakker giver mulighed for lettere larvemanipulationer.
    1. Begynd at overføre larverne fra beholderne til bakkerne ved forsigtigt at løfte individuelle klude fra det øverste lag i beholderne og forsigtigt hælde larverne på bakkerne. Larverne skulle være faldet i beholderne natten over og danne flere klæbrige masser (figur 1A).
    2. Brug stumpe bløde tang til at adskille larverne og læg dem ud over overfladen af bakkerne. De behøver ikke at være jævnt fordelt og kan være tæt på hinanden, men bør ikke røres. Se figur 1B for en visuel afbildning af adskilte larver.
    3. Bet denne lejlighed til at fjerne eventuelle beskadigede (misfarvede) eller under gennemsnittet størrelse larver. Disse er mere tilbøjelige til at dø under modningsprocessen og kan medføre infektioner / svampevækst i hele bakken.
  7. Dæk bakken med teltaluminiumsfolie for at bevare fugt og returnere opsætningen til inkubatoren.
  8. Kontroller larverne dagligt og fjern dem, der er misfarvede (mørkebrune eller sorte).
    BEMÆRK: Larverne/præpupperne vil afføring på rengøringsservietterne og manifestere sig som små brune pletter. De kan også producere små mængder hvide, visne bånd som en del af deres capping proces. Ingen af disse hændelser nødvendiggør udskiftning af rengøringsservietterne, så længe de er absorberende.
  9. Tillad larver at forpuppe sig og modnes til det hvide øjestadium, som kan identificeres ved deres generelle form, der matcher en voksen bi, mens de stadig mangler pigmentering i deres øjne og det meste af resten af deres krop. Dette skal ske mellem 14 og 15 dage efter dronningens bur. Pupperne er nu klar til virusinjektion. Figur 1C, 1D for eksempler på hvide øjenpupper.

2. Mulighed for ekstraktion af masselepper 2: manuel puppeudskæring

BEMÆRK: Selvom mulighed 2 (puppeudskæring) er en levedygtig metode til biekstraktion, har den også flere ulemper sammenlignet med mulighed 1 (selvfjernelse af larver). Mulighed 2 er langt mere arbejdskrævende, sværere at kontrollere for puppealderen og generelt mere stressende for bierne selv. Mulighed 1 anbefales, når det er muligt.

  1. Vælg en ramme af honningbiyngel med hætte, der indeholder pupper på eller i nærheden af hvidøjestadiet (se 1.9 for en beskrivelse) fra en egnet koloni. Fjern afdækningen fra kamceller placeret nær midten og kanterne af rammen for at bekræfte tilstedeværelsen af det passende udviklingsstadium.
  2. Overfør rammen til en inkubator, der er indstillet til 34 °C og 50 % relativ luftfugtighed. Returner altid rammen til inkubatoren, når den ikke er i øjeblikkelig brug.
  3. Tilbered og rengør overføringsbakker, der er identiske med dem, der er beskrevet i 1.6.
  4. Fjern rammen fra inkubatoren og sæt den på et vinklet stativ under en lyskilde. Fugt en lille stak papirhåndklæder med vand.
  5. Rengør et par stumpe hårde tang med ethanol. Brug den rene tang til at fjerne afdækningen fra cellerne, der indeholder hvide øjenpupper, og pas på ikke at beskadige pupperne i processen.
  6. En efter en skal du forsigtigt skære pupperne fra kamcellerne. Det er sikrest at gribe fat i pupperne omkring brystkassen og maven ved hjælp af tangspidserne, hvis der er tilstrækkelig plads. Hvis ikke, kan pupper dog også fjernes ved at gribe fat i hovedet og langsomt vrikke det langt nok ud til derefter at blive grebet rundt om kroppen.
    1. Dæk de dele af rammen, der ikke umiddelbart er tilgængelige, med våde papirhåndklæder for at bevare fugten. Fjern og udskift efter behov under udskæringsprocessen.
  7. Placer de udskårne pupper langs rengøringsservietterne i overførselsbakkerne, og sørg for, at ingen af dem rører ved. Enhver vansiret eller misfarvet puppe skal kasseres. Pupper er nu klar til virusinjektion.
    1. Kassér pupper, der frigiver væske ved kontakt med kludene; de er sandsynligvis blevet punkteret. Nogle gange vil pupper udvise små mørke pletter af melanisering nær kontaktpunkterne med tangen inden for 1 time efter fjernelse. Dette bør ikke påvirke overlevelsen. Hvis der opstår store pletter af melanisering, skal de berørte pupper kasseres.

3. Pupal virus injektion

BEMÆRK: Hvis du udfører denne protokol for første gang (dvs. uden forudgående virale inokulabestande), skal du først udtrække og koncentrere partikler ved hjælp af voksne, pupper eller larver fra en koloni med en mistænkt infektion. Virale titre i den resulterende inokula som beskrevet i trin 5 måles, og det bestemmes, hvilke partikler der skal formere sig yderligere.

  1. Steriliser alle arbejdsflader ved hjælp af blegemiddelvand og ethanol, inden du begynder at arbejde med honningbivirus. Nitrilhandsker skal bæres under hele processen.
  2. Forbered et injektorapparat, der er i stand til at injicere væske i ~ 1 μL mængder.
    BEMÆRK: En billig, men effektiv tilgang ville være at skabe en håndlavet enhed ved at fastgøre en 30 G hypodermisk nål til spidsen af en 100 μL multidispenserspids (se Materialetabel) ved hjælp af fleksibel epoxy eller et andet flydende klæbemiddel. Sørg for, at nålehættens kanter er forseglet tæt mod multidispenserspidsen, og lad apparatet tørre. Se figur 2 for en visuel afbildning af et eksempel på et injektorapparat.
  3. Forbered en virusinjektionsfortyndingsopløsning ved at blande den ønskede type viruspartikler med steriliseret 1x PBS (fosfatbufret saltvand) i et 15 ml konisk centrifugerør. Den samlede mængde, der er behov for, afhænger af antallet af pupper, der skal injiceres, idet hver puppe kræver en 1 μL injektion (f.eks. 500 pupper = 5 μL viruspartikler + 495 μL PBS).
  4. Injektorapparatet fastgøres til en manuel multipipette, og effektiviteten testes ved at trække 100 μL vand ud af et separat bægerglas og dispensere det i doser på 1 μL. Sørg for, at hver udleveret mængde er ens, og udskift injektorapparatet efter behov. Fjern eventuelt resterende vand fra injektoren.
  5. Hent bakkerne med pupper, der genereres i trin 1 eller trin 2, fra inkubatoren, og fjern aluminiumsfoliebeklædningen.
  6. Rengør et par stumpe hårde tang med ethanol. Tag forsigtigt fat i den enkelte puppe langs brystkassen og påfør lige nok tryk til at tvinge indre væsker til maven. Dette skulle gøre tergitinddelingerne mere tydelige.
  7. Der udtøtes 100 μL af viruspartikelopløsningen ved hjælp af multipipetten, indsæt nålen mellem den tredje og fjerde abdominale tergit, og injicer 1 μL af virusopløsningen. Gentag for hver puppe, der er lagt ud på bakkerne, og pas på at undgå gentagne injektioner. Eventuelle pupper, der er beskadiget under processen, skal kasseres.
    FORSIGTIG: Alle viruspræparationsrelaterede materialer betegnes som biofarer og bør autoklaveres og bortskaffes efter institutionelle retningslinjer. Nåle bør også bortskaffes i hænde efter institutionelle retningslinjer.
  8. Dæk bakkerne med injicerede pupper med aluminiumsfolie og vend tilbage til inkubatoren. Lad viruspartiklerne formere sig i pupperne i 3-5 dage.
    1. Udfør daglige inspektioner på pupperne og fjern eventuelle døde eller rådne prøver for at forhindre bakterier eller svampeopbygning. Små punkter af melanisering kan forekomme på injektionsstedet på maven, men bør ikke påvirke overlevelsen.
  9. Prøve pupperne i 50 ml koniske centrifugerør og hvirvel for at homogenisere indholdet, og pas på at prøve pupper i rør ved kolonikilde for at reducere forurening fra ikke-målvira. Sørg for, at der ikke er hele pupper tilbage, og overfør rørene til en fryser på -80 °C, indtil de er klar til viruspartikeludfældning og -koncentration.

4. Viruspartikelkoncentration

BEMÆRK: Denne protokol er ikke testet til genopretning af indhyllede vira.

  1. Autoklave alle materialer og beholdere inden brug. Nitrilhandsker, laboratoriefrakker og øjenbeskyttelse skal bæres under hele denne proces. Steriliser alle arbejdsflader ved hjælp af blegemiddelvand, ethanol og RNase-inaktiverende opløsning, inden du begynder.
    1. Forbered 1x TES (Tris-EDTA-salt) buffer: Bland 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA og 150 mM NaCl. Steriliser ved autoklavering.
  2. Optø homogeniserede pupper og overfør til centrifugeflasker. Tilsæt ca. tre volumener 1x PBS (f.eks. Tilsæt et fuldt 50 ml rør pupper til 150 ml 1x PBS) og udlign volumener til den fulde flaske.
  3. Bland først i hånden og derefter ved at placere på en orbital shaker ved stuetemperatur i 10 minutter.
  4. Centrifuge ved 15.000 x g ved 4 °C i 5 minutter for at fjerne cellulært affald. Gentag dette trin efter behov, hvis der er cellulært affald tilbage.
    1. Hvis supernatanten har store fedtkugler, der flyder ved overfladen, filtreres gennem ostekloth i separate sterile centrifugeflasker, inden du fortsætter.
  5. Supernatanten ekstraheres med 0,3 volumener 24:1 chloroform:isoamylalkoholopløsning (f.eks. 190 ml supernatant + 57 ml chloroform:isoamylalkohol) og blandes ved inversion. Centrifuge ved 21.000 x g ved 4 °C i 20 min.
    FORSIGTIG: Undgå direkte kontakt med chloroform på huden eller øjnene. Brug altid ordentlige værnemidler. Alt kloroformaffald bør bortskaffes i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.
  6. Den vandige fase genvindes fra hver flaske ved at dekantere supernatanten i separate sterile 500 ml bægerglas i et isbad eller i et 4 °C koldt rum. Pas på at undgå at forurene supernatanten med chloroform, da det vil gøre rensningsprocessen vanskeligere; det er bedre at miste en lille smule vandig fase.
  7. Tilsæt RNase-frit vand for at bringe hvert bægerglas op til et volumen på 200 ml. Læg bægerglassene på magnetiske omrøringsplader og slip dem i en mellemstor omrøringsstang. Sæt pladerne til at røre ved en medium-lav indstilling.
  8. Tilsæt langsomt NaCl til hvert bægerglas under konstant blid omrøring, hvilket bringer hver op til en endelig koncentration på 2,3% (f.eks. 4,6 g NaCl pr. 200 ml supernatant). Der tilsættes polyethylenglycol 8000 (PEG) til hvert bægerglas op til en endelig koncentration på 7 % (f.eks. 14 g PEG pr. 200 ml supernatant).
  9. Dæk bægerglassene med aluminiumsfolie og fortsæt med at røre ved en medium-lav hastighed på is eller i et koldt rum i 1-5 timer for at opløse PEG. Jo mere tid der bruges på omrøring, desto mere grundigt opløses PEG.
  10. Sluk for omrøringspladerne. Inkuber de overdækkede bægerglas i 1-3 dage på is eller i et koldt rum for at tillade viruspartikler og proteiner at udfælde. Jo mere tid der bruges på at inkubere, jo flere partikler, der vil udfældes.
  11. Indholdet af hvert bægerglas overføres til separate rene centrifugeflasker og centrifuge ved 15 000 x g ved 4 °C i 30 minutter for at genvinde en PEG-partikelpille. Kassér supernatanten.
  12. Skrab forsigtigt PEG-partikelpillen af flaskens sider, og gensænk dem i minimale mængder 1x TES-buffer inde i rene bægerglas ved langsomt at tilføje små mængder TES til pellets (ca. 10 ml pr. 100 originale bier).
  13. Før den suspenderede pellet gennem en 18 G nål mindst ti gange, før aliciterer i 2 ml centrifugerør. Opbevar alle rør på is, indtil de er klar til 4.14.
  14. Centrifuge 2 ml rør ved 13.000 x g ved 4 °C i 15 minutter for at fjerne yderligere PEG. Overfør supernatanten til et andet 2 ml centrifugerør ved hjælp af en 1.000 μL pipette, og gentag centrifugeringstrinnet for at sikre fuldstændig fjernelse af al PEG.
  15. De resterende partikler i supernatanten koncentreres i nye centrifugerør ved hjælp af centrifugalfilterenheder (100 kDa cutoff) via flere runder centrifugering ved 14.000 x g ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter hver, indtil den oprindelige koncentration nås ca. en femtedel (10 ml partikel-TES-opløsning til ca. 2 ml koncentrerede partikler). Filterenhederne findes i forskellige størrelser; vælge det, der er mest hensigtsmæssigt for antallet af prøver, der behandles. De enheder, der passer ind i 15 ml-størrelse koniske rør, er normalt de mest hensigtsmæssige.
  16. Resuspend de koncentrerede partikler ved at passere gennem en 26 G hypodermisk nål og centrifuge ved 14.000 x g ved RT i 5 minutter for en sidste runde af PEG fjernelse. Hvis væsken stadig er overskyet, skal du gentage, indtil alt PEG-bundfald er fjernet.
  17. Aliquot det viskøse supernatant i ønskede mængder og opbevar det ved -80 °C, indtil det er klar til brug.

5. Virus RNA-ekstraktion og kvantificering

  1. Ekstrakt RNA fra hele bier eller koncentrerede viruspartikler ved hjælp af enhver passende RNA-ekstraktionsmetode (f.eks. TRIzol RNA-ekstraktionsreagens efterfulgt af DNase-behandling).
  2. Kvantificer virustitre i inokulum genereret i trin 5.1 via RT-qPCR, fortrinsvis ved hjælp af en standardkurvebaseret metode, der ikke er afhængig af værtsgenekspression18, selvom andre metoder også kan give mulighed for estimater.

6. Bioassay til viral fodring

  1. Forbered alle nødvendige materialer til bioassayet inden rammeopsamlingstrinnet (6.2) eller i løbet af 24-timers fremspiringsperioden for bier (6.3).
    1. Forbered rene bure eller andre anlæg, der kan huse det antal bier, der er nødvendigt for bioassayet (f.eks. akrylkassebure, der måler 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm), ved at tilslutte alle fødehuller med et centrifugerør af passende størrelse (figur 3). Bestem og randomiser behandlinger blandt burene og mærk hver enkelt med deres udpegede behandling for nem fremtidig reference.
    2. Forbered inokulumbakker ved at mærke individuelle mellemstore vejebåde med deres tilsvarende bur og behandling.
    3. Forbered fodringsopløsning ved at blande den passende mængde saccharose med deioniseret vand (f.eks. 300 g saccharose pr. 1 liter vand til en 30% saccharoseopløsning), og sørg for at sterilisere vandet før og efter tilsætning af saccharose. Steril saccharoseopløsning kan opbevares i et køleskab på 4 °C i flere uger, men bør kasseres, hvis der opstår uklarhed.
    4. Forbered føderør ved delvist at fylde 15 ml centrifugerør med fodringsopløsninger produceret i 6.1.3, vende dem om og stikke 1-2 huller rundt om spidsen af røret med en tommelfinger. Huller kan også smeltes ved hjælp af en 18G hypodermisk nål opvarmet over en flamme. Sørg for, at føderørshætter er skruet meget tæt på, da løstsiddende hætter kan forårsage langsomme lækager, der vil drukne burindbyggere natten over.
      BEMÆRK: Foderopløsninger og føderørsvolumen kan justeres efter behov, så de passer til eksperimentelle behov.
    5. Forbered en samling, der er modtagelig for nyligt fremkomne bier ved let at belægge kanterne på et stort kar med vegetabilsk olie eller et lignende fedtet stof. Forbered separat flere små kopper ved hjælp af samme belægningsmetode.
  2. Vælg og fjern rammer af honningbiyngel på randen af eclosion hentet fra mindst tre separate bistader. Passende lagrede bier ligner fuldt pigmenterede voksne under kamcellehætten. Et sikkert tegn på vedvarende fremkomst er at observere celleindbyggere, der langsomt tygger sig ud og / eller for nylig tømte celler med karakteristiske takkede tyggemærker langs vokshætten.
    BEMÆRK: Den nøjagtige mængde rammer, der kræves, afhænger af eksperimentets størrelse, mængden af ny yngel pr. Ramme og årstiden. En standard Langstroth dyb ramme indeholder ~ 3.000 kamceller pr. Side; en ramme, der for det meste indeholder capped pupper, med nogle observerede nye kan let producere 400+ bier på 24 timer. Juster i løbet af sæsonen efter behov.
  3. Børst alle voksne bier af, inden du placerer rammerne i fremspiringskasser og overfører dem til en inkubator, der matcher de indre forhold i en bikube (34 °C og 50 % RH). Lad bier dukke op i 24 timer.
  4. Fjern fremkomstkasserne fra inkubatoren og børst alle nyligt fremkomne bier i opsamlingsbøret. Sørg også for at fjerne alle bier fra fremkomstkasserne for at forhindre, at der medtages forkert lagrede bier i eventuelle efterfølgende børstninger. Enhver bi, der er i stand til at flyve, opstod for > 24 timer siden og bør udelukkes fra bioassay.
  5. Fremstil en homogeniseret blanding af nyligt fremkomne bier ved forsigtigt at blande bierne i opsamlingskarret i hånden (de kan ikke stikke i denne alder) for at minimere bikubens genetiske virkninger fra enhver enkelt koloni. Til specifikke anvendelser kan andre ordninger for kolonikilde være ønskelige.
  6. Tæl 35 individuelle bier ud, og læg hver enkelt i den samme smurte kop, inden indholdet overføres til et akrylbur. Alternativt kan det være lettere at adskille mindre multipler af bier i flere smurte kopper (f.eks. 5 kopper med 7 bier hver) for at undgå fejltællingsfejl. Antallet af anvendte bier kan varieres afhængigt af behov og anvendelser.
  7. Overfør biernes bure til en inkubator (34 °C og 50 % RH), og sørg for at følge den randomiserede placeringsrækkefølge, der er oprettet i 6.1.1, for at minimere eventuelle mikroklimaeffekter.
  8. Forbered arbejdsområdet på virusarbejde ved at rengøre alle overflader og pipetter med blegemiddelvand, ethanol og RNase-inaktiverende opløsning, inden du begynder. Sørg for at bære nitrilhandsker, når du håndterer viruspartikler.
  9. Virusinokulumet forberedes med en ønsket koncentration ved optøning af en passende mængde koncentrerede viruspartikler (trin 4.17) og blandes grundigt med tilstrækkelig saccharoseopløsning (trin 6.1.3) i en steril beholder. For bure med 35 bier kræver hver 600 μL inokulum. Serielle fortyndinger anbefales, hvis den ønskede viruskoncentration er på eller under 0,1%.
    1. For eksempel vil et eksperiment med 40 bure, der alle har brug for en 1% virusinokulum, kræve 24 ml virusopløsning, som kan skabes ved at kombinere 240 μL koncentrerede viruspartikler med 23,76 ml saccharoseopløsning. Det anbefales at medtage ca. 15% overage i det oprindelige volumen, da nogle tab kan forventes med viskøse væsker.
  10. De i 6.1.2 tilberedte inokulumbakker lægges sorteret efter behandlingstype, og pipetter 600 μL af det relevante inokulum på hver bakke.
    1. Indsæt forsigtigt inokulumbakkerne i deres tilsvarende bure, og pas på ikke ved et uheld at frigive bier. Benyt lejligheden til at scanne bierne og erstatte dem, der måtte være døde i overførselsprocessen.
  11. Der tillades fuldstændig indtagelse af inokulaen (ca. 12-14 timer), før centrifugerørene fjernes, hvilket blokerer det øverste fødehul, hvor de relevante føderør, der er fremstillet i 6.1.4, fjernes. Dette er med til at sikre, at bierne i buret deler inokulumet jævnt på tværs af bestanden. Saccharoseopløsning tilvejebringes ad libitum , og rørene skal genopfyldes efter behov i løbet af forsøget.
  12. Dødeligheden i hvert bur registreres med 12 timers intervaller for de første 72 timer af hvert forsøg, hvorefter optagelsen flyttes til 24 timers intervaller. Fjern døde bier fra bure for at gøre det lettere at tælle i fremtiden ved at skubbe burdøren lige langt nok op til, at et par tang kan nå ind og øse døde bier ud. Sørg for at sterilisere tangen over en alkohollampe mellem bure for at forhindre viral krydskontaminering.
  13. Prøve bier til viral titermåling (5.1-5.2) ved tilfældigt at udvælge levende prøver i hvert bur og placere dem i centrifugerør på tøris. Typisk er tre bier tilstrækkelige til at producere virale titermålinger på et givet tidspunkt uden også at affolke buret.
  14. Fortsæt regelmæssige dødelighedsmålinger, så længe det er nødvendigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket opfølgning af protokollerne (figur 1) for puppeinjektion og viral ekstraktion bør producere store mængder viruspartikler. Prøveudtagning og injektion af pupper hentet fra en række kolonier på flere tidspunkter maksimerer imidlertid chancerne for at erhverve målvirus med lav forurening. Den dynamik, hvormed vira replikerer og interagerer med hinanden inden for en honningbi, forstås ikke godt; kombineret med sandsynligheden for allerede eksisterende infektion er der ingen garanti for, at den injicerede (ønskede) virus vil blive den dominerende i en given puppe, selvom pupperne blev udtaget fra den samme oprindelige koloni. Figur 4 viser det potentielle interval af virale proportioner, som man kunne forvente at se efter ekstraktion. De fire viste kolonier repræsenterer en delmængde af en større virushøstningsindsats, hvor hver puppe oprindeligt blev injiceret med en ~ 95% israelsk akut lammelsesvirus (IAPV) inokulum. Selvom 10 ud af de 16 koloniprøver, der var involveret i disse ekstraktioner, indeholdt meget ren IAPV (> 95%), herunder nogle > 99% (f.eks. Koloni 1), varierede andre prøver i deres IAPV-andel (f.eks. Koloni 2-3), hvor nogle endda blev domineret af andre vira såsom deformeret vingevirus (DWV) (f.eks. Koloni 4).

Tabel 1 giver yderligere kontekst for amplifikationsniveauet for de fire vira (BQCV, DWV, IAPV, SBV) vist i figur 4 i form af RT-qPCR-tærskelcyklusværdier (Ct) (det punkt, hvor et PCR-mål når detektionstærsklen) og samlede virusgenomækvivalenter (ge) pr. 100 ng RNA. Ct-værdier kan bruges som en forudsigelse af proportioner, men ge-værdier skal beregnes ved hjælp af en standardkurvebaseret metode17. Bemærk, at den faktiske mængde producerede partikler (dvs. ge) afhænger af antallet af forarbejdede pupper og filtreringsstrengen under ekstraktionsprocessen.

Viruspartikelpræparater (forstærket inokulum) bør opbevares ved -80 °C, og det anbefales at alicitere dem, da de vil nedbrydes betydeligt, hvis de udsættes for flere fryse-optøningscyklusser18. Derudover bør dosis-respons-assays altid udføres inden forsøg, da en lang række eksterne faktorer (bikubegenetik, bi-sundhed osv.) kan føre til meget variabel viral respons. Ved hjælp af data fra forsøgsbure (figur 3) viser figur 5 en sådan variabilitet ved at sammenligne dosis-respons-overlevelseskurverne for honningbier, der fodres med de samme IAPV-partikler i løbet af to forskellige år. På trods af identiske testparametre, herunder de samme virale inokuler og testkoncentrationer fra 1 % til 0,01 % IAPV, frembragte de forsøg, der blev udført i 2018 (figur 5A) og 2019 (figur 5B), mærkbart forskellige overlevelsesresponser i alle undtagen kontrolbehandlingen, som ikke modtog nogen virus i saccharoseinokulumet. Bemærk, at hvis det ønskes, kan LD50-beregninger også udføres på dette tidspunkt for at opnå mere præcise dødelighedsmålinger43, men dette er normalt ikke nødvendigt, da tilnærmelser generelt er tilstrækkelige. I 2018 resulterede en dosis på 1% i ca. 50% overlevelse 72 timer efter infektion (hpi), hvilket gør det til standardkoncentrationen for de fleste virale burforsøg udført det år. Den samme dosis opnåede imidlertid næsten total dødelighed i 2019 på samme tidspunkt, og som følge heraf modtog de fleste virale burforsøg udført det år en 0,01% IAPV-inokulum i stedet. Denne signifikant lavere koncentration nåede de samme dødelighedsniveauer som en 1% IAPV-inokulum i 2018, samtidig med at der blev brugt 100 gange færre viruspartikler.

Disse data blev produceret med bioassays ved hjælp af bure svarende til det, der er diagrammet i figur 3. Fødehullerne i toppen og siden giver mulighed for nem kostkontrol, og skydebursdøren gør det nemt at tilføje eller fjerne genstande fra burmiljøet, såsom inokulumbakker eller døde bier. Den generaliserede virale assayprotokol er imidlertid ikke begrænset til disse typer bure eller diætvalg og bør ændres, så den passer til eksperimentelle behov.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative billeder af forskellige stadier under larvens selvfjernelsesprotokol. (A) Eksempel på larvemasse, der var forventet efter perioden for selvfjernelse natten over (1.6). (B) Larver adskilt fra hinanden på separate injektions-/vækstbakker (1.6.3) (C,D) Hvidøjede pupper klar til viral injektion (1.9). Brune pletter er tørret larvefrass, som ikke behøver at fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksempel injektorapparat skabt ved at kombinere en hypodermisk nål med en multi-dispenser spids. Nålen og spidsen blev forbundet ved hjælp af flydende klæbemiddel for konsekvent at levere 1 μL væskeinjektioner, når de var fastgjort til en gentagen pipetter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på bur anvendt i virusbioassay. Saccharoseopløsning og pollen blev leveret ad libitum gennem fødehuller i løbet af forsøgets varighed. Virusocula kunne let leveres ved hjælp af en bakke indsat gennem bunden af buret. Bemærk, at burtypen og foderindholdet kan justeres efter behov, så det passer til forsøgsparametrene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Gennemsnitlige samlede virusbelastninger og -proportioner på tværs af virale præparater fra fire prøvekolonier. Virusbelastninger blev målt ved RT-qPCR som sort dronningcellevirus (BQCV) + deformeret vingevirus (DWV) + israelsk akut lammelsesvirus (IAPV) + sacbroodvirus (SBV) genomækvivalenter (ge) i 100 ng RNA. Hver prøvekoloni bestod af 150+ homogeniserede pupper, der oprindeligt blev injiceret med IAPV og repræsenterer det typiske interval af virusproportioner genereret fra puppevirusinjektionsprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Dosis-respons overlevelseskurver for honningbi bioassay bure. Bure fra både 2018 (A) og 2019 (B) blev podet med IAPV og fodret med 30 % saccharoseopløsning ad libitum i hele forsøgets varighed. Behandlinger repræsenterer IAPV-inokulakoncentrationer med 10-2 til 10-4 , der angiver 1% til 0,1% IAPV-partikelpræparater blandet i 30% saccharoseopløsning; kontrol saccharose podninger indeholdt ingen virus. n = 56 bure i alt i 2018 n = 77 bure i alt i 2019. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Gennemsnitlig tærskelcyklus (Ct) værdier og genomækvivalenter pr. 100 ng RNA af virusblandinger i fire virale præparater fra fire prøvekolonier. Hver prøvekoloni består af 150+ homogeniserede pupper genereret fra pupalvirusinjektionsprotokollen. Virus blev påvist af RT-qPCR ved hjælp af specifikke primere for hver virus. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi skitseret metoder, der beskriver hvert trin i virusforstærknings- og inokulumbestandsforberedelsesprocessen, herunder indsamling af larver og virusformering, ekstraktion og koncentration samt viral behandling i form af burfodringsforsøg. Disse metoder gør det muligt at producere halvrene viruspartikler (figur 4), hvis effektivitet konsekvent kan kvantificeres ved dosis-respons-dødelighedstest for vira, der er dødelige for voksne (figur 5). Efter bekræftelse af infektiøs evne og/eller patologi kan de genererede partikler derefter anvendes i bioassays for at belyse interaktionerne mellem honningbier og honningbivirus.

En af de mest karakteristiske fordele ved de beskrevne protokoller er, at hver enkelt let skaleres til et stort volumen, hvad enten det er pupper høstet, producerede partikler eller bioassays udført. Ved hjælp af puppeudskæringsmetoder33 kan man forvente at fjerne ~ 100 pupper i timen, selvom dette tal vil skalere med dygtighed. Larvernes selvfjernelsesmetode, der rapporteres her, kan dog, samtidig med at den kræver forskellige planlægnings- og planlægningsprocedurer, let generere 10-20 gange så mange fjernede bier natten over, samtidig med at den involverer forholdsvis lidt manuel indsats og mindre mekanisk belastning på bierne.

Hovedbegrænsningen ved denne metode er, at der ikke er nogen måde at garantere, at de selvfjernede larver ikke tidligere var Varroa-inficerede. Regelmæssig midebehandling og overvågning af kildefeber kan minimere denne risiko, men nogle larver kan stadig have haft et vist niveau af Varroa-parasitering. Manuel fjernelse af pupper individuelt giver dog brugeren mulighed for at observere, om der er nogen mider til stede i cellen i en given puppe. Derudover, fordi selvfjernelsesprocessen er afhængig af larvernes fødesøgende adfærd, skal rammerne, der indeholder disse larver, fjernes inden den endelige fodring, der normalt forekommer. Kun på grund af denne mangel på proviantering fra arbejderne kryber larverne fra deres celler. Derfor oplever pupperne afledt af denne metode et meget kort vindue med ernæringsmæssig stress sammenlignet med larver, der udviklede sig helt inde i en koloni og kan forekomme lidt mindre. Dette er især bemærkelsesværdigt hos de yngste larver i kohorten, der findes på rammen; fordi dronningen har lagt æg over et 24 timers vindue, mangler disse larver forholdsmæssigt mere fodringstid. Disse er normalt tydeligt bemærkelsesværdige under hvalp for deres meget lille størrelse sammenlignet med dem, der fjernes ved manuel excision. Mængden af larver, der produceres ved selvfjernelse, kompenserer dog mere end for deres formindskede individuelle biomasse. Desuden kan den manuelle udskæringsmetode også forårsage betydelig mekanisk belastning af pupperne, da de trækkes fra deres celler. Hvis en af metoderne skal bruges som en del af et forsøg og ikke kun til at producere viruspartikler, skal man sørge for korrekt kontrol.

Uanset ekstraktionsmetoden kan virusformeringsprotokollen generere store mængder viruspartikler ved hjælp af pupper, hvilket minimerer variabiliteten induceret af andre aktuelt praktiserede viruspodningsmetoder 35,36,37, når man tester for honningbi viral respons. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol blev optimeret og testet ved hjælp af ikke-indhyllede vira i rækkefølgen Picornavirales (f.eks. Israelsk akut lammelsesvirus, deformeret vingevirus). Forskellige strategier til isolering af virale partikler bør følges, når man arbejder med indhyllede vira44. Som en grov tilnærmelse blev hver af de 16 prøver, der var involveret i virushøstningsindsatsen (som omfattede de 4 kolonier i figur 4), genereret fra 200-300 injicerede pupper og gav mellem 2-2,5 ml koncentrerede viruspartikelpræparater. Hvis man antager en virusinokulumkoncentration på 0,1 % og et standardbur med 35 bier, vil hvert af de 16 viruspræparater give tilstrækkelige partikler til 3.300-4.200 bure. Dette overskud af infektiøst materiale reducerer eksperimentelle restriktioner og muliggør bioassays med høj kapacitet. Det er vigtigt at bemærke, at selv om viruspartikelkoncentratet kan forblive levedygtigt i måneder eller år, når det opbevares ved -80 °C, kan det langsomt falde i smitsomhed, selv om det udsættes for få fryse-optøningscyklusser. Det anbefales derfor at opbevare den virale præparatbestand i små alikvoter, hvoraf flere derefter kan bruges til at kvantificere virale titre og verificere behandlingsdosis på tidspunktet for forsøget. Derudover forstærker variationen mellem år, der er påvist i figur 5, yderligere behovet for periodisk dosis-respons-test og minimerer dermed chancerne for uventet tab af virusets levedygtighed.

Selve burbioassays har også begrænsninger eller i det mindste forbehold, der er nødvendige for at tage hensyn til, idet den primære er den kunstige karakter af burbioassaymiljøet (figur 3). Gruppering af bier i kabinetter giver mulighed for viral test ud over det individuelle niveau; buret bliver forsøgsenheden snarere end selve bien. Selvom dette mere ligner en egentlig koloni end en enkelt bi, der behandles isoleret, er det stadig langt fra et realistisk bikubemiljø. Fjernet fra det sociale miljø, herunder dronning og yngleferomoner, bier i forskellige aldre og andre signaler, reagerer disse bier muligvis ikke som en koloni i fuld størrelse måske. Disse er dog primært overvejelser i forbindelse med større forsøg med bursystemet. De resultater, der indsamles fra virale bioassays i bure, bør primært behandles som basisinformationsetablering, der kan bruges til at informere fremtidige beslutninger om virustest skaleret til en mere feltrealistisk indstilling som ønsket af brugeren.

De her beskrevne metoder giver en standardiseret proces til masseproduktion af viruspartikler til brug i honningbi virale assays. Sådanne assays er allerede blevet implementeret for at undersøge forskellige aspekter af honningbi-virusinteraktioner, herunder multi-virusinfektion og hvordan kostkvalitet og kosttilskud påvirker overlevelse i lyset af virusinfektion 11,18,45,46. De er blevet skaleret op til brug i koloni-dækkende infektionsforsøg11,47 og for at studere virkningerne af infektion på adfærd47 og genekspression48. Samlet set giver disse metoder en baseline i værktøjer, der kan bruges til at producere og evaluere honningbivirus inocula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Julia Fine for hendes ideer og diskussion under protokoloprettelsesprocessen samt Dr. Cassondra Vernier for hendes nyttige kommentarer under hele redigeringen. Disse materialer bidrog til projekter, der delvist blev støttet af Fonden for Fødevare- og Jordbrugsforskning under bevilling ID 549025.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

Biologi udgave 162 honningbi Apis mellifera bivirus oral infektion burbioassay ekstraktion af virale partikler
Fremstilling af virusberiget inokulum til oral infektion af honningbier (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter