Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Abstract

Bal arıları dünya çapında büyük ekolojik ve tarımsal öneme sahiptir, ancak viral patojenlere maruz kalma da dahil olmak üzere arı sağlığını olumsuz yönde etkileyen çeşitli baskılara maruz kalmaktadır. Bu tür virüsler çok çeşitli yıkıcı etkilere neden olabilir ve deneysel tedavilerin etkilerini önceden var olan arka plan enfeksiyonundan ayırmayı zorlaştıran çoklu faktörler nedeniyle incelenmesi zor olabilir. Burada, viral enfeksiyonu ve etkileri test etmek için yüksek verimli bir biyotahlil ile birlikte büyük miktarlarda virüs parçacıklarını seri olarak üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli, virüssüz bir bal arısı hücre hattının mevcut eksikliğinin gerektirdiği viral parçacıklar, minimum stresli metodoloji kullanılarak kovandan büyük miktarlarda ekstrakte edilen bal arısı pupaları kullanılarak in vivo olarak çoğaltılır. Bu virüs parçacıkları daha sonra inoküla canlılığını test etmek için bal arısı kafesi biyotahlillerinde ve ayrıca beslenme, böcek ilaçları ve diğer patojenlerle etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli diğer virüs enfeksiyon dinamiklerinde kullanılabilir. Bu tür parçacıkları kullanmanın en büyük avantajı, enfekte arı hemolenfi veya homojenat yoluyla enfeksiyon gibi mevcut alternatiflerle karşılaştırıldığında, sonraki deneylerde bilinmeyen değişkenlerin ortaya çıkma şansını büyük ölçüde azaltmasıdır, ancak arıları tedarik ederken hala dikkatli olunmalıdır. Kafes tahlilleri, koloni düzeyinde virüs enfeksiyonu etkilerini test eden büyük ölçekli, saha gerçekçi deneylerin yerine geçmez, bunun yerine, yarı saf virüs parçacıkları ile kombinasyon halinde, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimlerinin çeşitli boyutlarını incelemek için önemli araçlar olarak hizmet edebilecek temel viral yanıtları oluşturmak için bir yöntem olarak işlev görür.

Introduction

Bal arıları (Apis mellifera) modern küresel tarım alanında kritik bir rol oynamaktadır, ancak şu anda pestisit maruziyeti, zayıf yem, parazitler ve patojenler dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik stresörlerin bir kombinasyonundan muzdariptir 1,2. Endişe verici en önemli patojenlerden biri, birçoğu büyük bal arısı stresörlerinden biri olan parazitik Varroa akarı (Varroa yıkıcı) tarafından vektörleştirilen virüslerdir. Bu virüsler, bal arılarında azalmış yavru sağkalımı, gelişimsel kusurlar ve felç dahil olmak üzere bir dizi olumsuz etkiye neden olabilir ve bu da kışlama dönemlerinden önce ve sonra toplam kovan çöküşüne yol açabilir 3,4,5. Virüs enfeksiyonu ile mücadelede kullanılan teknolojilerin geliştirilmesinde umut verici ilerlemeler olmasına rağmen 6,7,8,9, birçok virüsün bir bal arısı veya kolonisi içinde yayıldığı, yayıldığı ve etkileşime girdiği dinamikler hala tam olarak anlaşılamamıştır 5,10 . Bal arısı ve virüs etkileşimlerinin temel biyolojisini ve diğer çevresel faktörlerle ilişkilerini anlamak, etkili virüs yönetimi teknikleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Bununla birlikte, bal arısı-virüs etkileşimlerini incelemek, süreci zorlaştıran çok sayıda bilinen ve bilinmeyen faktörle ilgili zorluklar ortaya koymaktadır. Bunlar diyet 11,12, pestisit maruziyeti 13 ve arı genetik arka planı14,15 ile etkileşimleri içerir. Sadece virüs enfeksiyonuna odaklanıldığında bile, komplikasyonlar yaygındır, çünkü hem yönetilen hem de vahşi bal arısı popülasyonları, genellikle akut semptomlar göstermeden 16,17 ve virüs koenfeksiyonunun etkileri iyi anlaşılmamıştır18. Bu, bal arısı virüsü etkilerinin incelenmesini çözülmeyi zorlaştırmıştır.

Birçok bal arısı virüsü çalışması, arka plan enfeksiyonlarının diğer tedavilerle nasıl değiştiğini gözlemleyerek, diğer stresörlerle etkileşimleri aramak için durumsal virüs enfeksiyonlarını kullanmıştır 12,19,20,21. Bu yaklaşım, özellikle pestisit veya diyet tedavilerinin virüs seviyelerini ve replikasyonunu nasıl etkilediğini keşfetmede önemli etkileri belirlemede başarılı olsa da, bilinen içerik ve konsantrasyonun bir virüs tedavisi ile aşılama, virüs enfeksiyon dinamiklerinin deneysel olarak test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Yine de, deneysel tedaviyi arka plan enfeksiyonundan ayırmak da zorluklar doğurabilir. Saha çalışmalarında, araştırmacılar bal arılarından bombus arılarına virüs bulaşması için kanıt sağlamak için deforme olmuş kanat virüsü (DWV) suşlarını farklılaştırdılar22, ancak bu yaklaşımı kullanmak yalnızca bal arıları içinde zor olacaktır. Virüs enfeksiyöz klonları, sadece enfeksiyonu izlemek için değil 23,24,25 değil, bal arısı virüslerinin ters genetik çalışmaları ve virüs-konakçı etkileşim araştırması 26,27,28 için de güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çoğu durumda, parçacıklar üretmek için hücrelerin içindeki enfeksiyon döngüsünü yerine getirmek için bulaşıcı klonlara hala ihtiyaç vardır. Bu tür parçacıklar deneysel tedaviler için inoküla olarak tercih edilir, çünkü enfektiviteleri çıplak viral RNA'dan daha yüksektir ve kapsüllenmiş genomlarla aşılama doğal bir enfeksiyonu taklit eder.

Saf, kirlenmemiş bal arısı virüsü inocula'nın (vahşi tip virüs suşları veya bulaşıcı klonlardan türetilenler) üretimi de zorluklar doğurmaktadır. Bunlar temel olarak, saf suş virüsleri üretmek için güvenilir, sürekli çoğalan, virüssüz bir bal arısı hücre hattı elde etmedeki zorluklardan kaynaklanmaktadır29,30. Bazı hücre hatları üretilirken, bu sistemler kusurlu kalır; Yine de, virüs üretiminin ve araştırmasının daha iyi kontrol edilmesini sağlayacak uygulanabilir bir hücre hattının29 üretilebileceği umudu var. Böyle bir hat yaygın olarak kullanılabilir hale gelene kadar, çoğu virüs üretim protokolü in vivo virüs üretimi ve saflaştırma18,31,32,33,34 kullanımına güvenmeye devam edecektir. Bu yaklaşımlar, ilgilenilen virüs parçacıklarını tanımlamayı ve saflaştırmayı (veya bulaşıcı bir klon üretmeyi) ve bunları genellikle pupa olarak bal arılarını enfekte etmek için kullanmayı içerir. Pupa hedef virüs ile enjekte edilir ve daha sonra kurban edilir ve daha fazla parçacık ekstrakte edilir ve saflaştırılır. Bununla birlikte, başlangıçta hiçbir arı virüssüz olmadığından, bu tür bir konsantredeki diğer virüslerin izlerinden her zaman bir dereceye kadar kontaminasyon vardır ve bu nedenle, arka plan enfeksiyonları olasılığı düşük olan arıların seçiminde büyük özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu protokollerde kullanılmak üzere pupaları tarak hücrelerinden çıkarma yöntemleri33 çok emek yoğundur ve arılarda strese neden olabilir, bu sayede üretimi sınırlayabilir 18,32. Burada, larvaların az emek ve arılar üzerinde daha az mekanik stres ile büyük ölçekli olarak uzaklaştırılmasını sağlayan alternatif bir yöntem sunuyoruz.

Pupa elde edildikten ve başlangıç virüsü inokulumu ile enjekte edildikten sonra, virüsün çoğalmasını sağlamak için inkübe edilmeleri gerekir. Daha sonra, üretilen virüs parçacıkları, deneysel arıları enfekte etmek için kullanılabilecek bir formda işlenebilir. Bunu başarmak için, bir enfeksiyon kaynağı olarak ham homojenat35,36 veya viral olarak enfekte arılardan üretilen hemolenf kullanmak da dahil olmak üzere birkaç basit yöntem vardır37. Bu yöntemler etkilidir, ancak arka plan substratından bilinmeyen değişkenleri (örneğin, ölü arı homojenatlarındaki diğer faktörler) sokma şansı daha yüksektir. Ek olarak, bir deney kısa sürede büyük, bilinen bir virüs dozu vermeyi gerektiriyorsa, parçacıkların konsantre edilmesi arzu edilir. Bu nedenle, daha iyi kontrol için, virüs parçacıklarının bir miktar saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren yöntemlerin kullanılması tercih edilir. Genel olarak, bir dizi yağış ve santrifüjleme adımı, neredeyse tüm olası hedef dışı virüs materyalinin çıkarılmasıyla sonuçlanacaktır33.

Bu konsantre inokulumu ürettikten sonra, viral titreleri (qPCR) ölçmek ve canlılığını ve mortaliteye neden olma yeteneğini test etmek ve enfeksiyondan sonra artan virüs titrelerinin elde edildiğini doğrulamak için in vivo biyotahlillerle karakterize etmek faydalıdır. Bu, enjeksiyon deneyleri (pupa veya yetişkinlere) veya beslenme deneyleri (larvalara veya yetişkinlere) yoluyla elde edilebilir. Tüm bu yaklaşımlar mümkün olsa da, bir kafeste yetişkin arı gruplarına beslenme genellikle en hızlı ve en basit olanıdır. Kafes testi yöntemi, pestisit toksisitesi38, yumurtalık gelişimi39 ve davranış üzerindeki beslenme etkisi 40,41 dahil olmak üzere arılar üzerindeki çeşitli diğer tedavileri test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu nedenle, virüs enfeksiyonunu diğer faktörlerle ilişkilendiren deneyler için iyi bir temel oluşturabilir42.

Burada, arılar üzerindeki emeği ve mekanik stresi azaltan pupaları çıkarmak için bir yöntem ve viral enfeksiyon ve etkileri test etmek için oldukça tekrarlanabilir, yüksek verimli bir biyotahlil de dahil olmak üzere, pahalı bir ultrasantrifüj kullanmadan büyük miktarlarda yarı saf, yüksek oranda zenginleştirilmiş virüs parçacıkları üretmek için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Viral inokulusun saflığını sıkı bir şekilde kontrol ederek, araştırmacılar bal arısı viral yanıtındaki varyasyonu diğer viral aşılama yöntemlerine göre azaltabilirler. Ayrıca, biyotahlil, viral etkileri, yönetilmesi çok daha emek yoğun olan alan gerçekçi ayarlara ölçeklendirmeden önce, yüksek oranda tekrarlanabilir deneysel birimler kullanarak küçük gruplar düzeyinde tarayabilir. Kombinasyon halinde, bu iki yöntem, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimleri hakkındaki genel anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek çalışmalar için gerekli araçları sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kütle arı ekstraksiyon seçeneği 1: larva kendi kendine çıkarma

  1. Bir bal arısı kraliçesini boş, çizilmiş Langstroth çerçevesine kafesleyin ve onu kolonisine geri döndürün. Kraliçenin bu çerçeveye 24 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.
    1. Tarak hücrelerinin çoğunun yeni yumurtlayan yumurtalar içerdiğinden emin olmak için çerçeveyi 24 saat sonra kontrol edin. Kraliçeye ve koloniye bağlı olarak, yumurtalar bazen ilk 24 saatte çok iyi döşenmez. Bu durumda, 24 saat daha bekleyin ve süreyi gerektiği gibi ayarlayın.
  2. 24 saatlik yumurtlama döneminden sonra kraliçeyi serbest bırakın. Çerçeveyi açıkça işaretleyin ve koloniye geri gönderin.
  3. Kraliçeyi kafesledikten tam olarak 192 saat (8 gün) sonra (ilk 24 saat içinde normal yumurtlama varsayarak; 8 gün yavrulamadan hemen önceki noktayı işaretler), işaretli çerçeveyi koloniden çıkarın. Tüm yetişkin arıları fırçalayın ve çerçeveyi bir kovanın iç koşullarına uyan bir inkübatöre aktarın (34 ° C ve% 50 bağıl nem (RH)).
    1. Çerçevenin çoğunun, tarak hücrelerinin alt kenarlarına sıkıca bastırılmış büyük, beyaz, c şeklindeki gövdeleri tarafından tanınabilen 5. instar larvaları ile doldurulduğundan emin olun. Muhtemelen, özellikle çerçevenin merkezine yakın, bir balmumu kapağı ile kaplanmış birkaç hücre de olacaktır.
  4. İç ve dış yüzeyleri sabun ve su ile iyice temizleyerek, ardından bir ağartıcı çözeltisi ve son olarak etanol ile iyice temizleyerek 5. instar larvalarını almak için larva dolu çerçevenin yüksekliğine ve genişliğine uygun kaplar hazırlayın. Devam etmeden önce kabı iyice kurulayın.
    1. Kapların tabanını birkaç kat kağıt havlu ile hizalayın. Ardından, üst üste binen birkaç kat daha ince, emici temizleme mendili (örneğin, hassas görev silecekleri) veya filtre kağıdı ekleyin. Malzeme emici olmalıdır. Gelecekteki larva transferinin kolaylığını artırmak için üst tabakanın üst üste binmesinden kaçının.
  5. Çerçeveleri kapların üstüne yüzü aşağı bakacak şekilde (fokal larvalar aşağıya bakacak şekilde) yerleştirin, böylece larvalar temizlik mendilleri tabakasına düşebilir.
    1. Kabı ve çerçeveyi, nemi korumak ve kurulumu inkübatöre geri döndürmek için çadırlı bir alüminyum folyo parçası veya başka bir örtü ile örtün. Kurulumu gece boyunca bırakın. Larvaların doğal yiyecek arama eğilimleri, hücrelerinden sürünmelerine ve aşağıdaki yastıklı yüzeye düşmelerine neden olacaktır.
  6. Ayrı transfer tepsilerini, 1.4'te ayrıntılı olarak açıklanan adımları kullanarak iyice temizleyerek hazırlayın. Tepsilerin kurumasına izin verin ve alt kısımları temizleme mendilleriyle kaplayın. Tepsilerin belirli boyutlarla eşleşmesi gerekmez, ancak sığ tepsiler daha kolay larva manipülasyonlarına izin verecektir.
    1. Larvaları, kaplardaki üst tabakadan tek tek mendilleri dikkatlice kaldırarak ve larvaları tepsilere yavaşça dökerek kaplardan, tepsilere aktarmaya başlayın. Larvalar bir gecede kaplara düşmüş ve birkaç yapışkan kütle oluşturmuş olmalıdır (Şekil 1A).
    2. Larvaları ayırmak ve tepsilerin yüzeyine yerleştirmek için künt yumuşak forseps kullanın. Eşit aralıklı olmaları gerekmez ve birbirlerine yakın olabilirler, ancak dokunmamaları gerekir. Ayrılmış larvaların görsel tasviri için Şekil 1B'ye bakınız.
    3. Herhangi bir hasarlı (renksiz) veya ortalamanın altında büyüklükte larvaları çıkarmak için bu fırsatı kullanın. Bunların olgunlaşma sürecinde ölme olasılığı daha yüksektir ve tepsi boyunca enfeksiyonlar / mantar büyümesi getirebilir.
  7. Nemi korumak ve kurulumu inkübatöre geri döndürmek için tepsiyi çadırlı alüminyum folyo ile örtün.
  8. Larvaları günlük olarak kontrol edin ve renksiz olanları çıkarın (koyu kahverengi veya siyah).
    NOT: Larvalar / pre-pupalar temizleme mendillerine dışkılayacak ve küçük kahverengi lekeler olarak ortaya çıkacaktır. Ayrıca, kapaklama işlemlerinin bir parçası olarak az miktarda beyaz, ince dokuma da üretebilirler. Bu olayların hiçbiri, emici oldukları sürece temizlik mendillerinin değiştirilmesini gerektirmez.
  9. Larvaların beyaz göz aşamasına kadar yavrulanmasına ve olgunlaşmasına izin verin, bu da yetişkin bir arınınkiyle eşleşen genel şekilleriyle tanımlanabilirken, gözlerinde ve vücutlarının geri kalanının çoğunda pigmentasyondan yoksundur. Bu, kraliçe kafeslemeden 14 ila 15 gün sonra gerçekleşmelidir. Pupa artık virüs enjeksiyonu için hazır. Şekil 1C, beyaz göz pupa örnekleri için 1D.

2. Kütle arı ekstraksiyonu seçeneği 2: manuel pupa eksizyonu

NOT: Seçenek 2 (pupa eksizyonu) uygulanabilir bir arı ekstraksiyonu yöntemi olmasına rağmen, seçenek 1 (larvaların kendi kendini çıkarma) ile karşılaştırıldığında çeşitli dezavantajlara da sahiptir. Seçenek 2 çok daha fazla emek yoğundur, pupa yaşı için kontrol edilmesi daha zordur ve genellikle arıların kendileri üzerinde daha streslidir. Seçenek 1 mümkün olduğunda önerilir.

  1. Uygun bir koloniden beyaz göz evresinde veya yakınında pupa içeren kapaklı bir bal arısı yavrusu çerçevesi seçin (açıklama için 1.9'a bakınız). Uygun gelişim aşamasının varlığını doğrulamak için çerçevenin merkezine ve kenarlarına yakın bulunan tarak hücrelerinden kapağı çıkarın.
  2. Çerçeveyi 34 °C'ye ve% 50 bağıl neme ayarlanmış bir inkübatöre aktarın. Hemen kullanılmadığında çerçeveyi daima inkübatöre geri koyun.
  3. 1.6'da açıklananlarla aynı transfer tepsilerini hazırlayın ve temizleyin.
  4. Çerçeveyi inkübatörden çıkarın ve bir ışık kaynağının altındaki açılı bir standa yerleştirin. Küçük bir kağıt havlu yığınını suyla nemlendirin.
  5. Etanol kullanarak bir çift künt sert forseps temizleyin. Temiz forsepsleri kullanarak, beyaz göz pupaları içeren hücrelerden kapağı çıkarın, bu süreçte pupaya zarar vermemeye özen gösterin.
  6. Tek tek, pupaları tarak hücrelerinden nazikçe çıkarın. Yeterli alan varsa, forseps uçlarını kullanarak toraks ve karın çevresindeki pupaları kavramak en güvenli yöntemdir. Bununla birlikte, değilse, pupalar kafayı kavrayarak ve yavaşça vücudun etrafında kavranacak kadar uzağa kıpırdayarak da çıkarılabilir.
    1. Nemi korumak için çerçevenin hemen erişilmeyen kısımlarını ıslak kağıt havlularla örtün. Eksizyon işlemi sırasında gerektiği gibi çıkarın ve değiştirin.
  7. Eksize edilmiş pupaları transfer tepsilerindeki temizleme mendilleri boyunca yerleştirin ve hiçbirinin dokunmadığından emin olun. Şekli bozuk veya renksiz pupalar atılmalıdır. Pupa artık virüs enjeksiyonu için hazır.
    1. Mendillerle temas ettiğinde sıvıyı serbest bırakan pupaları atın; muhtemelen delinmişlerdir. Bazen, pupalar, çıkarıldıktan sonra 1 saat içinde forseps ile temas noktalarının yakınında küçük koyu melanizasyon lekeleri sergileyecektir. Bu hayatta kalmayı etkilememelidir. Büyük melanizasyon lekeleri ortaya çıkarsa, etkilenen pupalar atılmalıdır.

3. Pupa virüsü enjeksiyonu

NOT: Bu protokolü ilk kez yapıyorsanız (yani, önceden viral inoküla stokları olmadan), önce şüpheli bir enfeksiyonu olan bir koloniden yetişkinler, pupa veya larvalar kullanarak parçacıkları ekstrakte edin ve konsantre edin. Elde edilen inokululdaki viral titreleri adım 5'te açıklandığı gibi ölçün ve hangi parçacıkların daha fazla yayılacağını belirleyin.

  1. Bal arısı virüsleri ile çalışmaya başlamadan önce ağartıcı su ve etanol kullanarak tüm çalışma yüzeylerini sterilize edin. Tüm süreç boyunca nitril eldivenler giyilmelidir.
  2. ~1 μL miktarlarda sıvı enjekte edebilen bir enjektör aparatı hazırlayın.
    NOT: Ucuz ama etkili bir yaklaşım, esnek epoksi veya başka bir sıvı yapıştırıcı kullanarak 100 μL'lik bir çoklu dağıtıcı ucun ucuna 30 G'lik bir hipodermik iğne takarak el yapımı bir cihaz oluşturmak olacaktır (bkz. İğne kapağının kenarlarının çok dağıtıcılı uca sıkıca kapatıldığından emin olun ve aparatın kurumasını bekleyin. Örnek bir enjektör aparatının görsel tasviri için Şekil 2'ye bakınız.
  3. İstenilen virüs partiküllerini 15 mL'lik konik santrifüj tüpünde sterilize edilmiş 1x PBS (fosfat tamponlu salin) ile karıştırarak bir virüs enjeksiyonu seyreltme çözeltisi hazırlayın. İhtiyaç duyulan toplam miktar, enjekte edilmesi gereken pupa sayısına bağlı olacaktır, her pupa 1 μL enjeksiyon gerektirir (örneğin, 500 pupa = 5 μL virüs parçacıkları + 495 μL PBS).
  4. Enjektör aparatını manuel bir çoklu pipete takın ve ayrı bir beherden 100 μL su çekerek ve 1 μL dozlarda dağıtarak etkinliği test edin. Dağıtılan her miktarın eşit olduğundan emin olun, gerektiğinde enjektör aparatını değiştirin. Enjektörden kalan suyu temizleyin.
  5. Adım 1 veya adım 2'de üretilen pupa tepsilerini inkübatörden alın ve alüminyum folyo kaplamasını çıkarın.
  6. Etanol kullanarak bir çift künt sert forseps temizleyin. Bireysel pupayı göğüs kafesi boyunca yavaşça kavrayın ve iç sıvıları karnına zorlamak için yeterli basınç uygulayın. Bu, tergit bölünmelerini daha belirgin hale getirmelidir.
  7. Çoklu pipeti kullanarak 100 μL virüs parçacık çözeltisi hazırlayın, iğneyi üçüncü ve dördüncü karın tergitleri arasına yerleştirin ve virüs çözeltisinin 1 μL'sini enjekte edin. Tepsilere yerleştirilen her pupa için tekrarlayın, tekrarlanan enjeksiyonlardan kaçınmaya özen gösterin. İşlem sırasında hasar gören pupalar atılmalıdır.
    DİKKAT: Virüs hazırlama ile ilgili tüm materyaller biyolojik tehlike olarak belirlenmiştir ve otoklavlanmalı ve aşağıdaki kurumsal yönergelere uygun olarak atılmalıdır. İğneler ayrıca kurumsal kurallara uygun olarak atılmalıdır.
  8. Enjekte edilen pupaların tepsilerini alüminyum folyo ile örtün ve inkübatöre geri dönün. Virüs parçacıklarının 3-5 gün boyunca pupa içinde yayılmasına izin verin.
    1. Pupa üzerinde günlük denetimler yapın ve bakteri veya mantar birikimini önlemek için ölü veya çürüyen örnekleri çıkarın. Karınlardaki enjeksiyon bölgesinde küçük melanizasyon noktaları görünebilir, ancak sağkalımı etkilememelidir.
  9. İçeriği homojenize etmek için pupaları 50 mL konik santrifüj tüplerine ve vortekse örnekleyin, hedef olmayan virüslerden kaynaklanan kontaminasyonu azaltmak için pupaları koloni kaynağına göre tüplere örneklemeye özen gösterin. Bütün pupaların kalmadığından emin olun ve tüpleri virüs parçacığı çökeltmesi ve konsantrasyonu için hazır olana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.

4. Virüs partikül konsantrasyonu

NOT: Bu protokol, zarflı virüslerin kurtarılması için test edilmemiştir.

  1. Kullanmadan önce tüm malzemeleri ve kapları otoklav yapın. Tüm bu süreç boyunca nitril eldivenler, laboratuvar önlükleri ve göz koruması giyilmelidir. Başlamadan önce ağartıcı su, etanol ve RNaz inaktive edici çözelti kullanarak tüm çalışma yüzeylerini sterilize edin.
    1. 1x TES (Tris-EDTA-tuz) tamponu hazırlayın: 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA ve 150 mM NaCl karıştırın. Otoklavlama ile sterilize edin.
  2. Homojenize pupaları çözün ve santrifüj şişelerine aktarın. Yaklaşık üç hacim 1x PBS ekleyin (örneğin; 150 mL'lik 1x PBS'ye tam 50 mL pupa tüpü ekleyin) ve hacimleri en dolu şişeninkine eşitleyin.
  3. Önce elle ve daha sonra 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirerek karıştırın.
  4. Hücresel kalıntıları gidermek için 4 ° C'de 15.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj. Hücresel kalıntı kalırsa bu adımı gerektiği gibi tekrarlayın.
    1. Süpernatantın yüzeyde yüzen büyük yağ kürecikleri varsa, devam etmeden önce tülbentten ayrı steril santrifüj şişelerine süzün.
  5. Süpernatantı 0.3 hacim 24: 1 kloroform: izoamil alkol çözeltisi (örneğin, 190 mL süpernatant + 57 mL kloroform: izoamil alkol) ile çıkarın ve ters çevirerek karıştırın. 20 dakika boyunca 4 °C'de 21.000 x g'de santrifüj.
    DİKKAT: Cilt veya gözlerde kloroform ile doğrudan temastan kaçının. Her zaman uygun KKD giyin. Tüm kloroform atıkları, kurumsal kurallara uygun olarak bertaraf edilmelidir.
  6. Süpernatantı bir buz banyosunda veya 4 °C soğuk odada ayrı steril 500 mL beherlere boşaltarak her şişeden sulu fazı geri kazanın. Süpernatantın kloroform ile kirlenmesini önlemeye dikkat edin, çünkü saflaştırma işlemini daha zor hale getirecektir; biraz sulu fazı kaybetmek daha iyidir.
  7. Her bir beheri 200 mL'lik bir hacme getirmek için RNase içermeyen su ekleyin. Beherleri manyetik karıştırma plakalarına yerleştirin ve orta büyüklükte bir karıştırma çubuğuna bırakın. Plakaları orta-düşük bir ayarda karıştırılacak şekilde ayarlayın.
  8. Her bir beherin üzerine sürekli hafifçe karıştırarak yavaşça NaCl ekleyin ve her birini% 2.3'lük bir nihai konsantrasyona getirin (örneğin, 200 mL süpernatan başına 4.6 g NaCl). Her bir behere% 7'lik bir nihai konsantrasyona kadar polietilen glikol 8000 (PEG) ekleyin (örneğin, süpernatanın 200 mL'si başına 14 g PEG).
  9. Beherleri alüminyum folyo ile örtün ve PEG'i çözmek için buz üzerinde veya soğuk bir odada 1-5 saat boyunca orta-düşük hızda karıştırmaya devam edin. Karıştırmak için ne kadar çok zaman harcanırsa, PEG o kadar iyice çözülür.
  10. Karıştırma plakalarını kapatın. Virüs parçacıklarının ve proteinlerinin çökelmesine izin vermek için örtülü beherleri 1-3 gün boyunca buz üzerinde veya soğuk bir odada inkübe edin. Kuluçka için ne kadar çok zaman harcanırsa, çökelecek daha fazla parçacık olur.
  11. Her bir beherin içeriğini ayrı temiz santrifüj şişelerine aktarın ve bir PEG parçacık peletini geri kazanmak için 30 dakika boyunca 4 ° C'de 15.000 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.
  12. PEG parçacığı peletini şişenin kenarlarından dikkatlice kazıyın ve peletlere yavaşça az miktarda TES ekleyerek (100 orijinal arı başına yaklaşık 10 mL) temiz beherlerin içindeki minimum hacimlerde 1x TES tamponunda yeniden askıya alın.
  13. 2 mL santrifüj tüplerine aktarmadan önce askıya alınmış peleti 18 G'lik bir iğneden en az on kez geçirin. 4.14'e hazır olana kadar tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
  14. Ek PEG'i çıkarmak için 15 dakika boyunca 4 °C'de 13.000 x g'de 2 mL boruyu santrifüj yapın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı başka bir 2 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tüm PEG'lerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için santrifüjleme adımını tekrarlayın.
  15. Süpernatant içindeki kalan partikülleri, orijinal konsantrasyonun yaklaşık beşte birine (yaklaşık 2 mL konsantre partiküllere 10 mL partikül-TES çözeltisi) ulaşana kadar, oda sıcaklığında (RT) 14.000 x g'de 14.000 x g'de birkaç tur santrifüjleme yoluyla santrifüj tüplerine (100 kDa kesme) konsantre edin. Filtre üniteleri farklı boyutlarda gelir; işlenmekte olan numune sayısı için en uygun olanı seçin. 15 mL boyutundaki konik tüplere uyan üniteler genellikle en uygun olanlardır.
  16. Son bir PEG çıkarma turu için RT'de 14.000 x g'da 26 G hipodermik iğne ve santrifüjden 5 dakika boyunca geçerek konsantre parçacıkları yeniden askıya alın. Sıvı hala bulanıksa, tüm PEG çökeltisi giderilene kadar tekrarlayın.
  17. Viskoz süpernatantı istenen miktarlarda alıkoyun ve kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

5. Virüs RNA ekstraksiyonu ve nicelleştirme

  1. Herhangi bir uygun RNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak RNA'yı bütün arılardan veya konsantre virüs parçacıklarından ekstrakte edin (örneğin, TRIzol RNA ekstraksiyon reaktifi ve ardından DNaz tedavisi).
  2. RT-qPCR aracılığıyla adım 5.1'de üretilen inokulumdaki virüs titrelerini sayın, tercihen konakçı gen ekspresyonu18'e dayanmayan standart eğri tabanlı bir yöntem kullanarak, ancak diğer yöntemler de tahminlere izin verebilir.

6. Viral beslenme biyotahlili

  1. Çerçeve toplama adımından önce (6.2) veya 24 saatlik arı ortaya çıkma döneminde (6.3) biyotahlil için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın.
    1. Tüm besleyici deliklerini uygun büyüklükte bir santrifüj tüpü ile tıkayarak biyotahlil için gerekli arı sayısını (örneğin, 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm ölçülerinde akrilik kutu kafesleri) barındırabilecek temiz kafesler veya diğer muhafazalar hazırlayın (Şekil 3). Kafesler arasındaki tedavileri belirleyin ve randomize edin ve gelecekteki kolay referans için her birini belirlenmiş tedavileriyle etiketleyin.
    2. İnokulum tepsilerini, orta büyüklükteki tartım teknelerini ilgili kafesleri ve işlemleriyle etiketleyerek hazırlayın.
    3. Uygun miktarda sakarozu deiyonize suyla karıştırarak besleme çözeltisi hazırlayın (örneğin,% 30'luk bir sakkaroz çözeltisi için 1 L su başına 300 g sakaroz), sakkaroz eklemeden önce ve sonra suyu sterilize ettiğinizden emin olun. Steril sakkaroz çözeltisi birkaç hafta boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabında saklanabilir, ancak herhangi bir bulanıklık ortaya çıkarsa atılmalıdır.
    4. 15 mL santrifüj tüplerini 6.1.3'te üretilen besleme çözeltileriyle kısmen doldurarak, ters çevirerek ve tüpün ucunun etrafına bir parmak ucu ile 1-2 delik açarak besleyici tüpleri hazırlayın. Delikler ayrıca bir alev üzerinde ısıtılan 18G hipodermik bir iğne kullanılarak da eritilebilir. Besleyici tüp kapaklarının çok sıkı bir şekilde vidalandığından emin olun, çünkü gevşek takılan kapaklar kafes sakinlerini gece boyunca boğacak yavaş sızıntılara neden olabilir.
      NOT: Besleme çözeltileri ve besleyici tüp hacmi, deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde gerektiği gibi ayarlanabilir.
    5. Büyük bir küvetin kenarlarını bitkisel yağ veya benzeri bir yağlı madde ile hafifçe kaplayarak yeni ortaya çıkan arılar için algılanabilir bir koleksiyon hazırlayın. Ayrı olarak, aynı kaplama yöntemini kullanarak birkaç küçük bardak hazırlayın.
  2. En az üç ayrı kovandan elde edilen eklozyonun eşiğindeki bal arısı yavrusu çerçevelerini seçin ve çıkarın. Uygun şekilde yaşlanmış arılar, tarak hücresi kapağının altındaki tamamen pigmentli yetişkinlere benzer. Devam eden ortaya çıkışın kesin bir işareti, hücre sakinlerinin yavaşça dışarı çıkmalarını ve / veya yakın zamanda boşalmış hücreleri, balmumu kapağı boyunca karakteristik pürüzlü çiğneme izleriyle gözlemlemektir.
    NOT: Gerekli karelerin tam miktarı, deneyin boyutuna, kare başına ortaya çıkan yavru miktarına ve yılın zamanına bağlı olacaktır. Standart bir Langstroth derin çerçevesi, her tarafta ~ 3.000 tarak hücresi içerir; Çoğunlukla kapaklı pupalar içeren bir çerçeve, bazılarının ortaya çıktığı gözlemlendiğinde, 24 saat içinde kolayca 400'den fazla arı üretebilir. Gerektiğinde sezon boyunca ayarlayın.
  3. Çerçeveleri ortaya çıkma kutularına yerleştirmeden ve bunları bir kovanın iç koşullarına (34 ° C ve% 50 RH) uyan bir inkübatöre aktarmadan önce tüm yetişkin arıları fırçalayın. Arıların 24 saat boyunca ortaya çıkmasına izin verin.
  4. Ortaya çıkan kutuları inkübatörden çıkarın ve yeni ortaya çıkan tüm arıları toplama küvetine fırçalayın. Yanlış yaşlanmış arıların sonraki fırçalamalara dahil edilmesini önlemek için tüm arıları ortaya çıkma kutularından da çıkardığınızdan emin olun. Uçabilen herhangi bir arı 24 saat önce ortaya > ve biyotahlilden çıkarılmalıdır.
  5. Herhangi bir koloniden kovan genetik etkilerini en aza indirmek için toplama küvetindeki arıları elle nazikçe karıştırarak (bu yaşta sokamazlar) yeni ortaya çıkan arıların homojenize edilmiş bir karışımını üretin. Özel uygulamalar için, koloni kaynağı için başka düzenlemeler istenebilir.
  6. İçeriği akrilik bir kafese aktarmadan önce her birini aynı yağlanmış kaba yerleştirerek 35 ayrı arı sayın. Alternatif olarak, yanlış sayım hatalarını önlemek için daha küçük arı katlarını birkaç yağlanmış kaba (örneğin, her biri 5 bardak 7 arı) ayırmak daha kolay olabilir. Kullanılan arı sayısı, ihtiyaçlara ve uygulamalara göre değişebilir.
  7. Arıların kafeslerini bir inkübatöre (34 ° C ve% 50 RH) aktarın, potansiyel mikro iklim etkilerini en aza indirmek için 6.1.1'de oluşturulan rastgele yerleştirme sırasını izlediğinizden emin olun.
  8. Başlamadan önce tüm yüzeyleri ve pipetleri ağartıcı su, etanol ve RNaz inaktive edici çözelti ile temizleyerek çalışma alanını virüs çalışması için hazırlayın. Virüs parçacıklarını tutarken nitril eldiven giydiğinizden emin olun.
  9. Uygun miktarda konsantre virüs partikülünü çözerek (adım 4.17) ve steril bir kapta yeterli sakkaroz çözeltisi (adım 6.1.3) ile iyice karıştırarak istenen konsantrasyondaki virüs inokulumunu hazırlayın. 35 arı kafesi için, her biri 600 μL inokülum gerektirir. İstenilen virüs konsantrasyonu% 0.1 veya altındaysa seri seyreltmeler önerilir.
    1. Örneğin, hepsi% 1'lik bir virüs inokulumuna ihtiyaç duyan 40 kafesi içeren bir deney, 240 μL konsantre virüs parçacıklarının 23.76 mL sakkaroz çözeltisi ile birleştirilmesiyle oluşturulabilen 24 mL virüs çözeltisi gerektirecektir. Viskoz sıvılarda bazı kayıplar bekleneceğinden, ilk hacme yaklaşık% 15 fazlalık eklenmesi önerilir.
  10. 6.1.2'de hazırlanan inokulum tepsilerini tedavi tipine göre sıralayın ve her tepsiye uygun inokulumdan 600 μL'lik pipet yerleştirin.
    1. İnokulum tepsilerini dikkatlice ilgili kafeslerine yerleştirin ve yanlışlıkla herhangi bir arıyı serbest bırakmamaya dikkat edin. Arıları taramak ve transfer sürecinde ölmüş olabilecek herhangi birini değiştirmek için bu fırsatı kullanın.
  11. 6.1.4'te hazırlanan uygun besleyici tüplerini yerleştiren üst besleyici deliğini tıkayan santrifüj tüplerini çıkarmadan önce inokulanın tam tüketimine izin verin (yaklaşık 12-14 saat). Bu, kafesteki arıların inokulumu, popülasyon genelinde eşit olarak paylaşmasını sağlamaya yardımcı olur. Sakkaroz çözeltisi ad libitum sağlanır ve tüpler deney boyunca gerektiği gibi yeniden doldurulmalıdır.
  12. Her kafes içindeki ölüm oranını, her deneyin ilk 72 saati için 12 saatlik aralıklarla kaydedin, ardından kaydı 24 saatlik aralıklara kaydırın. Kafes kapısını bir çift forsepsin içeri girip ölü arıları çıkarması için yeterince uzağa kaydırarak gelecekteki sayımların kolaylığını artırmak için ölü arıları kafeslerden çıkarın. Viral çapraz kontaminasyonu önlemek için forsepsleri kafesler arasındaki bir alkol lambası üzerinde sterilize ettiğinizden emin olun.
  13. Viral titre ölçümleri için örnek arılar (5.1-5.2), her kafes içindeki canlı örnekleri gelişigüzel seçerek ve kuru buz üzerinde santrifüj tüplerine yerleştirerek. Tipik olarak, kafesi boşaltmadan herhangi bir zaman noktasında viral titre ölçümleri üretmek için üç arı yeterlidir.
  14. Düzenli mortalite ölçümlerine gerektiği kadar devam edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pupa enjeksiyonu ve viral ekstraksiyon için protokolleri (Şekil 1) başarıyla takip etmek, büyük miktarlarda virüs parçacıkları üretmelidir. Bununla birlikte, çeşitli kolonilerden elde edilen pupaların birden fazla zaman noktasında örneklenmesi ve enjekte edilmesi, düşük kontaminasyonla hedef virüs edinme şansını en üst düzeye çıkarır. Virüslerin bir bal arısı içinde çoğaldıkları ve birbirleriyle etkileşime girdikleri dinamikler iyi anlaşılmamıştır; Önceden var olan enfeksiyon olasılığı ile birleştiğinde, enjekte edilen (istenen) virüsün, pupalar aynı orijinal koloniden örneklenmiş olsa bile, herhangi bir pupada baskın hale geleceğinin garantisi yoktur. Şekil 4 , ekstraksiyondan sonra görmeyi bekleyebileceği potansiyel viral oran aralığını göstermektedir. Görüntülenen dört koloni, her pupa'nın başlangıçta ~% 95'lik bir İsrail akut felç virüsü (IAPV) inokulumu ile enjekte edildiği daha büyük bir virüs toplama çabasının bir alt kümesini temsil etmektedir. Bu ekstraksiyonlarda yer alan 16 koloni örneğinden 10'u, bir miktar >% 99 (örneğin, Koloni 1) dahil olmak üzere oldukça saf IAPV (>% 95) içermesine rağmen, diğer örnekler IAPV oranlarında (örneğin, Koloni 2-3) değişmekle birlikte, bazıları deforme olmuş kanat virüsü (DWV) (örneğin, Koloni 4) gibi diğer virüsler tarafından domine edilmiştir.

Tablo 1 , Şekil 4'te RT-qPCR eşik döngüsü (Ct) değerleri (bir PCR hedefinin tespit eşiğine ulaştığı nokta) ve 100 ng RNA başına toplam virüs genom eşdeğerleri (ge) şeklinde gösterilen dört virüsün (BQCV, DWV, IAPV, SBV) amplifikasyon seviyesi için ek bağlam sağlamaktadır. Ct değerleri oranın bir tahmincisi olarak kullanılabilir, ancak ge değerlerinin standart eğri tabanlı bir yöntem17 kullanılarak hesaplanması gerekir. Üretilen gerçek partikül miktarının (yani, ge), işlenen pupa sayısına ve ekstraksiyon işlemi sırasındaki filtreleme sıkılığına bağlı olduğuna dikkat edin.

Virüs parçacık preparatları (güçlendirilmiş inokülum) -80 ° C'de saklanmalıdır ve çoklu donma-çözülme döngülerine maruz kalırlarsa önemli ölçüde bozulacakları için alikotasyonları önerilir18. Ek olarak, doz-yanıt testleri her zaman deneyden önce yapılmalıdır, çünkü çok sayıda dış faktör (kovan genetiği, arı sağlığı, vb.) oldukça değişken viral yanıta yol açabilir. Deneysel kafeslerden elde edilen verileri kullanarak (Şekil 3), Şekil 5 , iki farklı yıl boyunca aynı IAPV parçacıklarıyla beslenen bal arılarının doz-yanıt hayatta kalma eğrilerini karşılaştırarak bu değişkenliği göstermektedir. Aynı viral inokül ve% 1 ila% 0.01 IAPV arasında değişen test konsantrasyonları da dahil olmak üzere aynı test parametrelerine rağmen, 2018 (Şekil 5A) ve 2019'da (Şekil 5B) yapılan çalışmalar, sakkaroz inokülumunda virüs almayan kontrol tedavisi dışındaki tüm çalışmalarda belirgin şekilde farklı sağkalım yanıtları üretmiştir. İstenirse, daha kesin mortalite ölçümleri elde etmek için LD50 hesaplamalarının da bu noktada yapılabileceğini unutmayın43, ancak yaklaşımlar genellikle yeterli olduğu için bu genellikle gerekli değildir. 2018 yılında,% 1'lik bir doz, enfeksiyondan 72 saat sonra (hpi) yaklaşık% 50 sağkalım ile sonuçlandı ve böylece o yıl yapılan çoğu viral kafes deneyi için varsayılan konsantrasyon haline geldi. Bununla birlikte, aynı doz 2019'da aynı zaman diliminde toplam mortaliteye yakın bir seviyeye ulaştı ve sonuç olarak, o yıl yapılan çoğu viral kafes deneyi bunun yerine% 0.01'lik bir IAPV inokulumu aldı. Bu önemli ölçüde düşük konsantrasyon, 2018 yılında% 1'lik bir IAPV inokulumu ile aynı mortalite seviyelerine ulaşırken, aynı zamanda 100 kat daha az virüs parçacığı kullandı.

Bu veriler, Şekil 3'te diyagramı çizilene benzer kafesler kullanılarak biyotahlillerle üretilmiştir. Üst ve yandaki besleyici delikleri kolay diyet kontrolü sağlar ve sürgülü kafes kapısı, kafes ortamına inokülum tepsileri veya ölü arılar gibi nesnelerin eklenmesini veya çıkarılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, genelleştirilmiş viral tahlil protokolü bu tür kafesler veya diyet seçenekleri ile sınırlı değildir ve deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde değiştirilmelidir.

Figure 1
Şekil 1: Larva kendi kendini çıkarma protokolü sırasında çeşitli aşamaların temsili görüntüleri. (A) Bir gecede kendiliğinden çıkarma periyodundan sonra beklenen örnek larva kütlesi (1.6). (B) Ayrı enjeksiyon/büyüme tepsileri üzerinde birbirinden ayrı aralıklı larvalar (1.6.3) (C,D) Viral enjeksiyona hazır beyaz göz pupaları (1.9). Kahverengi lekeler, çıkarılması gerekmeyen kurutulmuş larva frass'tır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hipodermik bir iğnenin çoklu dağıtıcı bir uçla birleştirilmesiyle oluşturulan örnek enjektör aparatı. İğne ve uç, tekrarlanan bir pipetleyiciye tutturulduğunda sürekli olarak 1 μL sıvı enjeksiyonu sağlamak için sıvı yapıştırıcı kullanılarak birleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Virüs biyotahlilinde kullanılan örnek kafes. Sakkaroz çözeltisi ve polen, deneme süresince besleyici delikler olsa da ad libitum sağlandı. Virüs inokulası, kafesin altından yerleştirilen bir tepsi kullanılarak kolayca verilebilir. Kafes tipinin ve besleyici içeriğinin, deneysel parametrelere uyacak şekilde gerektiği gibi ayarlanabileceğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Dört örnek koloniden viral preparatlar boyunca ortalama toplam virüs yükleri ve oranları. Virüs yükleri RT-qPCR ile 100 ng RNA'da siyah kraliçe hücre virüsü (BQCV) + deforme kanat virüsü (DWV) + İsrail akut felç virüsü (IAPV) + sakkuluçka virüsü (SBV) genom eşdeğerleri (ge) olarak ölçüldü. Her örnek koloni, başlangıçta IAPV ile enjekte edilen 150'den fazla homojenize pupadan oluşuyordu ve pupa virüsü enjeksiyon protokolünden üretilen tipik virüs oranları aralığını temsil ediyordu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bal arısı biyotahlil kafeslerinin doz-yanıt sağkalım eğrileri. Hem 2018 (A) hem de 2019 (B) kafesleri IAPV ile aşılandı ve deneme süresi boyunca% 30 sakkaroz çözeltisi ad libitum ile beslendi. Tedaviler, %30 sakkaroz çözeltisinde karıştırılmış %1 ila %0,1 IAPV partikül preparatlarını ifade eden 10-2 ila 10-4 ile IAPV inoküla konsantrasyonlarını temsil eder; kontrol sakkaroz aşıları virüs içermiyordu. n = 2018'de toplam 56 kafes; n = 2019 yılında toplam 77 kafes. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Dört örnek koloniden dört viral preparatta virüs karışımlarının 100 ng RNA'sı başına ortalama eşik döngü (Ct) değerleri ve genom eşdeğerleri. Her örnek koloni, pupa virüsü enjeksiyon protokolünden üretilen 150'den fazla homojenize pupadan oluşur. Virüsler, RT-qPCR tarafından her virüs için belirli primerler kullanılarak tespit edildi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, larva toplama ve virüs yayılımı, ekstraksiyonu ve konsantrasyonunun yanı sıra kafes besleme deneyleri şeklinde viral tedavi de dahil olmak üzere virüs amplifikasyonu ve inokülum stok hazırlama sürecinin her adımını detaylandıran yöntemleri özetledik. Bu yöntemler, etkinliği yetişkinler için ölümcül olan virüsler için doz-yanıt mortalite testi ile tutarlı bir şekilde ölçülebilen yarı saf virüs parçacıklarının üretilmesine izin verir (Şekil 5). Enfektif yetenek ve / veya patolojinin doğrulanmasını takiben, üretilen parçacıklar daha sonra bal arıları ve bal arısı virüsleri arasındaki etkileşimleri aydınlatmak için biyotahlillerde kullanılabilir.

Açıklanan protokollerin en belirgin faydalarından biri, her birinin, pupaların toplanması, üretilen parçacıklar veya biyotahliller yapılıp yapılmadığına bakılmaksızın, büyük bir hacme kolayca ölçeklendirilmesidir. Pupa eksizyon yöntemleri33'ü kullanarak, saatte ~ 100 pupa çıkarılması beklenebilir, ancak bu sayı yeterlilik ile ölçeklendirilecektir. Bununla birlikte, burada bildirilen larva kendi kendini çıkarma yöntemi, farklı planlama ve zamanlama prosedürleri gerektirmekle birlikte, nispeten az manuel çaba ve arılar üzerinde daha az mekanik zorlama içeren, bir gecede çıkarılan arı sayısının 10-20 katını kolayca üretebilir.

Bu yöntemin ana sınırlaması, kendiliğinden çıkarılan larvaların daha önce Varroa istilasına uğramadığını garanti etmenin bir yolu olmamasıdır. Düzenli akar tedavisi ve kaynak kovanların izlenmesi bu riski en aza indirebilir, ancak bazı larvalar hala bir miktar Varroa parazitlenmesine sahip olabilir. Bununla birlikte, pupaların tek tek manuel olarak çıkarılması, kullanıcının belirli bir pupanın hücresinde herhangi bir akar olup olmadığını gözlemlemesini sağlar. Ek olarak, kendi kendini çıkarma işlemi larvaların yiyecek arama davranışına dayandığından, bu larvaları içeren çerçeveler normalde meydana gelen son beslenmeden önce çıkarılmalıdır. Sadece işçiler tarafından sağlanan bu eksiklik nedeniyle larvalar hücrelerinden sürünürler. Bu nedenle, bu yöntemden türetilen pupalar, tamamen bir koloni içinde gelişen ve biraz daha küçük görünebilen larvalara kıyasla çok kısa bir beslenme stresi penceresi yaşar. Bu, özellikle çerçevede bulunan kohorttaki en genç larvalarda dikkat çekicidir; Kraliçe 24 saatlik bir pencereye yumurta bıraktığı için, bu larvalar orantılı olarak daha fazla beslenme süresi eksiktir. Bunlar genellikle pupa sırasında, manuel eksizyon ile çıkarılanlara kıyasla çok küçük boyutları nedeniyle açıkça dikkat çekicidir. Bununla birlikte, kendi kendine çıkarılarak üretilen larvaların hacmi, azalan bireysel biyokütlelerini telafi etmekten daha fazladır. Ayrıca, manuel eksizyon yöntemi, hücrelerinden çekilirken pupalarda önemli mekanik strese neden olabilir. Her iki yöntem de sadece virüs parçacıkları üretmek için değil, bir deneyin parçası olarak kullanılacaksa, uygun kontrolleri sağlamak için özen gösterilmelidir.

Ekstraksiyon yönteminden bağımsız olarak, virüs yayılma protokolü, pupaları kullanarak büyük miktarlarda virüs partikülü üretebilir, bu da bal arısı viral yanıtını test ederken şu anda uygulanan diğer virüs aşılama yöntemlerinin neden olduğu değişkenliği en aza indirir35,36,37. Bu protokolün, Picornavirales (örneğin, İsrail akut felç virüsü, deforme olmuş kanat virüsü) sırasına göre zarfsız virüsler kullanılarak optimize edildiğini ve test edildiğini belirtmek önemlidir. Zarflı virüslerle çalışırken viral parçacıkları izole etmek için farklı stratejiler izlenmelidir44. Kabaca bir yaklaşım olarak, virüs toplama çabasında yer alan 16 numunenin her biri (Şekil 4'ün 4 kolonisini içeren) 200-300 enjekte edilen pupadan üretildi ve 2-2.5 mL arasında konsantre virüs parçacık preparatları verdi. % 0.1'lik bir virüs inokulum konsantrasyonu ve standart bir 35-arı kafesi varsayarak, 16 virüs preparatının her biri 3.300-4.200 kafes için yeterli parçacık sağlayacaktır. Enfektif materyalin bu fazlalığı deneysel kısıtlamaları azaltır ve yüksek verimli biyotahliller sağlar. Virüs parçacık konsantresinin -80 ° C'de depolandığında aylarca veya yıllarca canlı kalabilmesine rağmen, birkaç donma-çözülme döngüsüne maruz kalsa bile, bulaşıcılıkta yavaşça azalabileceğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, viral preparat stoğunun küçük alikotlarda saklanması tavsiye edilir, bunlardan bazıları daha sonra viral titreleri ölçmek ve deney sırasında tedavi dozunu doğrulamak için kullanılabilir. Ek olarak, Şekil 5'te gösterilen yıllar arası değişkenlik, periyodik doz-yanıt testine olan ihtiyacı daha da güçlendirmekte ve böylece virüs canlılığında beklenmedik kayıp olasılığını en aza indirmektedir.

Kafes biyotahlillerinin kendilerinin de sınırlamaları veya en azından dikkate alınması gereken uyarıları vardır, birincisi kafes biyotahlil ortamının yapay doğasıdır (Şekil 3). Arıları muhafazalar halinde gruplandırmak, bireysel seviyenin ötesinde viral testlere izin verir; kafes, arının kendisinden ziyade deney ünitesi haline gelir. Bu, gerçek bir koloniye, tek bir arının izole edilmiş olarak tedavi edilmesinden daha çok benzese de, yine de gerçekçi bir kovan ortamından uzaktır. Kraliçe ve yavru feromonlar, farklı yaşlardaki arılar ve diğer ipuçları da dahil olmak üzere sosyal çevreden uzaklaştırılan bu arılar, tam boyutlu bir koloninin yapabileceği gibi tepki vermeyebilir. Bununla birlikte, bunlar öncelikle kafes sistemini kullanan daha büyük ölçekli deneyler için dikkat edilmesi gereken hususlardır. Kafes viral biyotahlillerinden toplanan sonuçlar, öncelikle, kullanıcı tarafından istenildiği gibi daha gerçekçi bir ortama ölçeklendirilmiş gelecekteki virüs testi kararlarını bilgilendirmek için kullanılabilecek temel bilgi kuruluşu olarak ele alınmalıdır.

Burada açıklanan yöntemler, bal arısı viral tahlillerinde kullanılmak üzere virüs parçacıklarının seri üretimi için standartlaştırılmış bir süreç sağlar. Bu tür tahliller, çoklu virüs enfeksiyonu ve diyet kalitesinin ve besin takviyelerinin viral enfeksiyon karşısında hayatta kalmayı nasıl etkilediği de dahil olmak üzere bal arısı-virüs etkileşimlerinin çeşitli yönlerini incelemek için zaten uygulanmıştır 11,18,45,46. Koloni çapında enfeksiyon deneylerinde kullanılmak üzereölçeklendirilmişlerdir 11,47 ve enfeksiyonun davranış 47 ve gen ekspresyonu48 üzerindeki etkilerini incelemek için. Genel olarak, bu yöntemler bal arısı virüsü inokülasını üretmek ve değerlendirmek için kullanılabilecek araçlarda bir temel sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Protokol oluşturma sürecindeki fikirleri ve tartışmaları için Dr. Julia Fine'a ve düzenleme boyunca yararlı yorumları için Dr. Cassondra Vernier'e teşekkür ederiz. Bu materyaller, kısmen Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı tarafından hibe kimliği 549025 kapsamında desteklenen projelere katkıda bulunmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 162 bal arısı Apis mellifera arı virüsü oral enfeksiyon kafes biyotahlili viral partikül ekstraksiyonu
Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter