Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

Abstract

לדבורי הדבש יש חשיבות אקולוגית וחקלאית רבה ברחבי העולם, אך הן גם נתונות למגוון לחצים המשפיעים לרעה על בריאות הדבורים, כולל חשיפה לפתוגנים נגיפיים. וירוסים כאלה יכולים לגרום למגוון רחב של השפעות הרסניות ולעתים קרובות יכולים להיות מאתגרים למחקר בשל גורמים רבים המקשים על הפרדת ההשפעות של טיפולים ניסיוניים מזיהום רקע קיים מראש. כאן אנו מציגים שיטה לייצור המוני של כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים יחד עם בדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. כתוצאה מהיעדר הנוכחי של קו תאי דבורת דבש רציפים ונטולי וירוסים, חלקיקים נגיפיים מוגברים in vivo באמצעות גולמי דבורת דבש, המופקים מהכוורת בכמויות גדולות באמצעות מתודולוגיה מלחיצה מינימלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלקיקי הנגיף האלה בבדיקות ביולוגיות של כלובי דבורי דבש כדי לבחון את כדאיות האינוקולה, כמו גם בדינמיקות שונות אחרות של זיהום בנגיף, כולל אינטראקציות עם תזונה, חומרי הדברה ופתוגנים אחרים. יתרון מרכזי של שימוש בחלקיקים כאלה הוא שהוא מקטין מאוד את הסיכויים להחדרת משתנים לא ידועים בניסויים הבאים בהשוואה לחלופות הנוכחיות, כגון זיהום באמצעות המולימפה של דבורים נגועות או הומוגנט, אם כי עדיין יש לנקוט משנה זהירות בעת מיקור הדבורים, כדי למזער את זיהום נגיף הרקע. מבחני הכלובים אינם תחליף לניסויים רחבי היקף ומציאותיים בשטח הבודקים את השפעות ההדבקה בנגיף ברמת המושבה, אלא מתפקדים כשיטה ליצירת תגובות נגיפיות בסיסיות, שבשילוב עם חלקיקי הנגיף הטהורים למחצה, יכולות לשמש ככלים חשובים לבחינת ממדים שונים של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

Introduction

דבורי הדבש (Apis mellifera) ממלאות תפקיד קריטי בנוף החקלאי העולמי המודרני, אך כיום הן סובלות משילוב של גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים, כולל חשיפה לחומרי הדברה, מספוא לקוי, טפילים ופתוגנים 1,2. אחד הפתוגנים החשובים ביותר לדאגה הם וירוסים, שרבים מהם מווסתים על ידי עוד אחד מגורמי העקה העיקריים של דבורת הדבש, קרדית Varroa הטפילית (Varroa destructor). נגיפים אלה יכולים לגרום למגוון של השפעות שליליות בדבורי הדבש, כולל ירידה בהישרדות גזעית, פגמים התפתחותיים ושיתוק שיכולים להוביל לקריסת כוורת מוחלטת הן לפני תקופות החורף והן לאחריהן 3,4,5. למרות שחלה התקדמות מבטיחה בפיתוח טכנולוגיות המשמשות למאבק בהדבקה בנגיף 6,7,8,9, הדינמיקה שבה וירוסים רבים מתפשטים, מתפשטים ומתקשרים בתוך דבורת דבש או מושבה עדיין לא מובנת היטב 5,10 . הבנת הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין דבורי דבש ונגיפים והקשרים שלהן עם גורמים סביבתיים אחרים היא קריטית לפיתוח טכניקות יעילות לניהול וירוסים.

עם זאת, חקר האינטראקציות בין דבורי הדבש לנגיף מציב אתגרים עם גורמים ידועים ובלתי ידועים רבים המסבכים את התהליך. אלה כוללים אינטראקציות עם תזונה11,12, חשיפה לחומרי הדברה13 ורקע גנטי לדבורים14,15. גם כאשר מתמקדים בהדבקה בנגיף בלבד, סיבוכים נפוצים משום שלאוכלוסיות דבורי הדבש, המנוהלות והפראיות כאחד, יש תמיד מידה מסוימת של זיהום בנגיף הרקע, אם כי לעתים קרובות מבלי לבטא תסמינים חריפים 16,17, וההשפעות של הדבקה בנגיף אינן מובנות היטב18. זה הפך את המחקר של השפעות וירוס דבורת הדבש קשה להתנתק.

מחקרים רבים על נגיף דבורי הדבש השתמשו בזיהומים נסיבתיים של הנגיף כדי לחפש אינטראקציות עם גורמי עקה אחרים, וראו כיצד זיהומי הרקע משתנים עם טיפולים אחרים 12,19,20,21. בעוד שגישה זו הצליחה לזהות השפעות חשובות, במיוחד לגלות כיצד חומרי הדברה או טיפולים תזונתיים משפיעים על רמות הנגיף ועל שכפולם, חיסון באמצעות טיפול בנגיף של תוכן וריכוז ידועים הוא קריטי לבדיקה ניסיונית של דינמיקת זיהום בנגיף. עם זאת, הפרדת הטיפול הניסיוני מזיהום הרקע עלולה גם היא להציב אתגרים. במחקרי שדה, חוקרים הבחינו בין זנים של נגיף כנף מעוות (DWV) כדי לספק ראיות להעברת הנגיף מדבורי דבש לדבורי בומבוס22, אך שימוש בגישה זו יהיה קשה בקרב דבורי הדבש בלבד. שיבוטים זיהומיים של וירוסים הם כלי רב עוצמה, לא רק למעקב אחר זיהום 23,24,25 אלא למחקרי גנטיקה הפוכה של נגיפי דבורי דבש ולמחקר אינטראקציה בין וירוסים למארח 26,27,28. עם זאת, ברוב המקרים, שיבוטים זיהומיים עדיין נדרשים כדי למלא את מחזור ההדבקה בתוך התאים כדי לייצר חלקיקים. חלקיקים כאלה מועדפים כאנוקולה לטיפולים ניסיוניים מכיוון שהזיהום שלהם גבוה יותר מהרנ"א הנגיפי העירום והחיסון בגנומים עטוף מחקה זיהום טבעי.

גם הייצור של אינוקולה של נגיף דבורת הדבש הטהור והלא מזוהם (זני וירוסים מסוג בר או כאלה שמקורם בשיבוטים זיהומיים) מציב אתגרים. אלה נובעים בעיקר מהקשיים בהשגת קו אמין, המשכפל ברציפות, של תאי דבורת דבש נטולי וירוסים, כדי לייצר נגיפים בעלי זן טהור29,30. בעוד שכמה קווי תאים יוצרו, מערכות אלה נותרו לא מושלמות; ובכל זאת, יש תקווה שניתן יהיה לייצר קו תאים בר קיימא29, שיאפשר שליטה עדינה יותר על ייצור וירוסים וחקירה. עד שקו כזה יהיה זמין באופן נרחב, רוב פרוטוקולי ייצור הנגיף ימשיכו להסתמך על שימוש בייצור וטיהור של וירוסים in vivo 18,31,32,33,34. גישות אלה כוללות זיהוי וטיהור של חלקיקי נגיף בעלי עניין (או ייצור שיבוט מדבק) ושימוש בהם כדי להדביק דבורי דבש, בדרך כלל כגלמים. הגלמים מוזרקים עם נגיף המטרה ולאחר מכן מוקרבים, וחלקיקים נוספים מופקים ומטוהרים. עם זאת, מכיוון שדבורים אינן נקיות מווירוסים מלכתחילה, תמיד יש מידה מסוימת של זיהום מעקבות של וירוסים אחרים בכל תרכיז כזה, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בבחירת דבורים עם סבירות נמוכה לזיהומי רקע. יתר על כן, שיטות להסרת הגלמים מתאי המסרק לשימוש בפרוטוקולים אלה33 הן עתירות עבודה מאוד ויכולות לגרום ללחץ אצל הדבורים, ולהגביל את הייצור באמצעים אלה18,32. כאן אנו מדווחים על שיטה חלופית המאפשרת הסרה בקנה מידה גדול של זחלים עם מעט עבודה ופחות לחץ מכני על הדבורים.

לאחר שהגלמים מתקבלים ומוזרקים להם אינוקולום הנגיף ההתחלתי, יש לדוגר אותם כדי לספק לנגיף זמן להשתכפל. לאחר מכן, ניתן לעבד חלקיקי נגיף המיוצרים לצורה שמישה כדי להדביק דבורים ניסיוניות. ישנן מספר שיטות פשוטות להשיג זאת, כולל שימוש בהומוגנט גולמי35,36 או המולימפה שנוצר מדבורים נגועות בנגיף כמקור לזיהום37. שיטות אלה יעילות, אך יש להן סיכוי גדול יותר להכניס משתנים לא ידועים ממצע הרקע (למשל, גורמים אחרים בהומוגנטים של הדבורים המתות). בנוסף, רצוי לרכז את החלקיקים אם ניסוי דורש מתן מינון גדול וידוע של וירוס בפרק זמן קצר. לכן, לשליטה טובה יותר, עדיף להשתמש בשיטות המאפשרות רמה מסוימת של טיהור וריכוז של חלקיקי הנגיף. באופן כללי, סדרה של צעדי משקעים וצנטריפוגה תביא להסרת כמעט כל החומר האפשרי שאינו קשור לנגיף33.

לאחר הפקת אינוקולום מרוכז זה, כדאי לכמת את הטיטרים הנגיפיים (qPCR) ולאפיין אותו עם bioassays in vivo כדי לבחון את הכדאיות שלו ואת יכולתו לגרום לתמותה, כמו גם כדי לאשש כי titers וירוס מוגבר מתקבלים לאחר ההדבקה. ניתן להשיג זאת באמצעות ניסויי הזרקה (לתוך גלמים או מבוגרים) או ניסויי האכלה (לזחלים או למבוגרים). בעוד שכל הגישות הללו אפשריות, האכלה לקבוצות של דבורים בוגרות בכלוב היא לעתים קרובות המהירה והפשוטה ביותר. שיטת בדיקת הכלובים נמצאת בשימוש נרחב גם לבדיקת טיפולים שונים אחרים בדבורים, כולל רעילות חומרי הדברה38, התפתחות שחלה39 והשפעה תזונתית על התנהגות40,41, ולכן יכולה להוות בסיס טוב לניסויים הקושרים בין זיהום בנגיף לגורמים אחרים42.

כאן אנו מתארים שיטה אמינה לייצור כמויות גדולות של חלקיקי נגיף טהורים למחצה, מועשרים מאוד, ללא שימוש ב-ultracentrifuge יקר, כולל שיטה להסרת גלמים המפחיתה את הלחץ הנגרם והלחץ המכני על הדבורים ובדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. על ידי שליטה הדוקה בטוהר האינוקולה הנגיפית, החוקרים מסוגלים להפחית את השונות בתגובה הנגיפית של דבורת הדבש ביחס לשיטות חיסון ויראליות אחרות. יתר על כן, הבדיקה הביולוגית יכולה לסנן השפעות ויראליות ברמת קבוצות קטנות באמצעות יחידות ניסיוניות הניתנות לחזרה רבה לפני שינוי קנה המידה להגדרות מציאותיות בשטח, וזה הרבה יותר עבודה אינטנסיבית לניהול. בשילוב, שתי השיטות הללו מספקות את הכלים הדרושים למחקרים שיכולים לעזור לשפר את ההבנה הכוללת שלנו של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אפשרות מיצוי דבורים המונית 1: הסרה עצמית של הזחל

  1. כלבו מלכת דבורי דבש על מסגרת לנגסטרות' ריקה ומצוירת והחזירו אותה למושבה שלה. אפשרו למלכה להטיל ביצים על מסגרת זו במשך 24 שעות.
    1. בדקו את המסגרת לאחר 24 שעות כדי לוודא שרוב תאי המסרק מכילים ביצים שהוטלו לאחרונה. בהתאם למלכה ולמושבה, ביצים לפעמים אינן מוטלות היטב ב -24 השעות הראשונות. אם זה קורה, לאפשר 24 שעות נוספות ולהתאים את הזמן לפי הצורך.
  2. לאחר תקופת הטלת הביצים בת 24 השעות, שחררו את המלכה. סמן את המסגרת בבירור והחזיר אותה למושבה.
  3. בדיוק 192 שעות (8 ימים) לאחר כליאה של המלכה (בהנחה של הטלת ביצים רגילה בתוך 24 השעות הראשונות; 8 ימים מסמנים את הנקודה ממש לפני הגור), הסירו את המסגרת המסומנת מהמושבה. הברישו את כל הדבורים הבוגרות והעבירו את המסגרת לחממה התואמת את התנאים הפנימיים של כוורת (34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות יחסית (RH)).
    1. בדקו כדי לוודא שרוב המסגרתמלאה בזחלי אינסטאר 5, אותם ניתן לזהות על ידי גופם הגדול, הלבן, בצורת c, שנלחץ בחוזקה על הקצוות התחתונים של תאי המסרק. סביר להניח שיהיו גם כמה תאים שכבר מכוסים על ידי מכסה שעווה, במיוחד ליד מרכז המסגרת.
  4. הכינו מיכלים התואמים את הגובה והרוחב של המסגרתהמלאה בזחלים כדי לקלוט את הזחלים ה-5 על ידי ניקוי יסודי של המשטחים הפנימיים והחיצוניים במים וסבון, ולאחר מכן בתמיסת אקונומיקה, ולבסוף אתנול. ייבשו היטב את המיכל לפני שתמשיכו.
    1. מרפדים את תחתית המיכלים במספר שכבות של מגבות נייר. לאחר מכן הוסיפו מספר שכבות חופפות של מגבוני ניקוי דקים וסופגים יותר (למשל, מגבי משימה עדינים) או נייר סינון. החומר חייב להיות סופג. הימנעו מחפיפה בשכבה העליונה כדי לשפר את הקלות של העברת זחלים עתידית.
  5. הניחו את המסגרות עם הפנים כלפי מטה (כאשר זחלי המוקד פונים כלפי מטה) על גבי המיכלים, כך שהזחלים יוכלו ליפול על שכבת מגבוני הניקוי.
    1. מכסים את המיכל ומסגרים בפיסת נייר אלומיניום או בכיסוי אחר כדי לשמור על הלחות ולהחזיר את ההתקנה לחממה. השאירו את ההתקנה למשך הלילה. הנטיות הטבעיות לחיפוש מזון של הזחלים יגרמו להם לזחול החוצה מהתאים שלהם וליפול על המשטח המרופד שמתחת.
  6. הכינו מגשי העברה נפרדים על ידי ניקוי יסודי שלהם באמצעות אותם שלבים המפורטים ב-1.4. אפשרו למגשים להתייבש ולשכב את התחתונים עם מגבוני ניקוי. המגשים אינם צריכים להתאים למידות ספציפיות, אך מגשים רדודים יותר יאפשרו מניפולציות זחל קלות יותר.
    1. התחילו להעביר את הזחלים מהמכלים למגשים על ידי הרמה קפדנית של מגבונים בודדים מהשכבה העליונה במיכלים ושפיכה עדינה של הזחלים על המגשים. הזחלים היו אמורים ליפול לתוך המכלים בן לילה, וליצור כמה מסות דביקות (איור 1A).
    2. השתמשו במלקחיים רכים קהים כדי להפריד את הזחלים ולהניח אותם על פני המגשים. הם לא צריכים להיות מרווחים באופן שווה ויכולים להיות קרובים זה לזה אבל לא צריכים להיות נוגעים. ראו איור 1B לתיאור חזותי של זחלים מופרדים.
    3. נצלו את ההזדמנות הזו כדי להסיר זחלים פגומים (דהויים) או בגודל נמוך מהממוצע. אלה נוטים יותר למות במהלך תהליך ההבשלה ויכולים להביא לזיהומים / צמיחה פטרייתית לאורך המגש.
  7. מכסים את המגש בנייר אלומיניום עם אוהלים כדי לשמור על הלחות ולהחזיר את ההתקנה לחממה.
  8. בדקו את הזחלים מדי יום והסירו את כל הזחלים דהויים (חום כהה או שחור).
    הערה: הזחלים/טרום הגלמים יעשו את צרכיהם על מגבוני הניקוי, ויתבטאו ככתמים חומים קטנים. הם עשויים גם לייצר כמויות קטנות של וובים לבנים וחכמים כחלק מתהליך ההדבקה שלהם. אף אחד מהאירועים הללו אינו מחייב החלפת מגבוני הניקוי, כל עוד הם סופגים.
  9. אפשרו לזחלים לגדל ולהבשיל לשלב העין הלבנה, שניתן לזהות על ידי צורתם הכללית התואמת את זו של הדבורה הבוגרת ועדיין חסרה פיגמנטציה בעיניהם וברוב שאר גופם. זה אמור להתרחש בין 14 ל -15 יום לאחר כלוב המלכה. הגלמים מוכנים כעת להזרקת וירוסים. איור 1C, 1D לדוגמאות של גלמים בעלי עיניים לבנות.

2. אפשרות מיצוי דבורים המונית 2: כריתה ידנית של פופאל

הערה: למרות שאופציה 2 (כריתת פופאל) היא שיטה בת קיימא של מיצוי דבורים, היא כוללת גם מספר חסרונות בהשוואה לאפשרות 1 (הסרה עצמית של הזחל). אפשרות 2 היא הרבה יותר אינטנסיבית בעבודה, קשה יותר לשליטה לגיל הפוריות, ובאופן כללי מלחיצה יותר על הדבורים עצמן. אפשרות 1 מומלצת במידת האפשר.

  1. בחרו מסגרת של גוש דבורי דבש מכוסה המכיל גלמים בשלב העין הלבנה או בסמוך לו (ראו 1.9 לתיאור) ממושבה מתאימה. הסר את המכסה מתאי המסרק הממוקמים בסמוך למרכז ולקצוות של המסגרת כדי לאשר את נוכחותו של השלב ההתפתחותי המתאים.
  2. מעבירים את המסגרת לחממה שנקבעה על 34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות יחסית. תמיד להחזיר את המסגרת לחממה כאשר לא בשימוש מיידי.
  3. הכינו ונקו מגשי העברה זהים לאלה המתוארים ב-1.6.
  4. הסר את המסגרת מהאינקובטור והצב על מעמד זוויתי מתחת למקור אור. להרטיב ערימה קטנה של מגבות נייר עם מים.
  5. נקו זוג מלקחיים קשיחים קהים באמצעות אתנול. באמצעות המלקחיים הנקיים, יש להסיר את המכסה מהתאים המכילים גלמים בעלי עיניים לבנות, תוך הקפדה שלא לפגוע בגולם בתהליך.
  6. בזה אחר זה, מוציאים בעדינות את הגלמים מתאי המסרק. הכי בטוח לתפוס את הגלמים סביב בית החזה והבטן באמצעות קצות המלקחיים, אם יש מספיק מקום. אם לא, עם זאת, ניתן גם להסיר את הגלמים על ידי אחיזת הראש וניעור איטי שלו מספיק רחוק כדי להיאחז סביב הגוף.
    1. מכסים את חלקי המסגרת שלא ניגשים אליהם באופן מיידי במגבות נייר רטובות כדי לשמור על הלחות. הסר והחלף לפי הצורך במהלך תהליך הכריתה.
  7. פרשו את הגלמים שנכרתו לאורך מגבוני הניקוי במגשי ההעברה, וודאו שאף אחד מהם לא נוגע. יש להשליך כל גלמים מעוותים או דהויים. גלמים מוכנים כעת להזרקת וירוסים.
    1. השליכו גלמים המשחררים נוזל במגע עם המגבונים; סביר להניח שהם נוקבו. לפעמים, הגלמים יפגינו כתמים כהים קטנים של מלניזציה ליד נקודות המגע עם המלקחיים תוך שעה אחת עם ההסרה. זה לא אמור להשפיע על ההישרדות. אם מופיעים כתמים גדולים של מלניזציה, יש להשליך את הגלמים המושפעים.

3. הזרקת וירוס פופאל

הערה: אם מבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה (כלומר, ללא מלאי אינוקולה נגיפי קודם), תחילה לחלץ ולרכז חלקיקים באמצעות מבוגרים, גלמים או זחלים ממושבה עם חשד לזיהום. מדוד את הטיטרים הנגיפיים באינוקולה המתקבלת כמתואר בשלב 5 וקבע אילו חלקיקים להתפשט הלאה.

  1. לעקר את כל משטחי העבודה באמצעות מי אקונומיקה ואתנול לפני שתתחיל לעבוד עם נגיפי דבורי הדבש. יש ללבוש כפפות ניטריל במהלך כל התהליך.
  2. הכינו מנגנון מזרק המסוגל להזריק נוזל בכמויות של כ-1 μL.
    הערה: גישה זולה אך יעילה אחת תהיה ליצור מכשיר בעבודת יד על ידי הצמדת מחט היפודרמית של 30 גרם לקצה של קצה רב-מתקן של 100 μL (ראה טבלת חומרים) באמצעות אפוקסי גמיש או דבק נוזלי אחר. יש לוודא כי קצוות מכסה המחט אטומים בחוזקה כנגד קצה המתקן הרב-תכליתי ותנו למנגנון להתייבש. ראו איור 2 לתיאור חזותי של מנגנון מזרק לדוגמה.
  3. הכן תמיסת דילול הזרקת וירוסים על ידי ערבוב הסוג הרצוי של חלקיקי הנגיף עם PBS מעוקר 1x (מלוחים עם חיץ פוספט) בצינור צנטריפוגה חרוטית של 15 מ"ל. הכמות הכוללת הדרושה תהיה תלויה במספר הגלמים שיש להזריק, כאשר כל גולם ידרוש הזרקה של 1 μL (למשל, 500 גלמים = 5 חלקיקי נגיף μL + 495 μL PBS).
  4. חברו את מנגנון המזרק למולטי-פיפטה ידנית ובדקו את היעילות על ידי ציור של 100 מיקרול' מים מכוס נפרדת וחלוקתו במינונים של 1 μL. יש לוודא שכל כמות שמחלקים שווה, והחליפו את מנגנון המזרקים לפי הצורך. נקו את כל המים שנותרו מהמזרק.
  5. אחזור מגשי הגלמים שנוצרו בשלב 1 או שלב 2 מהאינקובטור והסירו את כיסוי רדיד האלומיניום.
  6. נקו זוג מלקחיים קשיחים קהים באמצעות אתנול. תפסו בעדינות את הגלמים הבודדים לאורך בית החזה, והפעילו מספיק לחץ כדי לכפות נוזלים פנימיים על הבטן. זה אמור להפוך את החלוקה הטרגית לבולטת יותר.
  7. ציירו 100 μL של תמיסת חלקיקי הנגיף באמצעות המולטי פיפטה, החדירו את המחט בין תמיסת הבטן השלישית והרביעית, והזיקו 1 μL של תמיסת הנגיף. חזרו על הפעולה עבור כל גלם המונח על המגשים, תוך הקפדה על הימנעות מזריקות חוזרות. יש להשליך כל גלמים שניזוקו במהלך התהליך.
    אזהרה: כל החומרים הקשורים להכנת וירוסים מוגדרים כביו-האזרדים ויש להיפטר מהם באופן אוטומטי ולהיפטר מהם בהתאם להנחיות המוסדיות. כמו כן, יש להיפטר מהמחטים בהתאם להנחיות המוסדיות.
  8. מכסים את מגשי הגלמים המוזרקים בנייר אלומיניום וחוזרים לחממה. אפשרו לחלקיקי הנגיף להתפשט בתוך הגלמים במשך 3-5 ימים.
    1. בצע בדיקות יומיות על הגלמים והסר את כל הדגימות המתות או הנרקבות כדי למנוע הצטברות חיידקים או פטריות. נקודות קטנות של מלניזציה עשויות להופיע באתר ההזרקה על הבטן אך אינן אמורות להשפיע על ההישרדות.
  9. דגימת הגלמים לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מ"ל ומערבולת כדי להפוך את התוכן להומוגניזציה של התכולה, תוך הקפדה על דגימת גלמים לצינורות לפי מקור מושבה כדי להפחית את הזיהום מווירוסים שאינם מטרה. ודא שלא נשארו גלמים שלמים והעביר את הצינורות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים למשקעים וריכוז חלקיקי הנגיף.

4. ריכוז חלקיקי הנגיף

הערה: פרוטוקול זה לא נבדק לשחזור וירוסים עטופים.

  1. יש לאחסן באופן אוטומטי את כל החומרים והמיכלים לפני השימוש. יש ללבוש כפפות ניטריל, מעילי מעבדה והגנה על העיניים במהלך כל התהליך הזה. עיקרו את כל משטחי העבודה באמצעות מי אקונומיקה, אתנול ותמיסת ההשבתה RNase לפני שתתחילם.
    1. הכן 1x TES (Tris-EDTA-מלח) חיץ: יש לערבב 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA ו- 150 mM NaCl. לעקר על ידי אוטוקלאב.
  2. להפשיר גלמים הומוגניים ולהעביר לבקבוקי צנטריפוגה. הוסיפו כשלושה כרכים של 1x PBS (למשל, הוסיפו צינור מלא של 50 מ"ל של גלמים ל-150 מ"ל של 1x PBS) והשוו את הנפחים לזה של הבקבוק המלא ביותר.
  3. יש לערבב תחילה ביד ולאחר מכן על ידי הנחתו על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  4. צנטריפוגה ב 15,000 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת סלולרית. חזור על שלב זה לפי הצורך אם נותרה פסולת תאית.
    1. אם לסופרנאטנט יש כדוריות גדולות של שומן שצפות על פני השטח, יש לסנן מבעד לבגדי גבינה לתוך בקבוקי צנטריפוגה סטריליים נפרדים לפני שתמשיכו.
  5. הוציאו את הסופרנאטל עם 0.3 כרכים של 24:1 כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (למשל, 190 מ"ל של סופרנאטנט + 57 מ"ל של כלורופורם:איזואמיל אלכוהול) וערבבו על ידי היפוך. צנטריפוגה ב 21,000 x g ב 4 ° C במשך 20 דקות.
    אזהרה: הימנע ממגע ישיר עם כלורופורם על העור או העיניים. ללבוש תמיד PPE מתאים. יש להיפטר מכל פסולת הכלורופורם בהתאם להנחיות המוסדיות.
  6. שחזרו את השלב המיימי מכל בקבוק על ידי פירוק הסופרנאטנט לכוסות סטריליות נפרדות של 500 מ"ל באמבטיית קרח או בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס. הקפידו להימנע מזיהום ה-supernatant עם כלורופורם מכיוון שהוא יקשה על תהליך הטיהור; עדיף לאבד קצת שלב מימי.
  7. הוסיפו מים ללא RNase כדי להביא כל לנפח של 200 מ"ל. מניחים את הכוסות על לוחות ערבוב מגנטיים ומשחררים פנימה מוט ערבוב בגודל בינוני. הגדר את הצלחות לבחוש במיקום בינוני-נמוך.
  8. הוסיפו באיטיות את NaCl לכל תחת ערבוב עדין מתמיד, מה שמעלה כל אחת מהן לריכוז סופי של 2.3% (למשל, 4.6 גרם NaCl לכל 200 מ"ל של סופרנטנט). הוסיפו פוליאתילן גליקול 8000 (PEG) לכל עד לריכוז סופי של 7% (לדוגמה, 14 גרם PEG לכל 200 מ"ל של הסופרנטנט).
  9. כסו את הכוסות בנייר אלומיניום והמשיכו לבחוש במהירות בינונית-נמוכה על קרח או בחדר קר במשך 1-5 שעות כדי להמיס את ה-PEG. ככל שיוקדש יותר זמן לביטוש, כך ה-PEG יתמוסס בצורה יסודית יותר.
  10. כבו את צלחות הערבוב. דגירו את הכוסות המכוסות במשך 1-3 ימים על קרח או בחדר קר כדי לאפשר לחלקיקי הנגיף והחלבונים לזרז. ככל שמבלים יותר זמן בדגירה, כך יש יותר חלקיקים שיזרזו.
  11. העבר את התכולה של כל לבקבוקי צנטריפוגה נקיים נפרדים וצנטריפוגה ב- 15,000 x g ב- 4 ° C למשך 30 דקות כדי לשחזר גלולת חלקיק PEG. השליכו את הסופרנאטנט.
  12. שפשפו בזהירות את כדור ה-PEG-חלקיקים מצידי הבקבוק והחזירו אותם לנפחים מינימליים של חיץ TES 1x בתוך כוסות נקיות על ידי הוספה איטית של כמויות קטנות של TES לכדורים (כ-10 מ"ל לכל 100 דבורים מקוריות).
  13. מעבירים את הכדור התלוי דרך מחט של 18 גרם לפחות עשר פעמים לפני שהם עוברים לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל. שמור את כל הצינורות על קרח עד שהם מוכנים ל-4.14.
  14. צנטריפוגה 2 מ"ל צינורות ב 13,000 x g ב 4 °C במשך 15 דקות כדי להסיר PEG נוסף. העבר את הסופרנטנט לתוך צינור צנטריפוגה אחר של 2 מ"ל באמצעות פיפטה של 1,000 μL וחזור על שלב הצנטריפוגה כדי להבטיח הסרה מלאה של כל PEG.
  15. רכזו את החלקיקים הנותרים בתוך הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה חדשים באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות (ניתוק של 100 kDa) באמצעות מספר סבבים של צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 x g בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 דקות כל אחת עד שתגיעו לכ-10 חמישית מהריכוז המקורי (10 מ"ל של תמיסת חלקיקים-TES לכ-2 מ"ל של חלקיקים מרוכזים). יחידות הסינון מגיעות בגדלים שונים; בחר את המתאים ביותר למספר הדגימות המעובדות. היחידות שמתאימות לצינורות חרוטיים בגודל 15 מ"ל הן בדרך כלל המתאימות ביותר.
  16. בצעו החייאה של החלקיקים המרוכזים על ידי מעבר דרך מחט היפודרמית של 26 גרם וצנטריפוגה ב-14,000 x גרם ב-RT למשך 5 דקות לסיבוב אחרון אחד של הסרת PEG. אם הנוזל עדיין מעונן, יש לחזור על הפעולה עד להסרת כל משקעי PEG.
  17. Aliquot את supernatant צמיג לתוך כמויות הרצויות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.

5. מיצוי וכימות RNA של הנגיף

  1. חילוץ RNA מדבורים שלמות או מחלקיקי נגיף מרוכזים בכל שיטת מיצוי RNA מתאימה (לדוגמה, מגיב מיצוי RNA TRIzol ולאחר מכן טיפול ב-DNase).
  2. כימות טיטרים של וירוסים באינוקולום שנוצר בשלב 5.1 באמצעות RT-qPCR, רצוי באמצעות שיטה מבוססת עקומה סטנדרטית שאינה מסתמכת על ביטוי גניםמארחים 18, אם כי שיטות אחרות עשויות גם לאפשר הערכות.

6. בדיקה ביולוגית של האכלה ויראלית

  1. הכן את כל החומרים הדרושים לבדיקה הביולוגית לפני שלב איסוף המסגרות (6.2) או במהלך תקופת הופעת הדבורים של 24 שעות (6.3).
    1. הכינו כלובים נקיים או מארזים אחרים המסוגלים להכיל את מספר הדבורים הדרושות לבדיקה הביולוגית (לדוגמה, כלובי קופסאות אקריליים בגודל 10.16 ס"מ x 10.16 ס"מ x 7.62 ס"מ) על ידי חיבור כל חורי ההזנה עם צינור צנטריפוגה בגודל מתאים (איור 3). קבעו וקבעו באופן אקראי את הטיפולים בין הכלובים ותייגו כל אחד מהם בטיפול הייעודי שלהם לעיון קל בעתיד.
    2. הכינו מגשי אינוקולום על ידי תיוג סירות משקל בודדות בגודל בינוני עם הכלוב והטיפול המתאימים להן.
    3. הכינו תמיסת האכלה על ידי ערבוב הכמות המתאימה של סוכרוז עם מים שעברו דה-יוניזציה (למשל, 300 גרם סוכרוז לכל 1 ליטר מים עבור תמיסת סוכרוז של 30%), והקפידו לעקר את המים לפני ואחרי הוספת סוכרוז. תמיסת סוכרוז סטרילית יכולה להיות מאוחסנת במקרר של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות, אך יש להשליך אותה אם מופיעה עננות כלשהי.
    4. מכינים צינורות הזנה על ידי מילוי חלקי של צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל בתמיסות הזנה המיוצרות ב-6.1.3, הופכים אותם, ומנקבים 1-2 חורים סביב קצה הצינור עם אגודל. חורים יכולים גם להיות מומסים באמצעות מחט היפודרמית 18G המחוממת מעל להבה. וודאו שמכסי צינורות ההזנה מוברגים בחוזקה רבה, שכן כובעים רופפים עלולים לגרום לדליפות איטיות שיטביעו את יושבי הכלובים בן לילה.
      הערה: ניתן להתאים את תמיסות ההזנה ואת נפח צינורות ההזנה לפי הצורך כך שיתאימו לצרכים ניסיוניים.
    5. הכינו קולקציה פתוחה לדבורים שזה עתה הופיעו על ידי ציפוי קל של קצוות של גיגית גדולה בשמן צמחי או בחומר שמנוני דומה. בנפרד, להכין כמה כוסות קטנות באותה שיטת ציפוי.
  2. בחר והסר מסגרות של דבורת דבש על סף ההסתרה שמקורן בלפחות שלוש כוורות נפרדות. דבורים מזדקנות כראוי דומות למבוגרים בעלי פיגמנט מלא מתחת לכיסוי תאי המסרק. סימן בטוח להופעתו המתמשכת הוא התבוננות בתושבי התאים הלועסים באיטיות את דרכם החוצה ו/או תאים שהתרוקנו לאחרונה עם סימני לעיסה משוננים אופייניים לאורך מכסה השעווה.
    הערה: הכמות המדויקת של המסגרות הנדרשות תהיה תלויה בגודל הניסוי, בכמות ה-brood המתהווה לכל פריים ובזמן השנה. מסגרת עמוקה סטנדרטית של Langstroth מכילה כ-3,000 תאי מסרק לכל צד; מסגרת המכילה בעיקר גלמים מכוסים, עם כמה נצפים מתעוררים יכול בקלות לייצר 400+ דבורים ב 24 שעות. התאימו את עצמכם לאורך כל העונה, לפי הצורך.
  3. יש להבריש את כל הדבורים הבוגרות לפני הכנסת המסגרות לקופסאות הופעה והעברתן לחממה התואמת את התנאים הפנימיים של כוורת (34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות לחות חיים). אפשרו לדבורים להגיח במשך 24 שעות.
  4. הסירו את קופסאות ההופעה מהאינקובטור והברישו את כל הדבורים החדשות שיצאו לתוך אמבט האיסוף. הקפידו להסיר את כל הדבורים גם מתיבות ההופעה כדי למנוע הכללה של דבורים מיושנות בצורה לא נכונה בכל הצחצוחים הבאים. כל דבורה שיכולה לעוף הופיעה לפני > 24 שעות ויש להוציא אותה מהבדיקה הביולוגית.
  5. לייצר תערובת הומוגנית של דבורים שזה עתה הופיעו על ידי ערבוב עדין של הדבורים באמבט האיסוף ביד (הן אינן יכולות לעקוץ בגיל זה) כדי למזער את ההשפעות הגנטיות של הכוורת מכל מושבה בודדת. עבור יישומים ספציפיים, הסדרים אחרים עבור מקור המושבה עשויים להיות רצויים.
  6. ספרו 35 דבורים בודדות, והכניסו כל אחת מהן לאותה משומנת לפני העברת התכולה לכלוב אקרילי. לחלופין, ייתכן שיהיה קל יותר להפריד בין כפולות קטנות יותר של דבורים למספר כוסות משומנות (למשל, 5 כוסות של 7 דבורים כל אחת) כדי למנוע שגיאות של ספירה שגויה. מספר הדבורים המשמשות יכול להיות מגוון בהתאם לצרכים וליישומים.
  7. העבירו את כלובי הדבורים לחממה (34 מעלות צלזיוס ו-50% RH), והקפידו לעקוב אחר סדר ההשמה האקראי שנוצר ב-6.1.1 כדי למזער את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרו אקלים.
  8. הכן סביבת עבודה לעבודת וירוסים על ידי ניקוי כל המשטחים והפיפטות עם מי אקונומיקה, אתנול ותמיסת ההשבתה RNase לפני שתתחיל. הקפידו ללבוש כפפות ניטריל בכל פעם שאתם מטפלים בחלקיקי הנגיף.
  9. הכינו את האינוקולום של הנגיף לריכוז הרצוי על ידי הפשרת כמות מתאימה של חלקיקי נגיף מרוכזים (שלב 4.17) וערבוב יסודי עם תמיסת סוכרוז מספקת (שלב 6.1.3) במיכל סטרילי. עבור כלובים של 35 דבורים, כל אחד מהם דורש 600 μL של אינוקולום. דילולים סדרתיים מומלצים אם ריכוז הנגיף הרצוי הוא 0.1% או פחות.
    1. לדוגמה, ניסוי שיכלול 40 כלובים שכולם זקוקים לאינוקום של 1% בנגיף ידרוש 24 מ"ל של תמיסת וירוס, שניתן ליצור על ידי שילוב של 240 μL של חלקיקי וירוס מרוכזים עם 23.76 מ"ל של תמיסת סוכרוז. מומלץ לכלול כ-15% יתר על המידה בנפח ההתחלתי, שכן צפויים הפסדים מסוימים עם נוזלים צמיגים.
  10. פרשו את מגשי האינוקולום שהוכנו ב-6.1.2 ממוינים לפי סוג הטיפול ופיפטה 600 μL של האינוקולום המתאים על כל מגש.
    1. הכניסו בזהירות את מגשי האינוקולום לכלובים המתאימים להם, תוך הקפדה שלא לשחרר בטעות דבורים. נצלו את ההזדמנות הזו כדי לסרוק את הדבורים ולהחליף את כל מה שאולי מת בתהליך ההעברה.
  11. אפשר צריכה מלאה של האינוקולה (כ-12-14 שעות) לפני הסרת צינורות הצנטריפוגה החוסמים את חור המזין העליון ומכניסים את צינורות ההזנה המתאימים שהוכנו ב-6.1.4. זה עוזר להבטיח שהדבורים בכלוב יחלקו את האינוקולום באופן שווה על פני האוכלוסייה. תמיסת סוכרוז מסופקת עד ליבטום ויש למלא מחדש את הצינורות לפי הצורך במהלך הניסוי.
  12. רשמו את התמותה בכל כלוב במרווחים של 12 שעות במשך 72 השעות הראשונות של כל ניסוי, ולאחר מכן הזיזו את ההקלטה למרווחים של 24 שעות. הסר דבורים מתות מכלובים כדי להגביר את קלות הספירה העתידית על ידי החלקת דלת הכלוב למעלה מספיק רחוק כדי שזוג מלקחיים יוכלו להגיע פנימה ולהוציא דבורים מתות. הקפידו לעקר את המלקחיים מעל מנורת אלכוהול בין כלובים כדי למנוע זיהום צולב נגיפי.
  13. דגימת דבורים למדידות טיטר נגיפיות (5.1-5.2) על ידי בחירה אקראית של דגימות חיות בתוך כלוב והנחתם בצינורות צנטריפוגה על קרח יבש. בדרך כלל, שלוש דבורים מספיקות כדי לייצר מדידות טיטר נגיפיות בכל נקודת זמן נתונה מבלי לנטרל גם את הכלוב.
  14. המשך מדידות תמותה קבועות כל עוד יש צורך בכך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מעקב מוצלח אחר הפרוטוקולים (איורים 1) להזרקת pupal ומיצוי נגיפי אמור לייצר כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים. עם זאת, דגימה והזרקה של גלמים שמקורם ממגוון מושבות בנקודות זמן מרובות ממקסמת את הסיכויים לרכוש וירוס מטרה עם זיהום נמוך. הדינמיקה שבאמצעותה וירוסים משכפלים ומתקשרים זה עם זה בתוך דבורת דבש אינה מובנת היטב; יחד עם הסבירות לזיהום קיים, אין ערובה לכך שהנגיף המוזרק (הרצוי) יהפוך לדומיננטי בכל גלם נתון, גם אם הגלמים נדגמו מאותה מושבה מקורית. איור 4 מדגים את הטווח הפוטנציאלי של פרופורציות נגיפיות שניתן היה לצפות לראות לאחר החילוץ. ארבע המושבות המוצגות מייצגות תת-קבוצה של מאמץ קצירת נגיף גדול יותר, שבו לכל גולם הוזרק בתחילה אינוקולום של נגיף שיתוק חריף ישראלי (IAPV) כ-95%. אף על פי ש-10 מתוך 16 דגימות המושבה שהיו מעורבות במיצויים אלה הכילו IAPV טהור ביותר (> 95%), כולל כמה > 99% (למשל, קולוני 1), דגימות אחרות היו שונות בשיעור ה-IAPV שלהן (למשל, קולוני 2-3), כאשר חלקן אף נשלטו על ידי וירוסים אחרים כגון נגיף כנף מעוות (DWV) (למשל, מושבה 4).

טבלה 1 מספקת הקשר נוסף לרמת ההגברה של ארבעת הווירוסים (BQCV, DWV, IAPV, SBV) המוצגת באיור 4 בצורה של ערכי מחזור סף RT-qPCR (Ct) (הנקודה שבה יעד PCR מגיע לסף הגילוי) ושווי גנום כולל של הנגיף (ge) לכל 100 ng RNA. ערכי Ct יכולים לשמש כמנבא של פרופורציה, אך ערכי ge צריכים להיות מחושבים באמצעות שיטה מבוססת עקומה סטנדרטית17. שימו לב שהכמות הממשית של החלקיקים (כלומר, ge) המיוצרים תלויה במספר הגלמים המעובדים ובמחרוזות הסינון במהלך תהליך החילוץ.

תכשירי חלקיקי הנגיף (אינוקולום מוגבר) צריכים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומומלץ לאחסן אותם, שכן הם יתפרקו באופן משמעותי אם יהיו נתונים למחזורי הפשרה מרובים בהקפאה18. בנוסף, תמיד יש לערוך בדיקות מינון-תגובה לפני הניסויים, שכן מספר רב של גורמים חיצוניים (גנטיקה של כוורת, בריאות הדבורים וכו ') יכולים להוביל לתגובה נגיפית משתנה מאוד. באמצעות נתונים שמקורם בכלובים ניסיוניים (איור 3), איור 5 מדגים שונות כזו על ידי השוואת עקומות ההישרדות של תגובת המינון של דבורי הדבש, שהוזנו באותם חלקיקי IAPV במהלך שנתיים שונות. למרות פרמטרים זהים של בדיקה, כולל אותה אינוקולה נגיפית וריכוזי בדיקה שנעו בין 1% ל-0.01% IAPV, הניסויים שנערכו ב-2018 (איור 5A) וב-2019 (איור 5B) הניבו תגובות הישרדות שונות באופן ניכר בכל הטיפולים פרט לטיפולי הביקורת, שלא קיבלו שום נגיף באינוקולום הסוכרוז שלו. שים לב כי, אם תרצה, ניתן לבצע גם חישובי LD50 בשלב זה כדי לקבל מדידות תמותה מדויקות יותר43, אך בדרך כלל אין בכך צורך מכיוון שקירובים מספיקים בדרך כלל. בשנת 2018, מינון של 1% הביא להישרדות של כ-50% לאחר ההדבקה ב-72 שעות לאחר ההדבקה (hpi), ובכך הפך אותה לריכוז ברירת המחדל עבור רוב ניסויי הכלוב הנגיפיים שנערכו באותה שנה. עם זאת, אותה מינון השיגה תמותה כמעט מוחלטת בשנת 2019 באותה נקודת זמן, וכתוצאה מכך, רוב ניסויי הכלובים הנגיפיים שנערכו באותה שנה קיבלו במקום זאת 0.01% אינוקולום IAPV. ריכוז נמוך משמעותית זה הגיע לאותן רמות תמותה כמו אינוקולום IAPV של 1% בשנת 2018 תוך שימוש בפי 100 פחות חלקיקי נגיף.

נתונים אלה הופקו באמצעות בדיקות ביולוגיות באמצעות כלובים דומים לאלה ששורטטו באיור 3. חורי ההזנה בחלק העליון ובצד מאפשרים שליטה קלה בתזונה ודלת כלוב ההזזה מקלה על הוספה או הסרה של חפצים מסביבת הכלוב, כגון מגשי אינוקולום או דבורים מתות. עם זאת, פרוטוקול הבדיקה הנגיפית הכללית אינו מוגבל לסוגים אלה של כלובים או לבחירות דיאטה ויש לשנותו כך שיתאים לצרכים ניסיוניים.

Figure 1
איור 1: תמונות מייצגות של שלבים שונים במהלך פרוטוקול ההסרה העצמית של הזחל. (A) מסת זחל לדוגמה שהייתה צפויה לאחר תקופת ההסרה העצמית בן לילה (1.6). (B) זחלים במרווחים זה מזה על מגשי הזרקה/גדילה נפרדים (1.6.3) (C,D) גלמים לבנים-עיניים המוכנים להזרקה נגיפית (1.9). כתמים חומים הם פראס זחל מיובש, אשר אין צורך להסיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מנגנון מזרק לדוגמה שנוצר על-ידי שילוב של מחט היפודרמית עם קצה רב-מתקן. המחט והקצה חוברו באמצעות דבק נוזלי כדי לספק באופן עקבי זריקות נוזל של 1 μL כאשר הם מחוברים לצינור חוזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: כלוב לדוגמה המשמש בבדיקה ביולוגית של וירוסים. תמיסת סוכרוז ואבקה סופקו לליביטום באמצעות חורי הזנה במהלך הניסוי. ניתן היה להעביר את אינוקולה וירוס בקלות באמצעות מגש המוחדר דרך תחתית הכלוב. שים לב שניתן להתאים את סוג הכלוב ואת תוכן המזין לפי הצורך כך שיתאימו לפרמטרים ניסיוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סך העומסים והפרופורציות הממוצעות של הנגיף על פני תכשירים נגיפיים מארבע מושבות דגימה. עומסי הנגיף נמדדו על ידי RT-qPCR כנגיף תאי מלכה שחורים (BQCV) + נגיף כנף מעוות (DWV) + נגיף שיתוק חריף ישראלי (IAPV) + נגיף שקברוד (SBV) המקבילים לגנום (ge) ב-100 ng RNA. כל מושבת דגימה כללה יותר מ-150 גלמים הומוגניים שהוזרקו להם במקור IAPV ומייצגת את הטווח האופייני של פרופורציות הנגיף שנוצרו מפרוטוקול הזרקת הנגיף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: עקומות הישרדות של תגובת מינון של כלובי בדיקה ביולוגית של דבורי דבש. כלובים הן מ-2018 (A) והן מ-2019 (B) חוסנו ב-IAPV והוזנו בתמיסת סוכרוז של 30% עד ליביטום לאורך כל תקופת הניסוי. הטיפולים מייצגים ריכוזי אינוקולה של IAPV עם 10-2 עד 10-4 המציינים 1% עד 0.1% תכשירי חלקיקי IAPV מעורבבים בתמיסה של 30% סוכרוז; חיסוני סוכרוז שליטה לא הכילו וירוס. n = 56 כלובים בסך הכל בשנת 2018; n = 77 כלובים בסך הכל בשנת 2019. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: ערכי מחזור סף ממוצע (Ct) ושווי גנום לכל 100 ננוגרם RNA של תערובות וירוסים בארבעה תכשירים נגיפיים מארבע מושבות דגימה. כל מושבת דגימה מורכבת מ-150+ גלמים הומוגניים שנוצרו מפרוטוקול הזרקת הנגיף הגלופי. וירוסים זוהו על ידי RT-qPCR באמצעות פריימרים ספציפיים עבור כל וירוס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן תיארנו שיטות המפרטות כל שלב בתהליך ההגברה והכנת מלאי האינוקולום של הנגיף, כולל איסוף זחלים והתפשטות הנגיף, מיצוי וריכוז הנגיף, כמו גם טיפול נגיפי בצורה של ניסויי האכלה בכלובים. שיטות אלה מאפשרות ייצור של חלקיקי נגיף טהורים למחצה (איור 4), שיעילותם ניתנת לכימות באופן עקבי על ידי בדיקות תמותה של תגובת מינון לנגיפים שהם קטלניים למבוגרים (איור 5). לאחר אישור יכולת ההדבקה ו/או הפתולוגיה, ניתן להשתמש בחלקיקים הנוצרים בביו-אסיסויים כדי להבהיר את יחסי הגומלין בין דבורי הדבש לנגיפי דבורי הדבש.

אחד היתרונות המובהקים ביותר של הפרוטוקולים המתוארים הוא שכל אחד מהם מתרחב בקלות לנפח גדול, בין אם זה גלמים שנקטפו, חלקיקים המיוצרים או בדיקות ביולוגיות שבוצעו. באמצעות שיטות כריתה pupal33, ניתן לצפות להסיר ~ 100 גלמים בשעה, אם כי מספר זה ישתנה עם מיומנות. עם זאת, שיטת ההסרה העצמית של הזחל, המדווחת כאן, בעודה דורשת נהלי תכנון ותזמון שונים, יכולה בקלות לייצר פי 10-20 ממספר הדבורים שהוסרו במהלך הלילה, תוך שהיא כרוכה במאמץ ידני מועט יחסית ופחות עומס מכני על הדבורים.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שאין דרך להבטיח שהזחלים שהוסרו מעצמם לא היו בעבר שורצי Varroa. טיפול קבוע בקרדית וניטור של כוורות מקור יכולים למזער את הסיכון הזה, אך ייתכן שחלק מהזחלים עדיין סבלו מרמה מסוימת של טפילות Varroa. עם זאת, הסרה ידנית של גלמים בנפרד מאפשרת למשתמש להתבונן אם קיימות קרדיות כלשהן בתא של גולם נתון. בנוסף, מכיוון שתהליך ההסרה העצמית מסתמך על התנהגות חיפוש המזון של הזחלים, יש להסיר את המסגרות המכילות זחלים אלה לפני ההאכלה הסופית המתרחשת בדרך כלל. רק בשל חוסר אספקה זה על ידי העובדים, הזחלים זוחלים מתאיהם. לכן, הגלמים שמקורם בשיטה זו חווים חלון קצר מאוד של עקה תזונתית בהשוואה לזחלים שהתפתחו לחלוטין בתוך מושבה ויכולים להיראות מעט קטנים יותר. זה בולט במיוחד בזחלים הצעירים ביותר בקבוצה שנמצאת על המסגרת; מכיוון שהמלכה הטילה ביצים על פני חלון של 24 שעות, הזחלים האלה חסרים באופן יחסי יותר זמן האכלה. אלה בדרך כלל בולטים בבירור במהלך הגורים על גודלם הקטן מאוד בהשוואה לאלה שהוסרו על ידי כריתה ידנית. עם זאת, נפח הזחלים המיוצרים על ידי הסרה עצמית יותר מאשר מפצה על הביומסה האינדיבידואלית הפוחתת שלהם. יתר על כן, שיטת הכריתה הידנית יכולה גם לגרום ללחץ מכני משמעותי על הגלמים כאשר הם נמשכים מהתאים שלהם. אם יש להשתמש בשתי השיטות כחלק מניסוי, ולא רק כדי לייצר חלקיקי וירוסים, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח בקרה נאותה.

ללא קשר לשיטת המיצוי, פרוטוקול התפשטות הנגיף יכול ליצור כמויות גדולות של חלקיקי נגיף באמצעות הגלמים, מה שממזער את השונות המושרה על ידי שיטות אחרות לחיסון הנגיף הנהוגות כיום 35,36,37 בעת בדיקת תגובה נגיפית של דבורת הדבש. חשוב לציין כי פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה ונבדק באמצעות וירוסים שאינם עטופים בסדרה Picornavirales (למשל, נגיף שיתוק חריף ישראלי, נגיף כנף מעוות). יש לעקוב אחר אסטרטגיות שונות לבידוד חלקיקים נגיפיים בעת עבודה עם וירוסים עטופים44. כקירוב גס, כל אחת מ-16 הדגימות שהיו מעורבות במאמץ קצירת הנגיף (שכללה את 4 המושבות של איור 4) נוצרה מ-200-300 גלמים מוזרקים והניבה בין 2-2.5 מ"ל של תכשירי חלקיקי נגיף מרוכזים. בהנחה שריכוז אינוקולום של נגיף הוא 0.1% וכלוב סטנדרטי של 35 דבורים, כל אחד מ-16 תכשירי הנגיף יספק מספיק חלקיקים ל-3,300-4,200 כלובים. עודף זה של חומר מדבק מפחית את מגבלות הניסוי ומאפשר בדיקות ביולוגיות בתפוקה גבוהה. חשוב לציין שלמרות שריכוז חלקיקי הנגיף יכול להישאר בר קיימא במשך חודשים או שנים כאשר הוא מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, הוא יכול לרדת לאט לאט בהדבקה, גם אם הוא נתון למעט מחזורי הפשרה בהקפאה. לכן, מומלץ לאחסן את מלאי ההכנה הנגיפית באליקוטים קטנים, שכמה מהם יכולים לשמש לכימות טיטרים ויראליים ולאימות מינון הטיפול בזמן הניסוי. בנוסף, השונות הבין-שנתית שהוכחה באיור 5, מחזקת עוד יותר את הצורך בבדיקות מינון-תגובה תקופתיות, ובכך ממזערת את הסיכויים לאובדן בלתי צפוי של כדאיות הנגיף.

גם למבחנים הביולוגיים של הכלובים עצמם יש מגבלות, או לפחות אזהרות שיש לקחת בחשבון, כשהראשונה שבהן היא האופי המלאכותי של סביבת הביו-אסתה של הכלוב (איור 3). קיבוץ דבורים לתוך מארזים מאפשר בדיקות ויראליות מעבר לרמת הפרט; הכלוב הופך ליחידת הניסוי ולא לדבורה עצמה. למרות שזה דומה יותר למושבה ממשית מאשר לדבורה בודדת שמטופלת בבידוד, היא עדיין רחוקה מלהיות סביבת כוורת מציאותית. דבורים אלה, שהוצאו מהסביבה החברתית, כולל פרומונים של מלכה וגזע, דבורים בגילאים שונים ורמזים אחרים, עשויות שלא להגיב כפי שמושבה בגודל מלא עשויה להגיב. עם זאת, אלה הם בעיקר שיקולים לניסויים בקנה מידה גדול יותר באמצעות מערכת הכלובים. התוצאות שנאספו מבדיקות ביולוגיות של נגיפים בכלוב צריכות להיות מטופלות בעיקר כמאגר מידע בסיסי שניתן להשתמש בו כדי ליידע החלטות עתידיות על בדיקות וירוסים בקנה מידה להגדרה מציאותית יותר בשטח לפי רצונו של המשתמש.

השיטות המתוארות כאן מספקות תהליך סטנדרטי לייצור המוני של חלקיקי וירוס לשימוש במבחנים נגיפיים של דבורי דבש. מבחנים כאלה כבר יושמו כדי לבחון היבטים שונים של יחסי הגומלין בין דבורי הדבש לנגיף, כולל זיהום רב-וירוסי וכיצד איכות התזונה ותוספי התזונה משפיעים על הניצולים לנוכח זיהום נגיפי 11,18,45,45,46. הם הוגדלו לשימוש בניסויי זיהום ברחבי המושבה11,47 ולחקור את ההשפעות של זיהום על התנהגות47 וביטוי גנים48. באופן כללי, שיטות אלה מספקות בסיס בכלים שניתן להשתמש בהם כדי לייצר ולהעריך אינוקולה של נגיף דבורת הדבש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר ג'וליה פיין על רעיונותיה ודיון בה במהלך תהליך יצירת הפרוטוקול, כמו גם לד"ר קסנדרה ורנייה על הערותיה המועילות במהלך העריכה. חומרים אלה תרמו לפרויקטים שנתמכו בחלקם על ידי הקרן לחקר המזון והחקלאות, תחת מענק ID 549025.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 162 דבורת דבש Apis mellifera נגיף הדבורים זיהום דרך הפה ביו-אסאיות של כלובים מיצוי חלקיקים נגיפיים
הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter