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Biology

हनी बीज़ के मौखिक संक्रमण के लिए वायरस-समृद्ध इनोकुलम की तैयारी (एपिस मेलिफेरा)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

यहां हम दो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं: सबसे पहले शहद मधुमक्खी गैर-लिफाफे वाले वायरस कणों की बड़ी मात्रा में प्रचार, निकालने, शुद्ध करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए, जिसमें शहद मधुमक्खी प्यूपा को हटाने के लिए एक विधि शामिल है और दूसरा अत्यधिक दोहराने योग्य, उच्च थ्रूपुट पिंजरे बायोएसे का उपयोग करके वायरल संक्रमण के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए।

Abstract

हनी मधुमक्खियां दुनिया भर में महान पारिस्थितिक और कृषि महत्व के हैं, लेकिन विभिन्न प्रकार के दबावों के अधीन भी हैं जो वायरल रोगजनकों के संपर्क सहित मधुमक्खी के स्वास्थ्य को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। इस तरह के वायरस विभिन्न प्रकार के विनाशकारी प्रभाव पैदा कर सकते हैं और अक्सर कई कारकों के कारण अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जो पूर्ववर्ती पृष्ठभूमि संक्रमण से प्रयोगात्मक उपचार के प्रभावों को अलग करना मुश्किल बनाते हैं। यहां हम वायरल संक्रमण और प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट बायोएसे के साथ बड़ी मात्रा में वायरस कणों का बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। एक निरंतर, वायरस मुक्त शहद मधुमक्खी सेल लाइन की वर्तमान कमी से आवश्यक, वायरल कणों को शहद मधुमक्खी प्यूपा का उपयोग करके विवो में प्रवर्धित किया जाता है, जो न्यूनतम तनावपूर्ण पद्धति का उपयोग करके बड़ी मात्रा में छत्ते से निकाले जाते हैं। इन वायरस कणों का उपयोग तब इनोकुला व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए शहद मधुमक्खी पिंजरे बायोएसेज़ में किया जा सकता है, साथ ही पोषण, कीटनाशकों और अन्य रोगजनकों के साथ बातचीत सहित विभिन्न अन्य वायरस संक्रमण गतिशीलता भी शामिल है। ऐसे कणों का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह वर्तमान विकल्पों की तुलना में बाद के प्रयोगों में अज्ञात चर शुरू करने की संभावनाओं को बहुत कम कर देता है, जैसे कि संक्रमित मधुमक्खी हेमोलिम्फ या होमोजेनेट के माध्यम से संक्रमण, हालांकि मधुमक्खियों को सोर्स करते समय देखभाल अभी भी की जानी चाहिए, पृष्ठभूमि वायरस संदूषण को कम करने के लिए। पिंजरे परख एक कॉलोनी स्तर पर वायरस संक्रमण प्रभाव का परीक्षण करने वाले बड़े पैमाने पर, क्षेत्र-यथार्थवादी प्रयोगों के लिए एक विकल्प नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय बेसलाइन वायरल प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने के लिए एक विधि के रूप में कार्य करते हैं, जो अर्ध-शुद्ध वायरस कणों के संयोजन में, शहद मधुमक्खी-वायरस शारीरिक बातचीत के विभिन्न आयामों की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं।

Introduction

शहद मधुमक्खियां (एपिस मेलिफेरा) आधुनिक वैश्विक कृषि परिदृश्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, लेकिन वर्तमान में जैविक और अजैविक तनावों के संयोजन से पीड़ित हैं, जिसमें कीटनाशक जोखिम, खराब चारा, परजीवी और रोगजनक 1,2 शामिल हैं। चिंता के सबसे महत्वपूर्ण रोगजनकों में से एक वायरस हैं, जिनमें से कई प्रमुख शहद मधुमक्खी तनावों में से एक, परजीवी वारोआ घुन (वारोआ विनाशक) द्वारा वेक्टर किए जाते हैं। ये वायरस शहद मधुमक्खियों में नकारात्मक प्रभावों की एक सरणी का कारण बन सकते हैं जिसमें कम ब्रूड अस्तित्व, विकास संबंधी दोष और पक्षाघात शामिल हैं जो ओवरविंटरिंग अवधि 3,4,5 से पहले और बाद में कुल छत्ते के पतन का कारण बन सकते हैं। यद्यपि वायरस संक्रमण 6,7,8,9 का मुकाबला करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रौद्योगिकियों के विकास में आशाजनक प्रगति हुई है, लेकिन जिस गतिशीलता द्वारा कई वायरस शहद मधुमक्खी या कॉलोनी के भीतर प्रचार, प्रसार और बातचीत करते हैं, उन्हें अभी भी खराब तरीके से समझा जाता है 5,10 . शहद मधुमक्खी और वायरस इंटरैक्शन के बुनियादी जीव विज्ञान और अन्य पर्यावरणीय कारकों के साथ उनके संबंधों को समझना प्रभावी वायरस प्रबंधन तकनीकों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

हालांकि, शहद मधुमक्खी-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने से प्रक्रिया को जटिल बनाने वाले कई ज्ञात और अज्ञात कारकों के साथ चुनौतियां पैदा होती हैं। इनमें आहार11,12, कीटनाशक जोखिम 13, और मधुमक्खी आनुवंशिक पृष्ठभूमि14,15 के साथ बातचीत शामिल है। यहां तक कि अकेले वायरस संक्रमण पर ध्यान केंद्रित करते समय, जटिलताएं आम हैं क्योंकि शहद मधुमक्खी आबादी, प्रबंधित और जंगली दोनों, हमेशा कुछ हद तक पृष्ठभूमि वायरस संक्रमण होता है, हालांकि अक्सर तीव्र लक्षण16,17 प्रकट किए बिना, और वायरस सहसंक्रमण के प्रभाव ों को अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है18. इसने शहद मधुमक्खी वायरस प्रभावों के अध्ययन को विसर्जित करना मुश्किल बना दिया है।

कई शहद मधुमक्खी वायरस अध्ययनों ने अन्य तनावों के साथ बातचीत की तलाश करने के लिए परिस्थितिजन्य वायरस संक्रमण का उपयोग किया है, यह देखते हुए कि पृष्ठभूमि संक्रमण अन्यउपचारों 12,19,20,21 के साथ कैसे बदलते हैं। हालांकि यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण प्रभावों की पहचान करने में सफल रहा है, विशेष रूप से यह पता लगाना कि कीटनाशक या आहार उपचार वायरस के स्तर और प्रतिकृति को कैसे प्रभावित करते हैं, ज्ञात सामग्री और एकाग्रता के वायरस उपचार के साथ टीकाकरण वायरस संक्रमण गतिशीलता के प्रयोगात्मक परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। फिर भी, प्रयोगात्मक उपचार को पृष्ठभूमि संक्रमण से अलग करना भी चुनौतियों का सामना कर सकता है। क्षेत्र के अध्ययन में, शोधकर्ताओं ने विकृत विंग वायरस (डीडब्ल्यूवी) के उपभेदों को विभेदित किया है ताकि शहद मधुमक्खियों से भौंरा मधुमक्खियों22 तक वायरस संचरण के लिए सबूत प्रदान किया जा सके, लेकिन इस दृष्टिकोण का उपयोग करना अकेले शहद मधुमक्खियों के भीतर मुश्किल होगा। वायरस संक्रामक क्लोन एक शक्तिशाली उपकरण हैं, न केवल संक्रमण 23,24,25 को ट्रैक करने के लिए बल्कि शहद मधुमक्खी वायरस के रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन के लिए और वायरस-होस्ट इंटरैक्शन रिसर्च26,27,28 के लिए। हालांकि, ज्यादातर उदाहरणों में, कणों का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं के अंदर संक्रमण चक्र को पूरा करने के लिए संक्रामक क्लोन अभी भी आवश्यक हैं। इस तरह के कणों को प्रयोगात्मक उपचार के लिए इनोकुला के रूप में पसंद किया जाता है क्योंकि उनकी संक्रामकता नग्न वायरल आरएनए की तुलना में अधिक होती है और एनकैप्सिडेटेड जीनोम के साथ इनोक्यूलेशन एक प्राकृतिक संक्रमण की नकल करता है।

शुद्ध, अदूषित शहद मधुमक्खी वायरस इनोकुला (जंगली प्रकार के वायरस उपभेदों या संक्रामक क्लोन से व्युत्पन्न) का उत्पादन भी चुनौतियों का सामना करता है। ये मुख्य रूप से शुद्ध-तनाव वायरस29,30 का उत्पादन करने के लिए एक विश्वसनीय, लगातार-प्रतिकृति, वायरस मुक्त शहद मधुमक्खी सेल लाइन प्राप्त करने में कठिनाइयों के कारण हैं। जबकि कुछ सेल लाइनों का उत्पादन किया गया है, ये प्रणालियां अपूर्ण बनी हुई हैं; फिर भी, आशा है कि एक व्यवहार्य सेल लाइन का उत्पादन किया जा सकता है29, जो वायरस उत्पादन और जांच के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देगा। जब तक ऐसी लाइन व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हो जाती है, तब तक अधिकांश वायरस उत्पादन प्रोटोकॉल विवो वायरस उत्पादन और शुद्धिकरण 18,31,32,33,34 के उपयोग पर भरोसा करना जारी रखेंगे। इन दृष्टिकोणों में ब्याज के वायरस कणों (या एक संक्रामक क्लोन का उत्पादन) की पहचान करना और शुद्ध करना और शहद मधुमक्खियों को संक्रमित करने के लिए उनका उपयोग करना शामिल है, आमतौर पर प्यूपा के रूप में। प्यूपा को लक्ष्य वायरस के साथ इंजेक्ट किया जाता है और फिर बलिदान किया जाता है, और आगे के कणों को निकाला और शुद्ध किया जाता है। हालांकि, क्योंकि कोई भी मधुमक्खियां शुरू करने के लिए वायरस मुक्त नहीं होती हैं, इसलिए इस तरह के किसी भी ध्यान में अन्य वायरस के निशान से हमेशा कुछ हद तक संदूषण होता है, और इसलिए, पृष्ठभूमि संक्रमण की कम संभावना के साथ मधुमक्खियों को चुनने में बहुत सावधानी बरतनी चाहिए। इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल33 में उपयोग के लिए कंघी कोशिकाओं से प्यूपा को हटाने के तरीके बहुत श्रम गहन हैं और मधुमक्खियों में तनाव पैदा कर सकते हैं, इन साधनों18,32 द्वारा उत्पादन को सीमित कर सकते हैं। यहां, हम एक वैकल्पिक विधि की रिपोर्ट करते हैं जो मधुमक्खियों पर कम श्रम और कम यांत्रिक तनाव के साथ लार्वा के बड़े पैमाने पर हटाने की अनुमति देता है।

एक बार प्यूपा प्राप्त हो जाने के बाद और शुरुआती वायरस इनोकुलम के साथ इंजेक्ट किया जाता है, तो उन्हें वायरस को दोहराने के लिए समय प्रदान करने के लिए इनक्यूबेट किया जाना चाहिए। इसके बाद, उत्पादित वायरस कणों को प्रयोगात्मक मधुमक्खियों को संक्रमित करने के लिए उपयोग करने योग्य रूप में संसाधित किया जा सकता है। इसे प्राप्त करने के लिए कई सरल तरीके हैं, जिसमें संक्रमण37 के स्रोत के रूप में वायरल संक्रमित मधुमक्खियों से उत्पन्न क्रूड होमोजेनेट 35,36 या हेमोलिम्फ का उपयोग करना शामिल है। ये विधियां प्रभावी हैं लेकिन पृष्ठभूमि सब्सट्रेट से अज्ञात चर पेश करने के अधिक मौके में चलती हैं (उदाहरण के लिए, मृत मधुमक्खी होमोजेनेट्स में अन्य कारक)। इसके अतिरिक्त, कणों को केंद्रित करना वांछनीय है यदि किसी प्रयोग के लिए थोड़े समय में वायरस की एक बड़ी, ज्ञात खुराक देने की आवश्यकता होती है। इसलिए, बेहतर नियंत्रण के लिए, उन तरीकों का उपयोग करना बेहतर होता है जो वायरस कणों के शुद्धिकरण और एकाग्रता के कुछ स्तर की अनुमति देते हैं। आम तौर पर, वर्षा और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों की एक श्रृंखला के परिणामस्वरूप लगभग सभी संभव गैर-लक्ष्य वायरस सामग्री33 को हटा दिया जाएगा।

इस केंद्रित इनोकुलम का उत्पादन करने के बाद, वायरल टिटर्स (क्यूपीसीआर) को मापना फायदेमंद है और इसकी व्यवहार्यता और मृत्यु दर का कारण बनने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए विवो बायोएसेज़ में इसे चिह्नित करना फायदेमंद है, साथ ही यह पुष्टि करने के लिए कि संक्रमण के बाद बढ़े हुए वायरस टाइटर्स प्राप्त किए जाते हैं। यह इंजेक्शन प्रयोगों (या तो प्यूपा या वयस्कों में) या खिला प्रयोगों (लार्वा या वयस्कों में) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। जबकि ये सभी दृष्टिकोण संभव हैं, पिंजरे में वयस्क मधुमक्खियों के समूहों को खिलाना अक्सर सबसे तेज़ और सरल होता है। पिंजरे परख विधि का व्यापक रूप से कीटनाशक विषाक्तता38, अंडाशय विकास39, और व्यवहार40,41 पर पोषण संबंधी प्रभाव सहित मधुमक्खियों पर विभिन्न अन्य उपचारों के परीक्षण के लिए भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और इसलिए, अन्य कारकों के साथ वायरस संक्रमण को जोड़ने वाले प्रयोगों के लिए एक अच्छा आधार बना सकताहै 42।

यहां हम एक महंगे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज का उपयोग किए बिना बड़ी मात्रा में अर्ध-शुद्ध, अत्यधिक समृद्ध वायरस कणों के उत्पादन के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें प्यूपा को हटाने के लिए एक विधि शामिल है जो मधुमक्खियों पर श्रम और यांत्रिक तनाव को कम करती है और वायरल संक्रमण और प्रभावों के परीक्षण के लिए एक अत्यधिक दोहराने योग्य, उच्च थ्रूपुट बायोएसे। वायरल इनोकुला की शुद्धता को कसकर नियंत्रित करके, जांचकर्ता अन्य वायरल इनोक्यूलेशन विधियों के सापेक्ष शहद मधुमक्खी वायरल प्रतिक्रिया में भिन्नता को कम करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, बायोएसे क्षेत्र-यथार्थवादी सेटिंग्स में स्केलिंग से पहले अत्यधिक दोहराए जाने योग्य प्रयोगात्मक इकाइयों का उपयोग करके एक छोटे समूह स्तर पर वायरल प्रभावों के लिए स्क्रीन कर सकता है, जो प्रबंधन के लिए कहीं अधिक श्रम गहन है। संयोजन में, ये दो तरीके अध्ययनों के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करते हैं जो शहद मधुमक्खी-वायरस शारीरिक बातचीत की हमारी समग्र समझ को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं।

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Protocol

1. बड़े पैमाने पर मधुमक्खी निष्कर्षण विकल्प 1: लार्वा आत्म हटाने

  1. एक खाली, खींचे गए लैंगस्ट्रोथ फ्रेम पर एक शहद मधुमक्खी रानी पिंजरे और उसे अपनी कॉलोनी में वापस कर दें। रानी को 24 घंटे के लिए इस फ्रेम पर अंडे देने की अनुमति दें।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश कंघी कोशिकाओं में नए रखे गए अंडे होते हैं, 24 घंटे के बाद फ्रेम की जांच करें। रानी और कॉलोनी के आधार पर, अंडे कभी-कभी पहले 24 घंटे में बहुत अच्छी तरह से नहीं रखे जाते हैं। यदि ऐसा होता है, तो अतिरिक्त 24 घंटे के लिए अनुमति दें और आवश्यकतानुसार समय समायोजित करें।
  2. 24 घंटे अंडे देने की अवधि के बाद, रानी को छोड़ दें। फ्रेम को स्पष्ट रूप से चिह्नित करें और इसे कॉलोनी में वापस कर दें।
  3. रानी को पिंजरे में बंद करने के ठीक 192 घंटे (8 दिन) (पहले 24 घंटे के भीतर सामान्य अंडे बिछाने को मानते हुए; 8 दिन प्यूपेशन से ठीक पहले बिंदु को चिह्नित करते हैं), कॉलोनी से चिह्नित फ्रेम को हटा दें। सभी वयस्क मधुमक्खियों को ब्रश करें और फ्रेम को एक छत्ते (34 डिग्री सेल्सियस और 50% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच)) की आंतरिक स्थितियों से मेल खाने वाले इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि अधिकांश फ्रेम 5वें इंस्टार लार्वा से भरा हुआ है, जिसे कंघी कोशिकाओं के निचले किनारों के खिलाफ कसकर दबाए गए उनके बड़े, सफेद, सी-आकार के निकायों द्वारा पहचाना जा सकता है। संभवतः कुछ कोशिकाएं पहले से ही मोम कैपिंग द्वारा कवर की गई होंगी, खासकर फ्रेम के केंद्र के पास।
  4. साबुन और पानी के साथ आंतरिक और बाहरी सतहों को अच्छी तरह से साफ करके 5वें इंस्टार लार्वा प्राप्त करने के लिए लार्वा से भरे फ्रेम की ऊंचाई और चौड़ाई से मेल खाने वाले कंटेनर तैयार करें, इसके बाद ब्लीच समाधान, और अंत में इथेनॉल। आगे बढ़ने से पहले कंटेनर को अच्छी तरह से सुखाएं।
    1. कागज तौलिए की कई परतों के साथ कंटेनरों के नीचे लाइन। फिर पतले, शोषक सफाई पोंछे (जैसे, नाजुक कार्य वाइपर) या फ़िल्टर पेपर की कई अतिव्यापी परतें जोड़ें। सामग्री शोषक होनी चाहिए। भविष्य के लार्वा हस्तांतरण की आसानी में सुधार करने के लिए शीर्ष परत को ओवरलैप करने से बचें।
  5. कंटेनरों के शीर्ष पर फ्रेम का सामना करना पड़ता है (फोकल लार्वा के साथ नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है) रखें ताकि लार्वा सफाई पोंछे की परत पर गिर सकें।
    1. नमी बनाए रखने और इनक्यूबेटर को सेटअप वापस करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी या अन्य कवर के एक तम्बू टुकड़े के साथ कंटेनर और फ्रेम को कवर करें। सेटअप को रात भर छोड़ दें। लार्वा की प्राकृतिक भोजन की मांग करने वाली प्रवृत्तियों से उन्हें अपनी कोशिकाओं से बाहर क्रॉल करने और नीचे गद्देदार सतह पर गिरने का कारण बन जाएगा।
  6. 1.4 में विस्तृत एक ही कदम का उपयोग करके उन्हें अच्छी तरह से साफ करके अलग-अलग स्थानांतरण ट्रे तैयार करें। ट्रे को सूखने की अनुमति दें और सफाई पोंछे के साथ बोतलों को परत करें। ट्रे को किसी भी विशिष्ट आयामों से मेल खाने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन उथले ट्रे आसान लार्वा जोड़तोड़ के लिए अनुमति देंगे।
    1. कंटेनरों में शीर्ष परत से व्यक्तिगत पोंछे को सावधानीपूर्वक उठाकर और धीरे-धीरे ट्रे पर लार्वा डालने से कंटेनरों से ट्रे में लार्वा को स्थानांतरित करना शुरू करें। लार्वा को रात भर कंटेनरों में गिरना चाहिए था, जिससे कई चिपचिपा द्रव्यमान (चित्रा 1 ए) बनते थे।
    2. लार्वा को अलग करने और ट्रे की सतह पर उन्हें बाहर रखने के लिए कुंद नरम संदंश का उपयोग करें। उन्हें समान रूप से दूरी पर रहने की आवश्यकता नहीं है और एक दूसरे के करीब हो सकते हैं लेकिन उन्हें छूना नहीं चाहिए। अलग लार्वा के एक दृश्य चित्रण के लिए चित्रा 1 बी देखें।
    3. किसी भी क्षतिग्रस्त (बदरंग) या औसत से नीचे के आकार के लार्वा को हटाने के लिए इस अवसर को लें। ये परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान मरने की अधिक संभावना रखते हैं और पूरे ट्रे में संक्रमण / फंगल विकास ला सकते हैं।
  7. नमी को बनाए रखने और इनक्यूबेटर को सेटअप वापस करने के लिए तम्बू एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्रे को कवर करें।
  8. लार्वा को दैनिक रूप से जांचें और किसी भी ऐसे व्यक्ति को हटा दें जो विकृत (गहरे भूरे या काले) हैं।
    नोट: लार्वा / पूर्व-प्यूपा सफाई पोंछे पर शौच करेगा, जो छोटे भूरे रंग के पैच के रूप में प्रकट होगा। वे अपनी कैपिंग प्रक्रिया के हिस्से के रूप में सफेद, बुद्धिमान बद्धी की थोड़ी मात्रा का उत्पादन भी कर सकते हैं। इन घटनाओं में से कोई भी सफाई पोंछे के प्रतिस्थापन की आवश्यकता नहीं है, जब तक कि वे शोषक हैं।
  9. लार्वा को सफेद-आंख चरण में प्यूपेट और परिपक्व होने की अनुमति दें, जिसे वयस्क मधुमक्खी के मिलान वाले उनके सामान्य आकार से पहचाना जा सकता है, जबकि अभी भी उनकी आंखों और उनके शरीर के बाकी हिस्सों में पिग्मेंटेशन की कमी है। यह रानी पिंजरे के बाद 14 से 15 दिनों के बीच होना चाहिए। प्यूपा अब वायरस इंजेक्शन के लिए तैयार हैं। चित्रा 1सी, सफेद आंख प्यूपा के उदाहरणों के लिए 1 डी।

2. बड़े पैमाने पर मधुमक्खी निष्कर्षण विकल्प 2: मैनुअल प्यूपल छांटना

नोट: हालांकि विकल्प 2 (प्यूपल छांटना) मधुमक्खी निष्कर्षण का एक व्यवहार्य तरीका है, लेकिन विकल्प 1 (लार्वा आत्म-निष्कासन) की तुलना में इसमें कई कमियां भी हैं। विकल्प 2 कहीं अधिक श्रम गहन है, प्यूपल उम्र के लिए नियंत्रित करना कठिन है, और आम तौर पर मधुमक्खियों पर अधिक तनावपूर्ण होता है। जब भी संभव हो विकल्प 1 की सिफारिश की जाती है।

  1. एक उपयुक्त कॉलोनी से सफेद आंखों के चरण में या उसके पास प्यूपा युक्त कैप्ड शहद मधुमक्खी ब्रूड के फ्रेम का चयन करें (विवरण के लिए 1.9 देखें)। उपयुक्त विकास चरण की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए फ्रेम के केंद्र और किनारों के पास स्थित कंघी कोशिकाओं से कैपिंग निकालें।
  2. 34 डिग्री सेल्सियस और 50% सापेक्ष आर्द्रता के लिए सेट एक इनक्यूबेटर के लिए फ्रेम स्थानांतरण। तत्काल उपयोग में नहीं होने पर हमेशा फ्रेम को इनक्यूबेटर पर वापस करें।
  3. 1.6 में वर्णित लोगों के समान स्थानांतरण ट्रे तैयार करें और साफ करें।
  4. इनक्यूबेटर से फ्रेम निकालें और एक प्रकाश स्रोत के नीचे एक कोण स्टैंड पर सेट करें। पानी के साथ कागज तौलिए के एक छोटे से ढेर को गीला करें।
  5. इथेनॉल का उपयोग कर कुंद कठिन संदंश की एक जोड़ी साफ करें। स्वच्छ संदंश का उपयोग करके, सफेद आंख प्यूपा युक्त कोशिकाओं से कैपिंग को हटा दें, इस प्रक्रिया में प्यूपा को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें।
  6. एक-एक करके, धीरे-धीरे कंघी कोशिकाओं से प्यूपा को उत्पादित करें। संदंश युक्तियों का उपयोग करके छाती और पेट के चारों ओर प्यूपा को समझना सबसे सुरक्षित है, अगर पर्याप्त जगह है। यदि नहीं, हालांकि, प्यूपा को सिर को पकड़कर भी हटाया जा सकता है और धीरे-धीरे इसे शरीर के चारों ओर समझने के लिए पर्याप्त दूर तक घुमाया जा सकता है।
    1. नमी बनाए रखने के लिए गीले पेपर तौलिए के साथ फ्रेम के उन हिस्सों को कवर करें जिन्हें तुरंत एक्सेस नहीं किया जा रहा है। छांटना प्रक्रिया के दौरान आवश्यक के रूप में निकालें और बदलें।
  7. स्थानांतरण ट्रे में सफाई पोंछे के साथ उत्पादित प्यूपा को स्पेस करें, यह सुनिश्चित करें कि उनमें से कोई भी छू नहीं रहा है। किसी भी विकृत या बदरंग प्यूपा को त्याग दिया जाना चाहिए। प्यूपा अब वायरस इंजेक्शन के लिए तैयार हैं।
    1. प्यूपा को त्यागें जो पोंछे के संपर्क में आने पर तरल पदार्थ छोड़ता है; वे संभवतः पंचर हो गए हैं। कभी-कभी, प्यूपा हटाने पर 1 घंटे के भीतर संदंश के साथ संपर्क के बिंदुओं के पास मेलनाइजेशन के छोटे अंधेरे धब्बे प्रदर्शित करेगा। इससे अस्तित्व पर कोई असर नहीं पड़ना चाहिए। यदि मेलनाइजेशन के बड़े पैच दिखाई देते हैं, तो प्रभावित प्यूपा को त्याग दिया जाना चाहिए।

3. प्यूपल वायरस इंजेक्शन

नोट: यदि पहली बार (यानी, पूर्व वायरल इनोकुला स्टॉक के बिना) के लिए इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो पहले एक संदिग्ध संक्रमण के साथ एक कॉलोनी से वयस्कों, प्यूपा, या लार्वा का उपयोग करके कणों को निकालने और ध्यान केंद्रित करने के लिए। चरण 5 में वर्णित परिणामी इनोकुला में वायरल टिटर्स को मापें और निर्धारित करें कि कौन से कण आगे प्रचार करना है।

  1. शहद मधुमक्खी वायरस के साथ काम शुरू करने से पहले ब्लीच पानी और इथेनॉल का उपयोग करके सभी काम की सतहों को निष्फल करें। पूरी प्रक्रिया के दौरान नाइट्राइल दस्ताने पहने जाने चाहिए।
  2. ~ 1 μL मात्रा में तरल पदार्थ इंजेक्ट करने में सक्षम एक इंजेक्टर उपकरण तैयार करें।
    नोट: एक सस्ती अभी तक प्रभावी दृष्टिकोण लचीला एपॉक्सी या किसी अन्य तरल चिपकने वाला का उपयोग करके 100 μL मल्टी-डिस्पेंसर टिप ( सामग्री की तालिका देखें) की नोक पर 30 जी हाइपोडर्मिक सुई संलग्न करके एक हस्तनिर्मित डिवाइस बनाना होगा। सुनिश्चित करें कि सुई टोपी के किनारों को बहु-डिस्पेंसर टिप के खिलाफ कसकर सील कर दिया गया है और उपकरण को सूखने की अनुमति दें। एक उदाहरण इंजेक्टर उपकरण के दृश्य चित्रण के लिए चित्रा 2 देखें।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में निष्फल 1x पीबीएस (फॉस्फेट-बफर खारा) के साथ वांछित प्रकार के वायरस कणों को मिलाकर एक वायरस इंजेक्शन कमजोर पड़ने समाधान तैयार करें। आवश्यक कुल मात्रा प्यूपा की संख्या पर निर्भर करेगी जिसे इंजेक्शन लगाने की आवश्यकता होती है, प्रत्येक प्यूपा को 1 μL इंजेक्शन की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, 500 प्यूपा = 5 μL वायरस कण + 495 μL PBS)।
  4. इंजेक्टर उपकरण को एक मैनुअल मल्टी-विंदुक से संलग्न करें और एक अलग बीकर से 100 μL पानी खींचकर प्रभावकारिता का परीक्षण करें और इसे 1 μL खुराक में वितरित करें। सुनिश्चित करें कि वितरित की गई प्रत्येक राशि बराबर है, आवश्यक रूप से इंजेक्टर तंत्र को स्वैप करना। इंजेक्टर से किसी भी शेष पानी को साफ करें।
  5. इनक्यूबेटर से चरण 1 या चरण 2 में उत्पन्न प्यूपा की ट्रे को पुनः प्राप्त करें और एल्यूमीनियम पन्नी को कवर करने को हटा दें।
  6. इथेनॉल का उपयोग कर कुंद कठिन संदंश की एक जोड़ी साफ करें। धीरे-धीरे छाती के साथ व्यक्तिगत प्यूपा को समझें, पेट में आंतरिक तरल पदार्थ को मजबूर करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करें। इससे टेरगाइट डिवीजनों को अधिक स्पष्ट करना चाहिए।
  7. बहु विंदुक का उपयोग कर वायरस कण समाधान के 100 μL ड्रा, तीसरे और चौथे पेट tergites के बीच सुई डालने, और वायरस समाधान के 1 μL इंजेक्ट. ट्रे पर रखे गए प्रत्येक प्यूपा के लिए दोहराएं, दोहराए जाने वाले इंजेक्शन से बचने के लिए ध्यान रखें। प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त किसी भी प्यूपा को त्याग दिया जाना चाहिए।
    चेतावनी: सभी वायरस-तैयारी से संबंधित सामग्रियों को बायोहाजार्ड के रूप में नामित किया गया है और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आटोक्लेव और निपटाया जाना चाहिए। संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए सुइयों का भी निपटान किया जाना चाहिए।
  8. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ इंजेक्शन प्यूपा की ट्रे को कवर करें और इनक्यूबेटर पर लौटें। वायरस के कणों को 3-5 दिनों के लिए प्यूपा के भीतर प्रचार करने की अनुमति दें।
    1. प्यूपा पर दैनिक निरीक्षण करें और बैक्टीरिया या फंगल बिल्डअप को रोकने के लिए किसी भी मृत या सड़ने वाले नमूनों को हटा दें। पेट पर इंजेक्शन साइट पर मेलनाइजेशन के छोटे बिंदु दिखाई दे सकते हैं लेकिन अस्तित्व को प्रभावित नहीं करना चाहिए।
  9. गैर-लक्षित वायरस से संदूषण को कम करने के लिए कॉलोनी स्रोत द्वारा ट्यूबों में प्यूपा का नमूना लेने के लिए, सामग्री को समरूप करने के लिए 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों और भंवर में प्यूपा का नमूना लें। सुनिश्चित करें कि वायरस कण वर्षा और एकाग्रता के लिए तैयार होने तक कोई पूरा प्यूपा नहीं रहता है और ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करता है।

4. वायरस कण एकाग्रता

नोट: इस प्रोटोकॉल लिफाफा वायरस की वसूली के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।

  1. उपयोग करने से पहले सभी सामग्रियों और कंटेनरों को आटोक्लेव करें। इस पूरी प्रक्रिया के दौरान नाइट्राइल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और आंखों की सुरक्षा पहनी जानी चाहिए। शुरुआत से पहले ब्लीच पानी, इथेनॉल और आरएनएएस निष्क्रिय समाधान का उपयोग करके सभी कामकाजी सतहों को निष्फल करें।
    1. 1एक्स टीईएस (ट्रिस-ईडीटीए-नमक) बफर तैयार करें: 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 2 एमएम ईडीटीए, और 150 एमएम एनएसीएल मिलाएं। ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें।
  2. पिघला हुआ प्यूपा को समरूप किया गया और अपकेंद्रित्र बोतलों में स्थानांतरित किया गया। 1x पीबीएस के लगभग तीन खंडों को जोड़ें (उदाहरण के लिए, प्यूपा की एक पूर्ण 50 मिलीलीटर ट्यूब को 1 एक्स पीबीएस के 150 एमएल तक जोड़ें) और वॉल्यूम को पूरी बोतल के बराबर करें।
  3. पहले हाथ से मिलाएं और फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेकर पर रखकर।
  4. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। यदि सेलुलर मलबे रहता है तो आवश्यकतानुसार इस चरण को दोहराएं।
    1. यदि सतह पर तैरनेवाला सतह पर तैरने वाले वसा के बड़े ग्लोब्यूल्स हैं, तो आगे बढ़ने से पहले अलग-अलग बाँझ अपकेंद्रित्र बोतलों में चीज़क्लोथ के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. 24: 1 क्लोरोफॉर्म के 0.3 संस्करणों के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें: आइसोमाइल अल्कोहल समाधान (उदाहरण के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 1 9 0 एमएल + क्लोरोफॉर्म के 57 एमएल: आइसोमाइल अल्कोहल) और उलटा द्वारा मिश्रण करें। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
    सावधानी: त्वचा या आंखों पर क्लोरोफॉर्म के साथ सीधे संपर्क से बचें। हमेशा उचित पीपीई पहनें। संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए सभी क्लोरोफॉर्म कचरे का निपटान किया जाना चाहिए।
  6. एक बर्फ स्नान में या 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में अलग बाँझ 500 एमएल बीकर में सतह पर तैरनेवाला decanting द्वारा प्रत्येक बोतल से जलीय चरण को पुनर्प्राप्त करें। क्लोरोफॉर्म के साथ सतह पर तैरनेवाला दूषित करने से बचने के लिए ध्यान रखें क्योंकि यह शुद्धिकरण प्रक्रिया को और अधिक कठिन बना देगा; थोड़ा सा जलीय चरण खोना बेहतर है।
  7. प्रत्येक बीकर को 200 एमएल की मात्रा तक लाने के लिए आरएनएएसई मुक्त पानी जोड़ें। बीकर को चुंबकीय हलचल प्लेटों पर रखें और मध्यम आकार के हलचल बार में छोड़ दें। प्लेटों को मध्यम-निम्न सेटिंग में हलचल करने के लिए सेट करें।
  8. धीरे-धीरे निरंतर कोमल सरगर्मी के तहत प्रत्येक बीकर में एनएसीएल जोड़ें, प्रत्येक को 2.3% की अंतिम एकाग्रता तक लाएं (उदाहरण के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 200 एमएल प्रति 4.6 ग्राम एनएसीएल)। 7% की अंतिम एकाग्रता तक प्रत्येक बीकर में पॉलीथीन ग्लाइकोल 8000 (पीईजी) जोड़ें (उदाहरण के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 200 एमएल प्रति 14 ग्राम खूंटी)।
  9. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर को कवर करें और पीईजी को भंग करने के लिए बर्फ पर या 1-5 घंटे के लिए ठंडे कमरे में मध्यम-कम गति पर हलचल जारी रखें। सरगर्मी में जितना अधिक समय बिताया जाता है, उतनी ही अच्छी तरह से खूंटी भंग हो जाएगी।
  10. हलचल प्लेटों को बंद कर दें। वायरस कणों और प्रोटीन को अवक्षेपित करने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर या ठंडे कमरे में 1-3 दिनों के लिए कवर बीकर सेते हैं। जितना अधिक समय इनक्यूबेटिंग में बिताया जाता है, उतने ही अधिक कण जो अवक्षेपित होंगे।
  11. एक खूंटी कण गोली को पुनर्प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 एक्स जी पर अलग-अलग साफ अपकेंद्रित्र बोतलों और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक बीकर की सामग्री को स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  12. बोतल के किनारों से खूंटी-कण गोली को सावधानीपूर्वक परिमार्जन करें और धीरे-धीरे छर्रों में टीईएस की छोटी मात्रा (लगभग 10 एमएल प्रति 100 मूल मधुमक्खियों) जोड़कर साफ बीकर के अंदर 1 एक्स टीईएस बफर की न्यूनतम मात्रा में उन्हें फिर से निलंबित करें।
  13. 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में विभाज्य करने से पहले कम से कम दस बार 18 जी सुई के माध्यम से निलंबित गोली पास करें। 4.14 के लिए तैयार होने तक बर्फ पर सभी ट्यूब रखें।
  14. अतिरिक्त खूंटी को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र 2 एमएल ट्यूब। एक 1,000 μL विंदुक का उपयोग कर एक और 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और सभी खूंटी के पूर्ण हटाने सुनिश्चित करने के लिए केन्द्रापसारक कदम दोहराने।
  15. केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों (100 केडीए कटऑफ) का उपयोग करके नए अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला के भीतर शेष कणों को ध्यान में रखें, कमरे के तापमान (आरटी) पर 14,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के कई दौर के माध्यम से 10 मिनट के लिए प्रत्येक लगभग एक पांचवें मूल एकाग्रता (कण-टीईएस समाधान के 10 एमएल केंद्रित कणों के लगभग 2 एमएल तक पहुंचने तक)। फ़िल्टर इकाइयां विभिन्न आकारों में आती हैं; संसाधित किए जा रहे नमूनों की संख्या के लिए सबसे उपयुक्त का चयन करें। इकाइयां जो 15 एमएल आकार के शंक्वाकार ट्यूबों में फिट बैठती हैं, आमतौर पर सबसे उपयुक्त होती हैं।
  16. खूंटी हटाने के एक अंतिम दौर के लिए 5 मिनट के लिए आरटी पर 14,000 एक्स जी पर एक 26 जी हाइपोडर्मिक सुई और अपकेंद्रित्र के माध्यम से गुजरने से केंद्रित कणों को फिर से निलंबित करें। यदि तरल पदार्थ अभी भी बादल है, तो तब तक दोहराएं जब तक कि सभी पीईजी अवक्षेप हटा दिए न जाएं।
  17. चिपचिपा सतह पर तैरनेवाला वांछित मात्रा में विभाज्य और उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

5. वायरस आरएनए निष्कर्षण और मात्रा का ठहराव

  1. किसी भी उपयुक्त आरएनए निष्कर्षण विधि (उदाहरण के लिए, टीआरआईज़ोल आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक के बाद डीएनएएस उपचार) का उपयोग करके पूरे मधुमक्खियों या केंद्रित वायरस कणों से आरएनए निकालें।
  2. आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से चरण 5.1 में उत्पन्न इनोकुलम में वायरस टाइटर्स की मात्रा निर्धारित करें, अधिमानतः एक मानक-वक्र आधारित विधि का उपयोग करके जो मेजबान जीन अभिव्यक्ति 18 पर भरोसा नहीं करता है, हालांकि अन्य तरीकेअनुमानों के लिए भी अनुमति दे सकते हैं।

6. वायरल फीडिंग बायोएसे

  1. फ्रेम संग्रह चरण (6.2) से पहले या 24-घंटे मधुमक्खी उद्भव अवधि (6.3) के दौरान बायोएसे के लिए सभी आवश्यक सामग्री तैयार करें।
    1. एक उचित आकार अपकेंद्रित्र ट्यूब (चित्रा 3) के साथ सभी फीडर छेद प्लग करके बायोएसे (उदाहरण के लिए, ऐक्रेलिक बॉक्स पिंजरों को मापने वाले 10.16 सेमी एक्स 10.16 सेमी एक्स 7.62 सेमी) के लिए आवश्यक मधुमक्खियों की संख्या को आवास देने में सक्षम स्वच्छ पिंजरों या अन्य बाड़ों को तैयार करें। पिंजरों के बीच उपचार निर्धारित करें और यादृच्छिक करें और भविष्य के संदर्भ में आसान भविष्य के संदर्भ के लिए अपने निर्दिष्ट उपचार के साथ प्रत्येक को लेबल करें।
    2. अपने संबंधित पिंजरे और उपचार के साथ व्यक्तिगत मध्यम आकार की वजन नौकाओं को लेबल करके इनोकुलम ट्रे तैयार करें।
    3. विआयनीकृत पानी के साथ सुक्रोज की उचित मात्रा को मिलाकर खिला समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, 30% सुक्रोज समाधान के लिए 1 एल पानी प्रति 300 ग्राम सुक्रोज), सुक्रोज जोड़ने से पहले और बाद में पानी को निष्फल करना सुनिश्चित करें। बाँझ सुक्रोज समाधान को कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन यदि कोई बादल दिखाई देता है तो इसे त्याग दिया जाना चाहिए।
    4. 6.1.3 में उत्पादित फीडिंग समाधानों के साथ आंशिक रूप से 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को भरकर फीडर ट्यूब तैयार करें, उन्हें उलट दें, और थंबटैक के साथ ट्यूब की नोक के चारों ओर 1-2 छेद पोक करें। एक लौ पर गर्म 18 जी हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करके छेद भी पिघलाया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि फीडर ट्यूब कैप्स को बहुत कसकर खराब कर दिया जाता है क्योंकि ढीले-ढाले कैप्स धीमी गति से लीक का कारण बन सकते हैं जो पिंजरे के निवासियों को रात भर डूब जाएंगे।
      नोट: फीडिंग समाधान और फीडर ट्यूब वॉल्यूम को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप आवश्यक रूप से समायोजित किया जा सकता है।
    5. वनस्पति तेल या इसी तरह के चिकना पदार्थ के साथ एक बड़े टब के किनारों को हल्के ढंग से कोटिंग करके नए उभरे मधुमक्खियों के लिए एक संग्रह ग्रहणीय तैयार करें। अलग से, एक ही कोटिंग विधि का उपयोग करके कई छोटे कप तैयार करें।
  2. कम से कम तीन अलग-अलग पित्ती से प्राप्त एक्लोज़न के कगार पर शहद मधुमक्खी ब्रूड के फ्रेम का चयन करें और निकालें। उचित रूप से वृद्ध मधुमक्खियां कंघी सेल कैपिंग के नीचे पूरी तरह से रंजित वयस्कों से मिलती जुलती हैं। चल रहे उद्भव का एक निश्चित संकेत सेल निवासियों को धीरे-धीरे अपना रास्ता चबाने और / या हाल ही में खाली कोशिकाओं को मोम कैपिंग के साथ विशेषता दांतेदार चबाने के निशान के साथ देख रहा है।
    नोट: आवश्यक फ्रेम की सटीक मात्रा प्रयोग के आकार, प्रति फ्रेम उभरते ब्रूड की मात्रा और वर्ष के समय पर निर्भर करेगी। एक मानक लैंगस्ट्रोथ गहरे फ्रेम में प्रति पक्ष ~ 3,000 कंघी कोशिकाएं होती हैं; ज्यादातर कैप्ड प्यूपा युक्त एक फ्रेम, कुछ देखे गए उभरते हुए आसानी से 24 घंटे में 400+ मधुमक्खियों का उत्पादन कर सकता है। आवश्यकतानुसार पूरे मौसम में समायोजित करें।
  3. उभरने वाले बक्से में फ्रेम रखने और उन्हें एक छत्ते (34 डिग्री सेल्सियस और 50% आरएच) की आंतरिक स्थितियों से मेल खाने वाले इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने से पहले सभी वयस्क मधुमक्खियों को ब्रश करें। मधुमक्खियों को 24 घंटे के लिए उभरने दें।
  4. इनक्यूबेटर से उद्भव बक्से निकालें और संग्रह टब में सभी नए उभरे मधुमक्खियों को ब्रश करें। किसी भी बाद के ब्रशिंग में गलत तरीके से वृद्ध मधुमक्खियों को शामिल करने से रोकने के लिए उद्भव बक्से से सभी मधुमक्खियों को हटाना सुनिश्चित करें। उड़ने में सक्षम कोई भी मधुमक्खी 24 घंटे पहले > उभरी और इसे बायोएसे से बाहर रखा जाना चाहिए।
  5. किसी भी व्यक्तिगत कॉलोनी से छत्ते आनुवंशिक प्रभाव को कम करने के लिए संग्रह टब में मधुमक्खियों को धीरे-धीरे मिलाकर (वे इस उम्र में डंक नहीं कर सकते) द्वारा नए उभरे मधुमक्खियों के एक समरूप मिश्रण का उत्पादन करें। विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए, कॉलोनी स्रोत के लिए अन्य व्यवस्थाएं वांछनीय हो सकती हैं।
  6. 35 अलग-अलग मधुमक्खियों की गणना करें, सामग्री को ऐक्रेलिक पिंजरे में स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक को एक ही ग्रीस किए गए कप में रखें। वैकल्पिक रूप से, गलत गणना त्रुटियों से बचने के लिए मधुमक्खियों के छोटे गुणकों को कई ग्रीस किए गए कप (उदाहरण के लिए, प्रत्येक 7 मधुमक्खियों के 5 कप) में अलग करना आसान हो सकता है। उपयोग की जाने वाली मधुमक्खियों की संख्या को आवश्यकताओं और अनुप्रयोगों के आधार पर भिन्न किया जा सकता है।
  7. मधुमक्खियों के पिंजरों को इनक्यूबेटर (34 डिग्री सेल्सियस और 50% आरएच) में स्थानांतरित करें, जिससे किसी भी संभावित माइक्रोक्लाइमेट प्रभाव को कम करने के लिए 6.1.1 में बनाए गए यादृच्छिक प्लेसमेंट ऑर्डर का पालन करना सुनिश्चित हो सके।
  8. शुरू करने से पहले ब्लीच पानी, इथेनॉल और आरएनएएस निष्क्रिय समाधान के साथ सभी सतहों और पिपेट की सफाई करके वायरस के काम के लिए कार्यक्षेत्र तैयार करें। वायरस कणों को संभालने के दौरान नाइट्राइल दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें।
  9. केंद्रित वायरस कणों (चरण 4.17) की एक उचित मात्रा को पिघलाकर और एक बाँझ कंटेनर में पर्याप्त सुक्रोज समाधान (चरण 6.1.3) के साथ अच्छी तरह से मिश्रण करके वांछित एकाग्रता के वायरस इनोकुलम को तैयार करें। 35 मधुमक्खियों के पिंजरों के लिए, प्रत्येक को इनोकुलम के 600 μL की आवश्यकता होती है। सीरियल कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है यदि वांछित वायरस एकाग्रता 0.1% पर या उससे नीचे है।
    1. उदाहरण के लिए, 40 पिंजरों को शामिल करने वाले एक प्रयोग जिसमें सभी को 1% वायरस इनोकुलम की आवश्यकता होती है, को 24 एमएल वायरस समाधान की आवश्यकता होगी, जिसे सुक्रोज समाधान के 23.76 एमएल के साथ केंद्रित वायरस कणों के 240 μL के संयोजन से बनाया जा सकता है। प्रारंभिक मात्रा में लगभग 15% ओवरएज को शामिल करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि चिपचिपा तरल पदार्थों के साथ कुछ नुकसान की उम्मीद की जानी चाहिए।
  10. उपचार प्रकार द्वारा क्रमबद्ध 6.1.2 में तैयार इनोकुलम ट्रे को बाहर रखें और प्रत्येक ट्रे पर उपयुक्त इनोकुलम के 600 μL को पिपेट करें।
    1. ध्यान से इनोकुलम ट्रे को उनके संबंधित पिंजरों में डालें, ध्यान रखें कि गलती से किसी भी मधुमक्खियों को रिहा न करें। मधुमक्खियों को स्कैन करने और स्थानांतरण प्रक्रिया में मरने वाले किसी भी व्यक्ति को बदलने के लिए इस अवसर को लें।
  11. 6.1.4 में तैयार उचित फीडर ट्यूबों को डालने वाले शीर्ष फीडर छेद को अवरुद्ध करने वाले अपकेंद्रित्र ट्यूबों को हटाने से पहले इनोकुला (लगभग 12-14 घंटे) की पूरी खपत के लिए अनुमति दें। यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि पिंजरे में मधुमक्खियां आबादी में समान रूप से इनोकुलम साझा करती हैं। सुक्रोज समाधान विज्ञापन लिबिटम प्रदान किया जाता है और प्रयोग के दौरान ट्यूबों को आवश्यकतानुसार फिर से भरा जाना चाहिए।
  12. प्रत्येक प्रयोग के पहले 72 घंटे के लिए 12 घंटे के अंतराल पर प्रत्येक पिंजरे के भीतर मृत्यु दर को रिकॉर्ड करें, जिसके बाद रिकॉर्डिंग को 24 घंटे के अंतराल पर स्थानांतरित करें। पिंजरों से मृत मधुमक्खियों निकालें ताकि पिंजरे के दरवाजे को फिसलकर भविष्य की गिनती में आसानी को बढ़ाया जा सके, जो संदंश की एक जोड़ी तक पहुंचने और मृत मधुमक्खियों को बाहर निकालने के लिए पर्याप्त है। वायरल क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए पिंजरों के बीच एक अल्कोहल लैंप पर संदंश को निष्फल करना सुनिश्चित करें।
  13. वायरल टिटर माप (5.1-5.2) के लिए नमूना मधुमक्खियों को बेतरतीब ढंग से प्रत्येक पिंजरे के भीतर लाइव नमूनों का चयन करके और उन्हें सूखी बर्फ पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखकर। आमतौर पर, पिंजरे को कम किए बिना किसी भी समय बिंदु पर वायरल टिटर माप का उत्पादन करने के लिए तीन मधुमक्खियां पर्याप्त होती हैं।
  14. जब तक आवश्यक हो तब तक नियमित मृत्यु दर माप जारी रखें।

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Representative Results

प्यूपल इंजेक्शन और वायरल निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल (आंकड़े 1) का सफलतापूर्वक पालन करने से बड़ी मात्रा में वायरस कणों का उत्पादन करना चाहिए। हालांकि, कई समय बिंदुओं पर विभिन्न प्रकार की कालोनियों से प्राप्त प्यूपा का नमूना लेना और इंजेक्शन लगाना कम संदूषण के साथ लक्ष्य वायरस प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम करता है। गतिशीलता जिसके द्वारा वायरस शहद मधुमक्खी के भीतर एक दूसरे के साथ दोहराते हैं और बातचीत करते हैं, अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है; पहले से मौजूद संक्रमण की संभावना के साथ युग्मित, इस बात की कोई गारंटी नहीं है कि इंजेक्शन (वांछित) वायरस किसी भी प्यूपा में प्रमुख हो जाएगा, भले ही प्यूपा को एक ही मूल कॉलोनी से नमूना दिया गया हो। चित्रा 4 वायरल अनुपात की संभावित सीमा को दर्शाता है जो कोई निम्नलिखित निष्कर्षण को देखने की उम्मीद कर सकता है। चार प्रदर्शित कालोनियां एक बड़े वायरस कटाई प्रयास के सबसेट का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसमें प्रत्येक प्यूपा को शुरू में ~ 95% इजरायली तीव्र पक्षाघात वायरस (आईएपीवी) इनोकुलम के साथ इंजेक्ट किया गया था। यद्यपि इन निष्कर्षणों में शामिल 16 कॉलोनी नमूनों में से 10 में अत्यधिक शुद्ध आईएपीवी (> 95%) शामिल थे, जिनमें से कुछ > 99% (उदाहरण के लिए, कॉलोनी 1), अन्य नमूने उनके आईएपीवी अनुपात (जैसे, कॉलोनी 2-3) में भिन्न थे, कुछ में विकृत विंग वायरस (डीडब्ल्यूवी) (उदाहरण के लिए, कॉलोनी 4) जैसे अन्य वायरस का भी प्रभुत्व था।

तालिका 1 आरटी-क्यूपीसीआर थ्रेशोल्ड चक्र(सी टी) मूल्यों (जिस बिंदु पर एक पीसीआर लक्ष्य पता लगाने की दहलीज तक पहुंचता है) और कुल वायरस जीनोम समकक्ष (जीई) प्रति 100 एनजी आरएनए के रूप में चित्रा 4 में दिखाए गए चार वायरस (बीक्यूसीवी, डीडब्ल्यूवी, आईएपीवी, एसबीवी) के प्रवर्धन स्तर के लिए अतिरिक्त संदर्भ प्रदान करता है। सीटी मूल्यों का उपयोग अनुपात के भविष्यवक्ता के रूप में किया जा सकता है, लेकिन जीई मूल्यों को मानक-वक्र आधारित विधि17 का उपयोग करके गणना करने की आवश्यकता है। ध्यान दें कि उत्पादित कणों (यानी, जीई) की वास्तविक मात्रा संसाधित प्यूपा की संख्या और निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान फ़िल्टरिंग स्ट्रिंगेंसी पर निर्भर है।

वायरस कण तैयारी (प्रवर्धित इनोकुलम) को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और उन्हें विभाज्य करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यदि वे कई फ्रीज-पिघलना चक्र18 के अधीन होते हैं तो वे काफी नीचा दिखाएंगे। इसके अतिरिक्त, खुराक-प्रतिक्रिया परख हमेशा प्रयोग से पहले आयोजित की जानी चाहिए, क्योंकि बाहरी कारकों (हाइव जेनेटिक्स, मधुमक्खी स्वास्थ्य, आदि) की भीड़ अत्यधिक परिवर्तनशील वायरल प्रतिक्रिया का कारण बन सकती है। प्रयोगात्मक पिंजरों (चित्रा 3) से व्युत्पन्न डेटा का उपयोग करते हुए, चित्रा 5 शहद मधुमक्खियों की खुराक-प्रतिक्रिया अस्तित्व घटता की तुलना करके इस तरह की परिवर्तनशीलता को दर्शाता है, दो अलग-अलग वर्षों के दौरान एक ही आईएपीवी कणों को खिलाया जाता है। समान परीक्षण मापदंडों के बावजूद, एक ही वायरल इनोकुला और 1% से 0.01% आईएपीवी तक की परीक्षण सांद्रता सहित, 2018 (चित्रा 5 ए) और 2019 (चित्रा 5 बी) में किए गए परीक्षणों ने नियंत्रण उपचार के अलावा सभी में काफी अलग-अलग उत्तरजीविता प्रतिक्रियाओं का उत्पादन किया, जिसे इसके सुक्रोज इनोकुलम में कोई वायरस नहीं मिला। ध्यान दें कि, यदि वांछित है, तो एलडी50 गणना ओं को इस बिंदु पर अधिक सटीक मृत्यु दर माप43 प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन यह आमतौर पर आवश्यक नहीं है क्योंकि अनुमान आम तौर पर पर्याप्त होते हैं। 2018 में, 1% खुराक के परिणामस्वरूप 72 घंटे के बाद संक्रमण (एचपीआई) में लगभग 50% जीवित रहने के परिणामस्वरूप, जिससे यह उस वर्ष किए गए अधिकांश वायरल पिंजरे प्रयोगों के लिए डिफ़ॉल्ट एकाग्रता बन गया। हालांकि, उसी खुराक ने 2019 में एक ही समय बिंदु पर कुल मृत्यु दर के पास हासिल किया, और नतीजतन, उस वर्ष किए गए अधिकांश वायरल पिंजरे प्रयोगों को इसके बजाय 0.01% आईएपीवी इनोकुलम प्राप्त हुआ। यह काफी कम एकाग्रता 2018 में 1% आईएपीवी इनोकुलम के रूप में मृत्यु दर के समान स्तर तक पहुंच गई, जबकि 100 गुना कम वायरस कणों का भी उपयोग किया गया।

इन आंकड़ों को चित्रा 3 में एक आरेख के समान पिंजरों का उपयोग करके बायोएसेज के साथ उत्पादित किया गया था। शीर्ष और पक्ष में फीडर छेद आसान आहार नियंत्रण की अनुमति देते हैं और स्लाइडिंग पिंजरे का दरवाजा पिंजरे के वातावरण से वस्तुओं को जोड़ना या हटाना आसान बनाता है, जैसे कि इनोकुलम ट्रे या मृत मधुमक्खियां। हालांकि, सामान्यीकृत वायरल परख प्रोटोकॉल इन प्रकार के पिंजरों और न ही आहार विकल्पों तक सीमित नहीं है और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: लार्वा आत्म हटाने प्रोटोकॉल के दौरान विभिन्न चरणों की प्रतिनिधि छवियों। (ए) उदाहरण लार्वा द्रव्यमान जो रातोंरात आत्म-हटाने की अवधि (1.6) के बाद अपेक्षित था। विकास ट्रे (1.6.3) (सी, डी) वायरल इंजेक्शन (1.9) के लिए तैयार सफेद आंख प्यूपा पर एक दूसरे से अलग स्थान पर। भूरे रंग के धब्बे सूखे लार्वा फ्रैस होते हैं, जिन्हें हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: उदाहरण इंजेक्टर उपकरण एक बहु-डिस्पेंसर टिप के साथ एक हाइपोडर्मिक सुई के संयोजन से बनाया गया है। सुई और टिप तरल चिपकने वाला का उपयोग करके लगातार 1 μL द्रव इंजेक्शन वितरित करने के लिए शामिल हो गए थे जब एक दोहराए जाने वाले पाइपटर से जुड़ा हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: उदाहरण पिंजरे वायरस बायोएसे में इस्तेमाल किया। परीक्षण की अवधि के दौरान फीडर छेद के बावजूद सुक्रोज समाधान और पराग को विज्ञापन लिबिटम प्रदान किया गया था। वायरस इनोकुला को पिंजरे के नीचे से डाली गई ट्रे का उपयोग करके आसानी से वितरित किया जा सकता है। ध्यान दें कि पिंजरे के प्रकार और फीडर सामग्री को प्रयोगात्मक मापदंडों के अनुरूप आवश्यक रूप से समायोजित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: चार नमूना कालोनियों से वायरल तैयारी में औसत कुल वायरस भार और अनुपात। वायरस भार को आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा ब्लैक क्वीन सेल वायरस (बीक्यूसीवी) + विकृत विंग वायरस (डीडब्ल्यूवी) + इजरायली तीव्र पक्षाघात वायरस (आईएपीवी) + सैकब्रूड वायरस (एसबीवी) जीनोम समकक्ष (जीई) के रूप में 100 एनजी आरएनए में मापा गया था। प्रत्येक नमूना कॉलोनी में मूल रूप से आईएपीवी के साथ इंजेक्ट किए गए 150+ होमोजेनाइज्ड प्यूप शामिल थे और प्यूपल वायरस इंजेक्शन प्रोटोकॉल से उत्पन्न वायरस अनुपात की विशिष्ट सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: शहद मधुमक्खी बायोएसे पिंजरों की खुराक-प्रतिक्रिया उत्तरजीविता घटता है। 2018 (ए) और 2019 (बी) दोनों के पिंजरों को आईएपीवी के साथ टीका लगाया गया था और परीक्षण की अवधि के दौरान 30% सुक्रोज समाधान विज्ञापन लिबिटम खिलाया गया था। उपचार 10-2 से 10-4 के साथ आईएपीवी इनोकुला सांद्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं जो 30% सुक्रोज समाधान में मिश्रित 1% से 0.1% आईएपीवी कण तैयारी को दर्शाता है; सुक्रोज इनोक्यूलेशन को नियंत्रित करने में कोई वायरस नहीं होता है। एन = 2018 में कुल पिंजरों = 56; एन = 2019 में कुल पिंजरों 77। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: औसत थ्रेसहोल्ड चक्र (सीटी) मूल्यों और जीनोम समकक्ष प्रति 100 एनजी आरएनए वायरस मिश्रण में चार नमूना कालोनियों से चार वायरल तैयारी में। प्रत्येक नमूना कॉलोनी में प्यूपल वायरस इंजेक्शन प्रोटोकॉल से उत्पन्न 150+ होमोजेनाइज्ड प्यूपा होते हैं। प्रत्येक वायरस के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा वायरस का पता लगाया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां हमने लार्वा संग्रह और वायरस प्रसार, निष्कर्षण और एकाग्रता, साथ ही पिंजरे-खिला प्रयोगों के रूप में वायरल उपचार सहित वायरस प्रवर्धन और इनोकुलम स्टॉक तैयारी प्रक्रिया के हर चरण का विवरण देने वाले तरीकों को रेखांकित किया है। ये विधियां अर्ध-शुद्ध वायरस कणों (चित्रा 4) के उत्पादन के लिए अनुमति देती हैं, जिनकी प्रभावशीलता को वयस्कों के लिए घातक वायरस के लिए खुराक-प्रतिक्रिया मृत्यु दर परीक्षण द्वारा लगातार मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 5)। या विकृति विज्ञान की पुष्टि के बाद, उत्पन्न कणों का उपयोग तब शहद मधुमक्खियों और शहद मधुमक्खी वायरस के बीच बातचीत को स्पष्ट करने के लिए बायोएसेज में किया जा सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल के सबसे विशिष्ट लाभों में से एक यह है कि प्रत्येक को आसानी से एक बड़ी मात्रा में बढ़ाया जाता है, चाहे वह प्यूपा काटा गया हो, कणों का उत्पादन किया गया हो, या बायोएसेज का प्रदर्शन किया गया हो। प्यूपल छांटना विधियों33 का उपयोग करके, कोई भी प्रति घंटे ~ 100 प्यूपा को हटाने की उम्मीद कर सकता है, हालांकि यह संख्या प्रवीणता के साथ स्केल करेगी। हालांकि, लार्वा आत्म-हटाने की विधि, यहां रिपोर्ट की गई है, जबकि विभिन्न नियोजन और शेड्यूलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है, मधुमक्खियों पर तुलनात्मक रूप से कम मैनुअल प्रयास और कम यांत्रिक तनाव को शामिल करते हुए रात भर में हटाए गए मधुमक्खियों की संख्या को आसानी से 10-20 गुना उत्पन्न कर सकती है।

इस विधि की मुख्य सीमा यह है कि यह गारंटी देने का कोई तरीका नहीं है कि स्व-हटाए गए लार्वा पहले वरोआ-संक्रमित नहीं थे। नियमित घुन उपचार और स्रोत पित्ती की निगरानी इस जोखिम को कम कर सकती है, लेकिन कुछ लार्वा में अभी भी कुछ स्तर का वारोआ परजीवीकरण हो सकता है। मैन्युअल रूप से व्यक्तिगत रूप से प्यूपा को हटाने से, हालांकि, उपयोगकर्ता को यह देखने की अनुमति मिलती है कि क्या किसी दिए गए प्यूपा के सेल में कोई घुन मौजूद है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि स्व-हटाने की प्रक्रिया लार्वा के भोजन की मांग करने वाले व्यवहार पर निर्भर करती है, इन लार्वा वाले फ्रेम को सामान्य रूप से होने वाले अंतिम भोजन से पहले हटा दिया जाना चाहिए। श्रमिकों द्वारा प्रावधान की इस कमी के कारण ही लार्वा अपनी कोशिकाओं से क्रॉल करते हैं। इसलिए, इस विधि से व्युत्पन्न प्यूपा लार्वा की तुलना में पोषण संबंधी तनाव की एक बहुत ही छोटी खिड़की का अनुभव करता है जो एक कॉलोनी के अंदर पूरी तरह से विकसित हुआ और थोड़ा छोटा दिखाई दे सकता है। यह फ्रेम पर मौजूद कोहोर्ट में सबसे कम उम्र के लार्वा में विशेष रूप से उल्लेखनीय है; क्योंकि रानी ने 24 घंटे की खिड़की पर अंडे दिए हैं, इसलिए ये लार्वा आनुपातिक रूप से अधिक खिलाने का समय गायब हैं। ये आमतौर पर मैन्युअल छांटना द्वारा हटाए गए लोगों की तुलना में उनके बहुत छोटे आकार के लिए प्यूपेशन के दौरान स्पष्ट रूप से उल्लेखनीय होते हैं। हालांकि, स्व-निष्कासन द्वारा उत्पादित लार्वा की मात्रा उनके कम व्यक्तिगत बायोमास के लिए क्षतिपूर्ति से अधिक है। इसके अलावा, मैनुअल छांटना विधि भी प्यूपा के लिए पर्याप्त यांत्रिक तनाव पैदा कर सकती है क्योंकि उन्हें उनकी कोशिकाओं से खींचा जाता है। यदि किसी भी विधि का उपयोग एक प्रयोग के हिस्से के रूप में किया जाना है, और न केवल वायरस कणों का उत्पादन करने के लिए, उचित नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

निष्कर्षण विधि के बावजूद, वायरस प्रसार प्रोटोकॉल प्यूपा का उपयोग करके बड़ी मात्रा में वायरस कणों को उत्पन्न कर सकता है, जो शहद मधुमक्खी वायरल प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण करते समय अन्य वर्तमान में अभ्यास किए गए वायरस इनोक्यूलेशन विधियों 35,36,37 द्वारा प्रेरित परिवर्तनशीलता को कम करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल को पिकोरनावायरल्स (जैसे, इजरायली तीव्र पक्षाघात वायरस, विकृत विंग वायरस) के क्रम में गैर-लिफाफे वाले वायरस का उपयोग करके अनुकूलित और परीक्षण किया गया था। लिफाफे वाले वायरस44 के साथ काम करते समय वायरल कणों को अलग करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का पालन किया जाना चाहिए। किसी न किसी सन्निकटन के रूप में, वायरस कटाई के प्रयास में शामिल 16 नमूनों में से प्रत्येक (जिसमें चित्रा 4 की 4 कॉलोनियां शामिल थीं) 200-300 इंजेक्शन प्यूपा से उत्पन्न हुई थीं और केंद्रित वायरस कण तैयारी के 2-2.5 एमएल के बीच उपज हुई थी। 0.1% की वायरस इनोकुलम एकाग्रता और एक मानक 35-मधुमक्खी पिंजरे को मानते हुए, 16 वायरस की तैयारी में से प्रत्येक 3,300-4,200 पिंजरों के लिए पर्याप्त कण प्रदान करेगा। संक्रामक सामग्री का यह अधिशेष प्रयोगात्मक प्रतिबंधों को कम करता है और उच्च-थ्रूपुट बायोएसेज को सक्षम बनाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यद्यपि वायरस कण ध्यान -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर महीनों या वर्षों तक व्यवहार्य रह सकता है, यह धीरे-धीरे संक्रामकता में कमी कर सकता है, भले ही कुछ फ्रीज-पिघलना चक्रों के अधीन हो। इसलिए, वायरल तैयारी स्टॉक को छोटे एलिकोट में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है, जिनमें से कई का उपयोग वायरल टिटर्स को मापने और प्रयोग के समय उपचार खुराक को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चित्रा 5 में प्रदर्शित अंतर-वर्ष परिवर्तनशीलता, आवधिक खुराक-प्रतिक्रिया परीक्षण की आवश्यकता को और मजबूत करती है, जिससे वायरस व्यवहार्यता में अप्रत्याशित नुकसान की संभावना कम हो जाती है।

पिंजरे बायोएसेज में स्वयं भी सीमाएं हैं, या कम से कम ध्यान में रखने के लिए आवश्यक चेतावनी, प्राथमिक एक पिंजरे बायोएसे पर्यावरण (चित्रा 3) की कृत्रिम प्रकृति है। मधुमक्खियों को बाड़ों में समूहीकृत करना व्यक्तिगत स्तर से परे वायरल परीक्षण की अनुमति देता है; पिंजरे मधुमक्खी के बजाय प्रयोगात्मक इकाई बन जाता है। यद्यपि यह अलगाव में इलाज किए जा रहे एकल मधुमक्खी की तुलना में एक वास्तविक कॉलोनी के समान है, फिर भी यह एक यथार्थवादी छत्ता वातावरण से बहुत दूर है। रानी और ब्रूड फेरोमोन, विभिन्न उम्र की मधुमक्खियों और अन्य संकेतों सहित सामाजिक वातावरण से हटा दिया गया, ये मधुमक्खियां पूर्ण आकार की कॉलोनी के रूप में प्रतिक्रिया नहीं दे सकती हैं। हालांकि, ये मुख्य रूप से पिंजरे प्रणाली का उपयोग करके बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए विचार हैं। पिंजरे वायरल बायोएसेज से एकत्र किए गए परिणामों को मुख्य रूप से आधारभूत सूचना स्थापना के रूप में माना जाना चाहिए जिसका उपयोग भविष्य के वायरस परीक्षण निर्णयों को उपयोगकर्ता द्वारा वांछित के रूप में अधिक क्षेत्र-यथार्थवादी सेटिंग में स्केल करने के लिए किया जा सकता है।

यहां वर्णित तरीके शहद मधुमक्खी वायरल परख में उपयोग के लिए वायरस कणों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करते हैं। इस तरह के परख पहले से ही बहु-वायरस संक्रमण सहित शहद मधुमक्खी-वायरस इंटरैक्शन के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए लागू किए गए हैं और आहार की गुणवत्ता और पोषण की खुराक वायरल संक्रमण 11,18,45,46 के चेहरे में उत्तरजीविता को कैसे प्रभावित करती है। उन्हें कॉलोनी-व्यापी संक्रमण प्रयोगों11,47 में उपयोग के लिए और व्यवहार 47 और जीन अभिव्यक्ति48 पर संक्रमण के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया है। कुल मिलाकर, ये विधियां उन उपकरणों में एक आधार रेखा प्रदान करती हैं जिनका उपयोग शहद मधुमक्खी वायरस इनोकुला का उत्पादन और मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

जूलिया फाइन को प्रोटोकॉल निर्माण प्रक्रिया के दौरान उनके विचारों और चर्चा के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही साथ संपादन के दौरान उनकी सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ कैसोंड्रा वर्नियर। इन सामग्रियों ने उन परियोजनाओं की दिशा में योगदान दिया जिन्हें अनुदान आईडी 549025 के तहत फाउंडेशन फॉर फूड एंड एग्रीकल्चर रिसर्च द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

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References

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