Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beredning av virusberikad inokulum för oral infektion av honungsbin (Apis mellifera)

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61725
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

Summary

Här beskriver vi två protokoll: för det första för att föröka, extrahera, rena och kvantifiera stora mängder honungsbi icke-omslutna viruspartiklar, inklusive en metod för att ta bort honungsbipuppor och för det andra för att testa effekterna av virusinfektion med hjälp av en mycket repeterbar, högkapacitetsburbioassay.

Abstract

Honungsbin är av stor ekologisk och jordbruksbetydelse runt om i världen men utsätts också för en mängd olika tryck som negativt påverkar bihälsan, inklusive exponering för virala patogener. Sådana virus kan orsaka en mängd olika förödande effekter och kan ofta vara utmanande att studera på grund av flera faktorer som gör det svårt att skilja effekterna av experimentella behandlingar från redan existerande bakgrundsinfektion. Här presenterar vi en metod för att massproducera stora mängder viruspartiklar tillsammans med en bioanalys med hög genomströmning för att testa virusinfektion och effekter. Nödvändigt av den nuvarande bristen på en kontinuerlig, virusfri honungsbicelllinje, förstärks virala partiklar in vivo med hjälp av honungsbipuppor, som extraheras från bikupan i stora volymer med minimalt stressande metodik. Dessa viruspartiklar kan sedan användas i bioassays av honungsbiburar för att testa inokula livskraft, liksom olika andra virusinfektionsdynamiker, inklusive interaktioner med näring, bekämpningsmedel och andra patogener. En stor fördel med att använda sådana partiklar är att det kraftigt minskar risken för att införa okända variabler i efterföljande experiment jämfört med nuvarande alternativ, såsom infektion via infekterad bihemolymf eller homogenat, även om man fortfarande bör vara försiktig när man köper bina, för att minimera bakgrundsviruskontaminering. Buranalyserna är inte en ersättning för storskaliga, fältrealistiska experiment som testar virusinfektionseffekter på koloninivå, utan fungerar istället som en metod för att fastställa baslinjevirussvar som i kombination med de halvrena viruspartiklarna kan fungera som viktiga verktyg för att undersöka olika dimensioner av honungsbi-virus fysiologiska interaktioner.

Introduction

Honungsbin (Apis mellifera) spelar en avgörande roll i det moderna globala jordbrukslandskapet men lider för närvarande av en kombination av biotiska och abiotiska stressfaktorer, inklusive exponering för bekämpningsmedel, dåligt foder, parasiter och patogener 1,2. En av de viktigaste patogenerna av oro är virus, av vilka många vektoriseras av en annan av de stora honungsbistressorerna, den parasitiska Varroa-mitten (Varroa destructor). Dessa virus kan orsaka en rad negativa effekter hos honungsbin inklusive minskad överlevnad av kullar, utvecklingsdefekter och förlamning som kan leda till total bikupakollaps både före och efter övervintringsperioder 3,4,5. Även om det har skett lovande framsteg i utvecklingen av teknik som används för att bekämpa virusinfektion 6,7,8,9, är dynamiken genom vilken många virus sprider sig, sprider sig och interagerar inom ett honungsbi eller koloni fortfarande dåligt förstådd 5,10 . Att förstå den grundläggande biologin för honungsbi och virusinteraktioner och deras relationer med andra miljöfaktorer är avgörande för att utveckla effektiva virushanteringstekniker.

Att studera interaktioner mellan honungsbin och virus innebär dock utmaningar med många kända och okända faktorer som komplicerar processen. Dessa inkluderar interaktioner med diet11,12, exponering för bekämpningsmedel13 och biets genetiska bakgrund14,15. Även när man fokuserar på enbart virusinfektion är komplikationer vanliga eftersom honungsbipopulationer, både hanterade och vilda, alltid har en viss grad av bakgrundsvirusinfektion, men ofta utan att uppvisa akuta symtom 16,17, och effekterna av virusinfektion är inte väl förstådda18. Detta har gjort studien av honungsbiviruseffekter svår att skilja åt.

Många studier av honungsbivirus har använt indicievirusinfektioner för att leta efter interaktioner med andra stressfaktorer och observera hur bakgrundsinfektioner förändras med andra behandlingar 12,19,20,21. Även om detta tillvägagångssätt har varit framgångsrikt för att identifiera viktiga effekter, särskilt att upptäcka hur bekämpningsmedel eller dietbehandlingar påverkar virusnivåer och replikation, är ympning med en virusbehandling av känt innehåll och koncentration avgörande för experimentell testning av virusinfektionsdynamik. Ändå kan det också innebära utmaningar att skilja experimentell behandling från bakgrundsinfektion. I fältstudier har forskare differentierat stammar av deformerat vingvirus (DWV) för att ge bevis för virusöverföring från honungsbin till humlor22, men att använda detta tillvägagångssätt skulle vara svårt inom honungsbin ensam. Virusinfektiösa kloner är ett kraftfullt verktyg, inte bara för att spåra infektion 23,24,25 utan för omvända genetiska studier av honungsbivirus och för virus-värdinteraktionsforskning 26,27,28. Men i de flesta fall krävs fortfarande smittsamma kloner för att uppfylla infektionscykeln inuti celler för att producera partiklar. Sådana partiklar föredras som inokula för experimentella behandlingar eftersom deras smittsamhet är högre än det nakna virala RNA och ympning med inkapslade genom efterliknar en naturlig infektion.

Produktionen av rena, oförorenade honungsbivirus inokula (virusstammar av vild typ eller sådana som härrör från smittsamma kloner) utgör också utmaningar. Dessa beror främst på svårigheterna att få en pålitlig, kontinuerligt replikerande, virusfri honungsbicelllinje för att producera rena stamvirus29,30. Medan vissa cellinjer har producerats förblir dessa system ofullkomliga; ändå finns det hopp om att en livskraftig cellinje kan produceras29, vilket skulle möjliggöra finare kontroll av virusproduktion och utredning. Tills en sådan linje blir allmänt tillgänglig kommer de flesta virusproduktionsprotokoll att fortsätta att förlita sig på användningen av in vivo-virusproduktion och rening 18,31,32,33,34. Dessa metoder innebär att identifiera och rena viruspartiklar av intresse (eller producera en smittsam klon) och använda dem för att infektera honungsbin, vanligtvis som puppor. Pupporna injiceras med målviruset och offras sedan, och ytterligare partiklar extraheras och renas. Men eftersom inga bin är virusfria till att börja med finns det alltid en viss grad av förorening från spår av andra virus i något sådant koncentrat, och därför måste stor försiktighet iakttas vid val av bin med låg sannolikhet för bakgrundsinfektioner. Vidare är metoder för att ta bort pupporna från kamcellerna för användning i dessa protokoll33 mycket arbetsintensiva och kan inducera stress hos bin, vilket begränsar produktionen med dessa medel18,32. Här redovisar vi en alternativ metod som möjliggör storskaligt avlägsnande av larver med lite arbete och mindre mekanisk belastning på bina.

När puppor har erhållits och injicerats med startvirusets inokulum måste de inkuberas för att ge viruset tid att replikera. Därefter kan producerade viruspartiklar bearbetas till en form som kan användas för att infektera experimentella bin. Det finns flera enkla metoder för att uppnå detta, inklusive att använda ett grovt homogenat35,36 eller hemolymf genererat från virusinfekterade bin som en källa till infektion37. Dessa metoder är effektiva men har större chans att införa okända variabler från bakgrundssubstratet (t.ex. andra faktorer i de döda bihomogenaten). Dessutom är det önskvärt att koncentrera partiklarna om ett experiment kräver att man ger en stor, känd dos av ett virus på kort tid. För bättre kontroll är det därför att föredra att använda metoder som möjliggör en viss nivå av rening och koncentration av viruspartiklarna. I allmänhet kommer en serie utfällnings- och centrifugeringssteg att resultera i avlägsnande av nästan allt möjligt icke-målvirusmaterial33.

Efter att ha producerat denna koncentrerade inokulum är det fördelaktigt att kvantifiera virustitrarna (qPCR) och karakterisera den med in vivo bioassays för att testa dess livskraft och förmåga att orsaka dödlighet, samt att bekräfta att ökade virustitrar erhålls efter infektion. Detta kan uppnås genom injektionsexperiment (antingen i puppor eller vuxna) eller utfodringsexperiment (i larver eller vuxna). Även om alla dessa tillvägagångssätt är möjliga är utfodring av grupper av vuxna bin i en bur ofta den snabbaste och enklaste. Buranalysmetoden används också i stor utsträckning för att testa olika andra behandlingar på bin inklusive bekämpningsmedelstoxicitet38, äggstocksutveckling39 och näringspåverkan på beteende40,41 och kan därför utgöra en bra grund för experiment som kopplar virusinfektion med andra faktorer42.

Här beskriver vi en pålitlig metod för att producera stora mängder halvrena, högt berikade viruspartiklar utan att använda en dyr ultracentrifug, inklusive en metod för att ta bort puppor som minskar arbetskraft och mekanisk stress på bina och en mycket repeterbar bioassay med hög kapacitet för att testa virusinfektion och effekter. Genom att noggrant kontrollera renheten hos den virala inokula kan utredarna minska variationen i honungsbiets virala svar i förhållande till andra virala ympningsmetoder. Dessutom kan bioassay screena för virala effekter på en liten gruppnivå med hjälp av mycket repeterbara experimentella enheter innan de skalas till fältrealistiska inställningar, vilket är mycket mer arbetsintensivt att hantera. I kombination ger dessa två metoder de nödvändiga verktygen för studier som kan bidra till att förbättra vår övergripande förståelse av fysiologiska interaktioner mellan honungsbin och virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Massbiutvinningsalternativ 1: larv självborttagning

  1. Bura en honungsbidrottning på en tom, utdragen Langstroth-ram och återför henne till sin koloni. Låt drottningen lägga ägg på denna ram i 24 timmar.
    1. Kontrollera ramen efter 24 timmar för att säkerställa att de flesta kamcellerna innehåller nylagda ägg. Beroende på drottningen och kolonin läggs ägg ibland inte så bra under de första 24 timmarna. Om detta inträffar, tillåt ytterligare 24 timmar och justera tiden efter behov.
  2. Efter 24-timmars äggläggningsperiod, släpp drottningen. Markera ramen tydligt och returnera den till kolonin.
  3. Exakt 192 timmar (8 dagar) efter att drottningen har placerats i kasse (förutsatt att normalt ägg ligger inom de första 24 timmarna; 8 dagar markerar punkten strax före valpen), ta bort den markerade ramen från kolonin. Borsta av alla vuxna bin och överför ramen till en kuvös som matchar de inre förhållandena i en bikupa (34 °C och 50 % relativ luftfuktighet (RH)).
    1. Kontrollera att det mesta av ramen är fylld med 5: e instar larver, som kan kännas igen av deras stora, vita, c-formade kroppar pressade tätt mot kamcellernas nedre kanter. Det kommer sannolikt också att finnas några celler som redan är täckta av ett vaxlock, särskilt nära mitten av ramen.
  4. Förbered behållare som matchar höjden och bredden på den larvfyllda ramen för att ta emot de 5: e instar larverna genom att noggrant rengöra de inre och yttre ytorna med tvål och vatten, följt av en blekmedelslösning och slutligen etanol. Torka behållaren noggrant innan du fortsätter.
    1. Linja botten av behållarna med flera lager pappershanddukar. Lägg sedan till flera överlappande lager av tunnare, absorberande rengöringsservetter (t.ex. känsliga uppgiftstorkare) eller filterpapper. Materialet måste vara absorberande. Undvik att överlappa det översta lagret för att underlätta framtida larvöverföring.
  5. Placera ramar med framsidan nedåt (med fokallarver nedåt) ovanpå behållarna så att larverna kan falla på lagret av rengöringsservetter.
    1. Täck behållaren och ramen med en tältbit aluminiumfolie eller annan täckning för att behålla fukt och återföra installationen till inkubatorn. Lämna installationen över natten. Larvernas naturliga matsökande tendenser kommer att få dem att krypa ut ur sina celler och falla på den vadderade ytan nedanför.
  6. Förbered separata överföringsbrickor genom att rengöra dem noggrant med samma steg som beskrivs i 1.4. Låt brickorna torka och lägg bottnarna med rengöringsservetter. Brickorna behöver inte matcha några specifika dimensioner, men grundare brickor möjliggör enklare larvmanipulationer.
    1. Börja överföra larverna från behållarna till brickorna genom att försiktigt lyfta av enskilda våtservetter från toppskiktet i behållarna och häll försiktigt larverna på brickorna. Larverna ska ha fallit i behållarna över natten och bildat flera klibbiga massor (figur 1A).
    2. Använd trubbiga mjuka pincett för att separera larverna och lägg ut dem över brickornas yta. De behöver inte vara jämnt fördelade och kan vara nära varandra men ska inte röra vid varandra. Se figur 1B för en visuell avbildning av separerade larver.
    3. Ta tillfället i akt att ta bort skadade (missfärgade) eller larver under genomsnittet. Dessa är mer benägna att dö under mognadsprocessen och kan ge infektioner / svamptillväxt i hela brickan.
  7. Täck brickan med tältad aluminiumfolie för att behålla fukt och återföra installationen till inkubatorn.
  8. Kontrollera larverna dagligen och ta bort alla som är missfärgade (mörkbruna eller svarta).
    OBS: Larverna/förpupporna kommer att göra avföring på rengöringsservetterna och manifesteras som små bruna fläckar. De kan också producera små mängder vitt, vitt band som en del av deras kapslingsprocess. Ingen av dessa händelser kräver att rengöringsservetterna byts ut, så länge de är absorberande.
  9. Låt larverna förpuppas och mogna till vitögonstadiet, vilket kan identifieras genom att deras allmänna form matchar den hos ett vuxet bi samtidigt som de saknar pigmentering i ögonen och större delen av resten av kroppen. Detta bör ske mellan 14 och 15 dagar efter drottningens placering. Pupporna är nu redo för virusinjektion. Figur 1C, 1D för exempel på vitögda puppor.

2. Massbiutvinningsalternativ 2: manuell valpexcision

OBS: Även om alternativ 2 (pupal excision) är en livskraftig metod för biutvinning, har den också flera nackdelar jämfört med alternativ 1 (larv självborttagning). Alternativ 2 är mycket mer arbetsintensivt, svårare att kontrollera för valpåldern och i allmänhet mer stressande för bina själva. Alternativ 1 rekommenderas när det är möjligt.

  1. Välj en ram av täckt honungsbi som innehåller puppor i eller nära vitögonstadiet (se 1.9 för en beskrivning) från en lämplig koloni. Ta bort locket från kamceller som ligger nära ramens mitt och kanter för att bekräfta närvaron av lämpligt utvecklingsstadium.
  2. Överför ramen till en inkubator inställd på 34 °C och 50% relativ luftfuktighet. Sätt alltid tillbaka ramen till inkubatorn när den inte används omedelbart.
  3. Förbered och rengör överföringsbrickor som är identiska med dem som beskrivs i 1.6.
  4. Ta bort ramen från inkubatorn och sätt på ett vinklat stativ under en ljuskälla. Fukta en liten bunt pappershanddukar med vatten.
  5. Rengör ett par trubbiga hårda pincett med etanol. Använd de rena tångarna och ta bort locket från cellerna som innehåller vita ögonpuppor, var noga med att inte skada pupporna i processen.
  6. En efter en, skär försiktigt popparna från kamcellerna. Det är säkrast att ta tag i pupporna runt bröstkorgen och buken med hjälp av tångspetsarna, om det finns tillräckligt med utrymme. Men om inte kan puppor också tas bort genom att ta tag i huvudet och långsamt vicka ut det tillräckligt långt för att sedan greppas runt kroppen.
    1. Täck de delar av ramen som inte omedelbart nås med våta pappershanddukar för att behålla fukt. Ta bort och byt ut vid behov under excisionsprocessen.
  7. Placera de utskurna pupporna längs rengöringsservetterna i överföringsbrickorna och se till att ingen av dem rör vid. Alla vanskapta eller missfärgade puppor ska kasseras. Puppar är nu redo för virusinjektion.
    1. Kassera puppor som släpper ut vätska vid kontakt med våtservetterna. de har sannolikt punkterats. Ibland kommer puppor att uppvisa små mörka fläckar av melanisering nära kontaktpunkterna med tången inom 1 h efter borttagning. Detta bör inte påverka överlevnaden. Om stora fläckar av melanisering uppträder, ska de drabbade popparna kasseras.

3. Pupal virusinjektion

OBS: Om du utför detta protokoll för första gången (dvs. utan tidigare virala inokulabestånd), extrahera och koncentrera först partiklar med vuxna, puppor eller larver från en koloni med misstänkt infektion. Mät virustitrarna i den resulterande inokula som beskrivs i steg 5 och bestäm vilka partiklar som ska spridas vidare.

  1. Sterilisera alla arbetsytor med blekvatten och etanol innan du börjar arbeta med honungsbivirus. Nitrilhandskar bör bäras under hela processen.
  2. Förbered en injektorapparat som kan injicera vätska i ~1 μl mängder.
    OBS: Ett billigt men ändå effektivt tillvägagångssätt skulle vara att skapa en handgjord enhet genom att fästa en 30 G hypodermisk nål på spetsen av en 100 μL flerdispenserspets (se materialtabell) med flexibel epoxi eller annat flytande lim. Se till att nålskyddets kanter är tätade tätt mot spetsen med flera dispensrar och låt apparaten torka. Se figur 2 för en visuell avbildning av ett exempel på en injektorapparat.
  3. Bered en utspädningslösning med virusinjektion genom att blanda önskad typ av viruspartiklar med steriliserad 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) i ett 15 ml koniskt centrifugrör. Den totala mängd som behövs beror på antalet puppor som behöver injiceras, där varje puppa kräver en injektion på 1 μl (t.ex. 500 puppor = 5 μL viruspartiklar + 495 μL PBS).
  4. Fäst injektorapparaten på en manuell multipipett och testa effekten genom att dra upp 100 μl vatten från en separat bägare och dosera den i 1 μl doser. Se till att varje mängd som dispenseras är lika och byt ut injektorapparaten vid behov. Rensa eventuellt kvarvarande vatten från injektorn.
  5. Hämta brickorna med puppor som genereras i steg 1 eller steg 2 från inkubatorn och ta bort aluminiumfoliebeläggningen.
  6. Rengör ett par trubbiga hårda pincett med etanol. Ta försiktigt tag i den enskilda poppan längs bröstkorgen och applicera precis tillräckligt med tryck för att tvinga inre vätskor till buken. Detta borde göra tergite-uppdelningarna tydligare.
  7. Dra upp 100 μl av viruspartikellösningen med hjälp av multipipetten, sätt in nålen mellan den tredje och fjärde buktergiten och injicera 1 μl av viruslösningen. Upprepa för varje puppa som läggs ut på brickorna, var noga med att undvika upprepade injektioner. Alla puppar som skadas under processen ska kasseras.
    VARNING: Alla virusberedningsrelaterade material betecknas som biologiska risker och bör autoklaveras och kasseras enligt institutionella riktlinjer. Nålar bör också kasseras enligt institutionella riktlinjer.
  8. Täck brickorna av injicerade puppar med aluminiumfolie och återgå till inkubatorn. Låt viruspartiklarna fortplanta sig i pupporna i 3-5 dagar.
    1. Utför dagliga inspektioner på pupporna och ta bort eventuella döda eller ruttnande prover för att förhindra bakterier eller svampuppbyggnad. Små melaniseringspunkter kan förekomma på injektionsstället på buken men bör inte påverka överlevnaden.
  9. Prov popporna i 50 ml koniska centrifugrör och virvel för att homogenisera innehållet, var noga med att ta prov på puppor i rör efter kolonikälla för att minska kontaminering från icke-målvirus. Se till att inga hela puppor finns kvar och överför rören till en frys på -80 °C tills de är redo för viruspartikelutfällning och koncentration.

4. Koncentration av viruspartiklar

OBS: Detta protokoll har inte testats för återvinning av omslutna virus.

  1. Autoklavera alla material och behållare innan du använder dem. Nitrilhandskar, labbrockar och ögonskydd bör bäras under hela denna process. Sterilisera alla arbetsytor med blekvatten, etanol och RNase-inaktiveringslösning innan du börjar.
    1. Förbered 1x TES (Tris-EDTA-salt) buffert: Blanda 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA och 150 mM NaCl. Sterilisera genom autoklavering.
  2. Tina homogeniserade puppor och överför till centrifugflaskor. Tillsätt cirka tre volymer 1x PBS (t.ex. tillsätt ett helt 50 ml rör puppor till 150 ml 1x PBS) och utjämna volymerna till den för den fulla flaskan.
  3. Blanda först för hand och sedan genom att placera på en orbital shaker vid rumstemperatur i 10 min.
  4. Centrifugera vid 15 000 x g vid 4 °C i 5 minuter för att avlägsna cellrester. Upprepa detta steg efter behov om cellulärt skräp kvarstår.
    1. Om supernatanten har stora kulor av fett som flyter vid ytan, filtrera genom ostduken i separata sterila centrifugflaskor innan du fortsätter.
  5. Extrahera supernatanten med 0,3 volymer 24:1 kloroform:isoamylalkohollösning (t.ex. 190 ml supernatant + 57 ml kloroform:isoamylalkohol) och blanda genom inversion. Centrifugera vid 21 000 x g vid 4 °C i 20 minuter.
    VARNING: Undvik direktkontakt med kloroform på huden eller ögonen. Använd alltid ordentlig personlig skyddsutrustning. Allt kloroformavfall ska kasseras enligt institutionella riktlinjer.
  6. Återvinn vattenfasen från varje flaska genom att dekantera supernatanten i separata sterila 500 ml-bägare i ett isbad eller i ett kylrum vid 4 °C. Var noga med att undvika att förorena supernatanten med kloroform eftersom det kommer att göra reningsprocessen svårare; det är bättre att förlora lite vattenhaltig fas.
  7. Tillsätt RNase-fritt vatten för att få upp varje bägare till en volym på 200 ml. Placera bägarna på magnetrörplattor och släpp i en medelstor omrörningsstång. Ställ in plattorna så att de rör om vid en medel-låg inställning.
  8. Tillsätt långsamt NaCl till varje bägare under konstant försiktig omrörning, vilket ger var och en upp till en slutlig koncentration på 2,3% (t.ex. 4,6 g NaCl per 200 ml supernatant). Tillsätt polyetylenglykol 8000 (PEG) till varje bägare upp till en slutlig koncentration på 7% (t.ex. 14 g PEG per 200 ml supernatanten).
  9. Täck bägarna med aluminiumfolie och fortsätt att röra med medelhög hastighet på is eller i ett kylrum i 1-5 timmar för att lösa upp PEG. Ju mer tid som spenderas på omrörning, desto mer noggrant kommer PEG att lösas upp.
  10. Stäng av omrörningsplattorna. Inkubera de täckta bägarna i 1-3 dagar på is eller i ett kylrum så att viruspartiklar och proteiner kan fällas ut. Ju mer tid som spenderas på att inkubera, desto fler partiklar som kommer att fällas ut.
  11. Överför innehållet i varje bägare till separata rena centrifugflaskor och centrifugera vid 15 000 x g vid 4 °C i 30 minuter för att återvinna en PEG-partikelpellets. Kassera supernatanten.
  12. Skrapa försiktigt PEG-partikelpelleten från flaskans sidor och återsuspendera dem i minimala volymer av 1x TES-buffert inuti rena bägare genom att långsamt tillsätta små mängder TES till pelletsen (cirka 10 ml per 100 originalbin).
  13. För den suspenderade pelleten genom en 18 G nål minst tio gånger innan den alikvoteras i 2 ml centrifugrör. Håll alla rör på is tills de är klara för 4.14.
  14. Centrifugera 2 ml rör vid 13 000 x g vid 4 °C i 15 minuter för att avlägsna ytterligare PEG. Överför supernatanten till ett annat 2 ml centrifugrör med en 1 000 μL pipett och upprepa centrifugeringssteget för att säkerställa fullständigt avlägsnande av all PEG.
  15. Koncentrera de återstående partiklarna i supernatanten till nya centrifugrör med hjälp av centrifugalfilterenheter (100 kDa cutoff) via flera centrifugeringsomgångar vid 14 000 x g vid rumstemperatur (RT) i 10 minuter vardera tills den når ungefär en femtedel av den ursprungliga koncentrationen (10 ml partikel-TES-lösning till cirka 2 ml koncentrerade partiklar). Filterenheterna finns i olika storlekar; välj det lämpligaste för antalet prover som bearbetas. Enheterna som passar in i koniska rör i 15 ml storlek är vanligtvis de mest lämpliga.
  16. Resuspendera de koncentrerade partiklarna genom att passera genom en 26 G hypodermisk nål och centrifugera vid 14 000 x g vid RT i 5 minuter för en sista omgång PEG-borttagning. Om vätskan fortfarande är grumlig, upprepa tills all PEG-fällning har tagits bort.
  17. Alikvotera den viskösa supernatanten i önskade mängder och förvara vid -80 °C tills den är klar att användas.

5. Virus-RNA-extraktion och kvantifiering

  1. Extrahera RNA från hela bin eller koncentrerade viruspartiklar med hjälp av någon lämplig RNA-extraktionsmetod (t.ex. TRIzol RNA-extraktionsreagens följt av DNase-behandling).
  2. Kvantifiera virustiter i inokulum som genereras i steg 5.1 via RT-qPCR, helst med hjälp av en standardkurvbaserad metod som inte förlitar sig på värdgenuttryck18, även om andra metoder också kan möjliggöra uppskattningar.

6. Viral utfodring bioassay

  1. Förbered alla nödvändiga material för bioassay före ramuppsamlingssteget (6.2) eller under biets uppkomstperiod på 24 timmar (6.3).
    1. Förbered rena burar eller andra inneslutningar som kan hysa det antal bin som krävs för bioassay (t.ex. akrylboxburar som mäter 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) genom att täppa till alla matarhål med ett centrifugrör av lämplig storlek (figur 3). Bestäm och randomisera behandlingar bland burarna och märk var och en med sin utsedda behandling för enkel framtida referens.
    2. Förbered inokulumbrickor genom att märka enskilda medelstora vägbåtar med motsvarande bur och behandling.
    3. Förbered utfodringslösningen genom att blanda lämplig mängd sackaros med avjoniserat vatten (t.ex. 300 g sackaros per 1 liter vatten för en 30% sackaroslösning), se till att sterilisera vattnet före och efter tillsats av sackaros. Steril sackaroslösning kan förvaras i ett kylskåp på 4 °C i flera veckor men ska kasseras om grumlighet uppstår.
    4. Förbered matarrören genom att delvis fylla 15 ml centrifugrör med matningslösningar som produceras i 6.1.3, invertera dem och sticka 1-2 hål runt rörets spets med en tumstock. Hål kan också smältas med en 18G hypodermisk nål uppvärmd över en låga. Se till att matarrörslocken skruvas fast mycket hårt eftersom löst sittande lock kan orsaka långsamma läckor som kommer att dränka burinvånare över natten.
      OBS: Matningslösningar och matarrörsvolym kan justeras vid behov för att passa experimentella behov.
    5. Förbered en samlingsbehållare för nyuppkomna bin genom att lätt belägga kanterna på ett stort badkar med vegetabilisk olja eller en liknande fet substans. Separat förbereda flera små koppar med samma beläggningsmetod.
  2. Välj och ta bort ramar av honungsbi på gränsen till eclosion som kommer från minst tre separata bikupor. Lämpligt åldrade bin liknar helt pigmenterade vuxna under kamcellens lock. Ett säkert tecken på pågående uppkomst är att observera cellinvånare som långsamt tuggar sig ut och/eller nyligen tömda celler med karakteristiska taggiga tuggmärken längs vaxkapslingen.
    OBS: Den exakta mängden ramar som krävs beror på experimentets storlek, mängden framväxande kull per ram och årstiden. En vanlig Langstroth djup ram innehåller ~ 3,000 kamceller per sida; en ram som innehåller mestadels täckta puppor, med några observerade framväxande kan enkelt producera 400+ bin på 24 timmar. Justera under hela säsongen, efter behov.
  3. Borsta av alla vuxna bin innan du placerar ramarna i lådor och överför dem till en inkubator som matchar de inre förhållandena i en bikupa (34 °C och 50 % RH). Låt bin dyka upp i 24 timmar.
  4. Ta bort uppkomstlådorna från inkubatorn och borsta alla nyuppkomna bin i uppsamlingsbadkaret. Se till att ta bort alla bin från uppkomstlådorna också för att förhindra att felaktigt åldrade bin inkluderas i efterföljande borstningar. Alla som kan flyga uppstod > för 24 timmar sedan och bör uteslutas från bioassay.
  5. Producera en homogeniserad blandning av nyuppkomna bin genom att försiktigt blanda bina i uppsamlingsbadet för hand (de kan inte sticka i denna ålder) för att minimera bikupans genetiska effekter från någon enskild koloni. För specifika tillämpningar kan andra arrangemang för kolonikälla vara önskvärda.
  6. Räkna ut 35 enskilda bin, placera var och en i samma smorda kopp innan du överför innehållet till en akrylbur. Alternativt kan det vara lättare att separera ut mindre multiplar av bin i flera smorda koppar (t.ex. 5 koppar med 7 bin vardera) för att undvika felräkningsfel. Antalet bin som används kan varieras utifrån behov och användningsområden.
  7. Överför binens burar till en inkubator (34 °C och 50 % RH) och se till att följa den slumpmässiga placeringsordningen som skapades i 6.1.1 för att minimera eventuella mikroklimateffekter.
  8. Förbered arbetsytan för virusarbete genom att rengöra alla ytor och pipetter med blekvatten, etanol och RNase-inaktiverande lösning innan du börjar. Se till att bära nitrilhandskar vid hantering av viruspartiklar.
  9. Förbered virusinokulumet med önskad koncentration genom att tina upp en lämplig mängd koncentrerade viruspartiklar (steg 4.17) och blanda noggrant med tillräcklig sackaroslösning (steg 6.1.3) i en steril behållare. För burar med 35 bin kräver var och en 600 μl inokulum. Seriella utspädningar rekommenderas om den önskade viruskoncentrationen är vid eller under 0,1%.
    1. Till exempel kommer ett experiment som involverar 40 burar som alla behöver en 1% virusinokulum att kräva 24 ml viruslösning, vilket kan skapas genom att kombinera 240 μL koncentrerade viruspartiklar med 23,76 ml sackaroslösning. Det rekommenderas att inkludera cirka 15% överskott i den ursprungliga volymen eftersom vissa förluster kan förväntas med viskösa vätskor.
  10. Lägg ut de inokulumbrickor som beretts i 6.1.2 sorterade efter behandlingstyp och pipettera 600 μL av lämplig inokulum på varje bricka.
    1. Sätt försiktigt in inokulumbrickorna i motsvarande burar, var noga med att inte av misstag släppa några bin. Ta tillfället i akt att skanna bina och ersätta alla som kan ha dött i överföringsprocessen.
  11. Tillåt fullständig förbrukning av inokula (ca 12-14 timmar) innan du tar bort centrifugrören som blockerar det övre matarhålet och sätter in lämpliga matarrör som förberetts i 6.1.4. Detta hjälper till att säkerställa att bina i buren delar inokulum jämnt över befolkningen. Sackaroslösning tillhandahålls ad libitum och rören ska fyllas på vid behov under hela experimentets gång.
  12. Registrera dödligheten i varje bur med 12 timmars mellanrum för de första 72 timmarna av varje experiment, varefter registreringen flyttas till 24 timmars intervall. Ta bort döda bin från burar för att öka lättheten i framtida räkningar genom att skjuta upp burdörren precis tillräckligt långt för att ett par tångar ska nå in och skopa ut döda bin. Se till att sterilisera tången över en alkohollampa mellan burarna för att förhindra viral korskontaminering.
  13. Ta prov på bin för virustitermätningar (5.1-5.2) genom att slumpmässigt välja ut levande exemplar i varje bur och placera dem i centrifugrör på torris. Vanligtvis är tre bin tillräckliga för att producera virala titermätningar vid en given tidpunkt utan att också avfolka buren.
  14. Fortsätt regelbundna dödlighetsmätningar så länge det är nödvändigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att framgångsrikt följa protokollen (figur 1) för pupal injektion och virusextraktion bör producera stora mängder viruspartiklar. Provtagning och injektion av puppor från en mängd olika kolonier vid flera tidpunkter maximerar dock chanserna att förvärva målvirus med låg kontaminering. Dynamiken genom vilken virus replikerar och interagerar med varandra inom ett honungsbi är inte väl förstådd; i kombination med sannolikheten för redan existerande infektion finns det ingen garanti för att det injicerade (önskade) viruset kommer att bli dominerande i en given puppa, även om pupporna provtogs från samma ursprungliga koloni. Figur 4 visar det potentiella intervallet av virala proportioner som man kan förvänta sig att se efter extraktion. De fyra visade kolonierna representerar en delmängd av en större virusskördningsinsats där varje puppa ursprungligen injicerades med ett ~ 95% israeliskt akut förlamningsvirus (IAPV) inokulum. Även om 10 av de 16 koloniprover som var involverade i dessa extraktioner innehöll mycket ren IAPV (> 95%), inklusive några > 99% (t.ex. koloni 1), varierade andra prover i deras IAPV-andel (t.ex. koloni 2-3), där vissa till och med dominerades av andra virus som deformerat vingvirus (DWV) (t.ex. koloni 4).

Tabell 1 ger ytterligare sammanhang för förstärkningsnivån för de fyra virusen (BQCV, DWV, IAPV, SBV) som visas i figur 4 i form av RT-qPCR-tröskelcykelvärden (Ct) (den punkt där ett PCR-mål når tröskeln för detektion) och totala virusgenomekvivalenter (ge) per 100 ng RNA. Ct-värden kan användas som prediktor för proportioner, men ge-värden måste beräknas med hjälp av en standardkurvbaserad metod17. Observera att den faktiska mängden partiklar (dvs. ge) som produceras är beroende av antalet bearbetade puppor och filtreringssträngen under extraktionsprocessen.

Viruspartikelpreparat (förstärkt inokulum) ska förvaras vid -80 °C och det rekommenderas att alikvotera dem, eftersom de bryts ned avsevärt om de utsätts för flerafrys-tina-cykler 18. Dessutom bör dos-responsanalyser alltid utföras före experiment, eftersom en mängd externa faktorer (bikupegenetik, bihälsa etc.) kan leda till mycket varierande viralt svar. Med hjälp av data från experimentella burar (figur 3) visar figur 5 sådan variation genom att jämföra dos-responsöverlevnadskurvorna för honungsbin som utfodrats med samma IAPV-partiklar under två olika år. Trots identiska testparametrar, inklusive samma virala inokula och testkoncentrationer från 1% till 0,01% IAPV, gav de prövningar som genomfördes 2018 (figur 5A) och 2019 (figur 5B) märkbart olika överlevnadssvar i alla utom kontrollbehandlingen, som inte fick något virus i sin sackarosinokulokulum. Observera att, om så önskas, LD50-beräkningar också kan utföras vid denna tidpunkt för att få mer exakta mortalitetsmätningar43, men detta är vanligtvis inte nödvändigt eftersom approximationer i allmänhet är tillräckliga. År 2018 resulterade en dos på 1% i cirka 50% överlevnad vid 72 timmar efter infektion (hpi), vilket gör den till standardkoncentrationen för de flesta virala burexperiment som genomfördes det året. Samma dos uppnådde dock nästan total dödlighet 2019 vid samma tidpunkt, och som ett resultat fick de flesta virala burexperiment som genomfördes det året istället en IAPV -inokulum på 0,01%. Denna signifikant lägre koncentration nådde samma nivåer av dödlighet som en 1% IAPV -inokulum 2018 samtidigt som den använde 100 gånger färre viruspartiklar.

Dessa data producerades med bioassays med hjälp av burar som liknar den som anges i figur 3. Matarhålen i ovan- och sidan möjliggör enkel dietkontroll och skjutburdörren gör det enkelt att lägga till eller ta bort föremål från burmiljön, till exempel inokulumbrickor eller döda bin. Det generaliserade virala analysprotokollet är dock inte begränsat till dessa typer av burar eller dietval och bör modifieras för att passa experimentella behov.

Figure 1
Figur 1: Representativa bilder av olika stadier under larvens självborttagningsprotokoll. (A) Exempel på larvmassa som förväntades efter självborttagningsperioden över natten (1.6). B) Larver åtskilda från varandra på separata injektions-/tillväxtbrickor (1.6.3) (C,D) Vitögda puppor redo för virusinjektion (1.9). Bruna fläckar är torkade larval frass, som inte behöver tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Exempel på injektorapparat som skapats genom att kombinera en hypodermisk nål med en spets med flera dispensrar. Nålen och spetsen sammanfogades med flytande lim för att konsekvent leverera 1 μL vätskeinjektioner när de fästes på en upprepande pipetter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Exempelbur som används i virusbioassay. Sackaroslösning och pollen tillhandahölls ad libitum genom matarhål under prövningens gång. Virusinokupé kan enkelt levereras med hjälp av en bricka som sätts in genom burens botten. Observera att burtypen och matarens innehåll kan justeras vid behov för att passa experimentella parametrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Genomsnittlig total virusbelastning och proportioner över viruspreparat från fyra provkolonier. Virusbelastningar mättes med RT-qPCR som black queen cell virus (BQCV) + deformed wing virus (DWV) + israeliskt akut förlamningsvirus (IAPV) + sacbroodvirus (SBV) genomekvivalenter (ge) i 100 ng RNA. Varje provkoloni bestod av 150+ homogeniserade puppor som ursprungligen injicerades med IAPV och representerar det typiska intervallet av virusproportioner som genereras från pupalvirusinjektionsprotokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Dos-responsöverlevnadskurvor för bioassayburar för honungsbin. Burar från både 2018 (A) och 2019 (B) inokulerades med IAPV och matades med 30% sackaroslösning ad libitum under hela prövningen. Behandlingar representerar IAPV-inokulakoncentrationer med 10-2 till 10-4 som anger 1% till 0,1% IAPV-partikelpreparat blandade i 30% sackaroslösning; kontroll sackarosinokulationer innehöll inget virus. n = totalt 56 burar 2018; n = totalt 77 burar 2019. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Genomsnittliga tröskelcykelvärden (Ct) och genomekvivalenter per 100 ng RNA av virusblandningar i fyra viruspreparat från fyra provkolonier. Varje provkoloni består av 150+ homogeniserade puppor genererade från pupalvirusinjektionsprotokollet. Virus detekterades av RT-qPCR med hjälp av specifika primers för varje virus. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här har vi beskrivit metoder som beskriver varje steg i virusförstärknings- och inokulumberedningsprocessen, inklusive larvuppsamling och virusförökning, extraktion och koncentration, samt viral behandling i form av burmatningsexperiment. Dessa metoder möjliggör produktion av halvrena viruspartiklar (figur 4), vars effektivitet konsekvent kan kvantifieras genom dos-responsdödlighetstest för virus som är dödliga för vuxna (figur 5). Efter bekräftelse av infektionsförmåga och /eller patologi kan de genererade partiklarna sedan användas i bioassays för att belysa interaktionerna mellan honungsbin och honungsbivirus.

En av de mest utmärkande fördelarna med de beskrivna protokollen är att var och en lätt skalas till en stor volym, oavsett om det är puppor skördade, partiklar producerade eller bioassays utförda. Med hjälp av pupal excisionsmetoder33 kan man förvänta sig att ta bort ~ 100 puppor per timme, även om detta antal kommer att skala med skicklighet. Metoden för självborttagning av larver, som rapporteras här, kan dock, även om den kräver olika planerings- och schemaläggningsprocedurer, enkelt generera 10-20 gånger det antalet borttagna bin över natten samtidigt som den involverar relativt liten manuell ansträngning och mindre mekanisk belastning på bina.

Huvudbegränsningen med denna metod är att det inte finns något sätt att garantera att de själv borttagna larverna inte tidigare var Varroa-infekterade. Regelbunden kvalsterbehandling och övervakning av källkupor kan minimera denna risk, men vissa larver kan fortfarande ha haft en viss nivå av Varroa-parasitering. Genom att manuellt ta bort puppor individuellt kan användaren dock observera om några kvalster finns i cellen hos en given puppa. Dessutom, eftersom självborttagningsprocessen är beroende av larvernas matsökande beteende, måste ramarna som innehåller dessa larver tas bort före den slutliga utfodringen som normalt inträffar. Endast på grund av denna brist på etablering av arbetarna kryper larverna från sina celler. Därför upplever pupporna som härrör från denna metod ett mycket kort fönster av näringsstress jämfört med larver som utvecklats helt inuti en koloni och kan verka något mindre. Detta är särskilt anmärkningsvärt hos de yngsta larverna i kohorten som finns på ramen; eftersom drottningen har lagt ägg över ett 24-timmarsfönster saknar dessa larver proportionellt mer matningstid. Dessa är vanligtvis tydligt anmärkningsvärda under valpningen för sin mycket lilla storlek jämfört med de som tas bort genom manuell excision. Volymen larver som produceras genom självborttagning kompenserar dock mer än för deras minskade individuella biomassa. Dessutom kan den manuella excisionsmetoden också orsaka betydande mekanisk stress för pupporna när de dras från sina celler. Om någon av metoderna ska användas som en del av ett experiment, och inte bara för att producera viruspartiklar, bör man se till att kontrollerna kontrolleras ordentligt.

Oavsett extraktionsmetod kan virusutbredningsprotokollet generera stora mängder viruspartiklar med hjälp av pupporna, vilket minimerar variationen som induceras av andra för närvarande praktiserade virusinokuleringsmetoder 35,36,37 vid testning för honungsbi viralt svar. Det är viktigt att notera att detta protokoll optimerades och testades med icke-omslutna virus i ordningen Picornavirales (t.ex. israeliskt akut förlamningsvirus, deformerat vingvirus). Olika strategier för att isolera viruspartiklar bör följas vid arbete med omslutna virus44. Som en grov approximation genererades vart och ett av de 16 prover som var involverade i virusskörden (som inkluderade de 4 kolonierna i figur 4) från 200-300 injicerade puppor och gav mellan 2-2,5 ml koncentrerade viruspartikelpreparat. Om man antar en virusinokulumkoncentration på 0,1% och en standard 35-bi-bur, skulle vart och ett av de 16 viruspreparaten ge tillräckligt med partiklar för 3 300-4 200 burar. Detta överskott av inficativt material minskar experimentella begränsningar och möjliggör bioassays med hög genomströmning. Det är viktigt att notera att även om viruspartikelkoncentratet kan förbli livskraftigt i månader eller år när det förvaras vid -80 °C, kan det långsamt minska smittsamheten, även om det utsätts för få frys-tina cykler. Det rekommenderas därför att lagra virusberedningsbeståndet i små alikvoter, varav flera sedan kan användas för att kvantifiera virala titrar och verifiera behandlingsdosen vid tidpunkten för experimentet. Dessutom förstärker den variabilitet mellan år som visas i figur 5 ytterligare behovet av periodisk dos-responstestning, vilket minimerar risken för oväntad förlust av virusviabilitet.

Burbioassayerna själva har också begränsningar, eller åtminstone försiktighetsåtgärder som är nödvändiga att ta hänsyn till, den primära är den artificiella naturen hos burbioassaymiljön (figur 3). Gruppering av bin i inneslutningar möjliggör virustestning utöver individnivå; buren blir experimentenheten snarare än själva biet. Även om detta mer liknar en verklig koloni än ett enda bi som behandlas isolerat, är det fortfarande långt ifrån en realistisk bikupamiljö. Avlägsnade från den sociala miljön, inklusive drottning- och yngelferomoner, bin i olika åldrar och andra ledtrådar, kanske dessa bin inte svarar som en fullstor koloni kan. Detta är dock främst överväganden för storskaliga experiment med bursystemet. Resultaten som samlats in från burvirala bioassays bör i första hand behandlas som baslinjeinformation som kan användas för att informera framtida virustestbeslut skalade till en mer fältrealistisk inställning som användaren önskar.

Metoderna som beskrivs här ger en standardiserad process för massproduktion av viruspartiklar för användning i honungsbi-virala analyser. Sådana analyser har redan implementerats för att undersöka olika aspekter av interaktioner mellan honungsbi och virus, inklusive multivirusinfektion och hur kostkvalitet och näringstillskott påverkar överlevnad inför virusinfektion 11,18,45,46. De har skalats upp för användning i koloniomfattande infektionsexperiment11,47 och för att studera effekterna av infektion på beteende47 och genuttryck48. Sammantaget ger dessa metoder en baslinje i verktyg som kan användas för att producera och utvärdera honungsbivirus inocula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Julia Fine för hennes idéer och diskussion under processen för att skapa protokoll, liksom Dr. Cassondra Vernier för hennes hjälpsamma kommentarer under hela redigeringen. Detta material bidrog till projekt som delvis stöddes av Stiftelsen för livsmedels- och jordbruksforskning, under anslags-ID 549025.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol SigmaAldrich C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL Eppendorf 30089405 Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes Fisher Scientific 06-666 Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane MilliporeSigma MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS) SigmaAldrich P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG) SigmaAldrich 1546605
Refrigerated benchtop centrifuge Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette Eppendorf 4982000322 Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away ThermoFisher 7000TS1
RNAse-free water SigmaAldrich W4502
Sucrose
TES SigmaAldrich T1375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
  2. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957 (2015).
  3. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261 (2014).
  4. Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242 (2017).
  5. Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
  6. Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  7. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160 (2010).
  8. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  9. Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
  10. Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
  11. Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803 (2019).
  12. Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077 (2019).
  13. Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566 (2020).
  14. Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998 (2014).
  15. Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221 (2019).
  16. Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
  17. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656 (2011).
  18. Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265 (2016).
  19. Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
  20. Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
  21. Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401 (2019).
  22. Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
  23. Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639 (2016).
  24. Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
  25. Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502 (2019).
  26. Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
  27. Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274 (2019).
  28. Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742 (2020).
  29. Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
  30. Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831 (2013).
  31. Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
  32. Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429 (2013).
  33. De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
  34. Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445 (2019).
  35. Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357 (2010).
  36. Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499 (2017).
  37. Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
  38. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  39. Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
  40. Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
  41. Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
  42. Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
  43. Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  44. Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
  45. Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
  46. Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
  47. Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
  48. Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412 (2019).

Tags

Biologi utgåva 162 honungsbi Apis mellifera bivirus oral infektion burbioassay extraktion av viruspartiklar
Beredning av virusberikad inokulum för oral infektion av honungsbin (<em>Apis mellifera</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J.,… More

Hsieh, E. M., Carrillo-Tripp, J., Dolezal, A. G. Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (162), e61725, doi:10.3791/61725 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter