Summary
Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.
Abstract
La endometriosis es una de las principales causas de dolor pélvico e infertilidad. Se define por la presencia de tejido endometrial en localizaciones extrauterinas. El desarrollo de nuevas terapias y herramientas de diagnóstico para la endometriosis ha sido limitado debido en parte a los desafíos en el estudio de la enfermedad. Fuera de los primates, pocos mamíferos menstrúan y ninguno desarrolla endometriosis espontánea. Los modelos de roedores son populares, pero requieren la inducción artificial de la endometriosis, y muchos utilizan ratones inmunocomprometidos o enfermedades inducidas quirúrgicamente. Recientemente, se ha prestado más atención a los modelos que involucran la inyección intraperitoneal. Presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso y simplificado que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva. En este modelo, realizamos estimulación hormonal de ratones donantes, inyección intraperitoneal, estudio abdominal sistemático y recolección de tejidos, y cuantificación histológica que se puede realizar y verificar en cualquier momento después de la necropsia. Este modelo requiere recursos y capacitación mínimos; no requiere experiencia de técnicos de laboratorio en cirugía de supervivencia murina o en la identificación de lesiones endometriósicas macroscópicas; se puede utilizar en ratones inmunocomprometidos, inmunocompetentes y/o mutantes; y crea de manera confiable lesiones endometriósticas que son histológicamente consistentes con la enfermedad endometrióstica humana.
Introduction
La endometriosis es una enfermedad enigmática del tracto reproductivo femenino con importantes cargas financieras y de salud para las mujeres1,2. La etiología de la endometriosis no se comprende completamente, y se han propuesto múltiples explicaciones que incluyen metaplasia celómica, restos müllerianos embrionarios, reclutamiento de células progenitoras derivadas de la médula ósea y menstruación retrógrada3. Si bien múltiples aspectos de estos mecanismos propuestos pueden estar involucrados, y ninguna explicación única puede explicar todas las formas de la enfermedad, el modelo principal de patogénesis de la endometriosis es la menstruación retrógrada. La menstruación retrógrada es el paso del efluente menstrual a través de las trompas de Falopio y hacia la cavidad peritoneal; se estima que el 90% de las mujeres que menstrúan regularmente se someten a la menstruación retrógrada4,5. Dado este fenómeno común de la menstruación retrógrada, no está claro por qué la endometriosis se desarrolla solo en un subconjunto de mujeres5. Para comprender mejor la etiología de esta enfermedad, los estudios directos en humanos no son factibles y se justifican los estudios en animales.
La endometriosis es un reto tanto para tratar como para estudiar. La prevalencia de la enfermedad no se conoce, pero se estima que es del 10%1. Si bien algunos tipos avanzados de endometriosis pueden identificarse con precisión a través de imágenes no invasivas, un diagnóstico definitivo solo se logra a través del análisis histopatológico de muestras de biopsia obtenidas quirúrgicamente; lesiones que visualmente parecen estar enfermas, de hecho pueden ser fibrosis o cicatrices por otras causas6. La gravedad y la extensión de la enfermedad no se correlacionan con la sintomatología7.
Las lesiones de endometriosis consisten en tipos celulares heterogéneos y poblaciones que interactúan de manera compleja dentro del microambiente, por lo tanto, limitando la utilidad de los modelos celulares8,9. Los modelos in vivo existen, pero estos tienen desafíos y limitaciones inherentes10,11,12. Los modelos de primates son ideales, pero a menudo no son factibles13,14,15. Pocos mamíferos no primates menstrúan y desarrollan endometriosis espontáneamente16. Existen modelos de endometriosis en roedores, pero cada uno tiene limitaciones17. Muchos de estos modelos requieren cirugía de supervivencia para suturar o implantar tejido endometrial en la pared receptora donante o en el intestino, agregando complejidad técnica, necesidad de anestesia y factores inmunes confusos de la cirugía en sí18,19,20. Además, muchos modelos requieren ovariectomía y suplementos de estrógeno; al tiempo que aumenta el rendimiento de la lesión, esto agrega tiempo, gastos y cirugía de supervivencia adicional. Los modelos de inyección intraperitoneal (IP) no requieren anestesia ni cirugía de supervivencia, y estos modelos lógicamente simulan la menstruación retrógrada mejor que los modelos de sutura21,22,23. La mayoría de los modelos IP, sin embargo, están sujetos a una mayor variabilidad en la ubicación de la lesión debido a la dispersión aleatoria de fragmentos endometriales después de la inyección y, por lo tanto, a un mayor sesgo en la identificación y medición de la lesión.
Aquí presentamos un modelo murino de endometriosis que integra varias características de los modelos de endometriosis existentes en un sistema novedoso, simplificado y eficiente que se basa en la cuantificación microscópica en lugar de la clasificación subjetiva.
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Protocol
NOTA: El uso de animales en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland. Todos los estándares de cuidado y uso de animales disponibles públicamente se realizaron siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Este procedimiento utiliza técnicas asépticas. La placa de Petri es estéril. El PBS/solución salina utilizado es estéril. Los instrumentos quirúrgicos para la necropsia y la disección de tejidos se esterilizan mediante autoclave. Utilizamos un 70% de EtOH en los instrumentos entre casos de animales (si hay más de uno por sesión) para disminuir la contaminación.
1. Preparación de ratones donantes y receptores (ver Figura 1)
- Asegúrese de que existe la aprobación adecuada para trabajar con animales de laboratorio.
- Determine la tensión del ratón. En estos experimentos, se utilizaron ratones de tipo salvaje y mutantes con antecedentes C57BL / 6J, pero los investigadores que utilizan modelos similares informan éxito con otras cepas de ratón como los ratones BALB / c10. Además, los ratones donantes y/o receptores pueden utilizar sistemas de reporteros, como ratones GFP o RFP (ver Figura 2 y Figura 3).
- Para el momento del trasplante de tejido endometrial, asegúrese de que los ratones donantes tienen entre 22 y 24 días de edad en el momento de la inyección de gonadotropina. Esto asegura que sean reproductivamente ingenuos, por ejemplo, que aún no hayan comenzado el ciclo estral.
- Asegúrese de que los ratones receptores estén reproductivamente intactos (sin ovariectomía previa) entre los 2 y los 4 meses de edad. Si bien no es necesario, se recomienda colocar la ropa de cama empapada en orina de una jaula de ratones machos periódicamente en la jaula del receptor para facilitar el ciclo estral en curso y nuevamente a las 72 h antes del trasplante de tejido endometrial.
NOTA: Esto no asegurará la sincronización del ciclo estral de los receptores, ya que la colocación de la ropa de cama empapada en orina depende en gran medida de la cantidad de ropa de cama masculina utilizada y tiene resultados variables. Si se desea la sincronización del ciclo estral, tres inyecciones subcutáneas consecutivas de 100 ng/100 μL estradiol llevarán a todos los animales a la fase estral. Si bien no encontramos diferencias en la inducción de la lesión en función de la fase del ciclo estral, otros grupos han encontrado que la fase del ciclo es importante10. - Inyecte por vía subcutánea gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG, 2 UI diluidas en 200 μL) en ratones donantes por vía subcutánea utilizando una aguja fina(serecomiendan 25-27 G). No le dé PMSG a los ratones receptores, ya que desencadenará la ovulación y el posterior ambiente de alta progesterona, que es menos receptivo a la formación de endometriosis.
NOTA: Los modelos de ratón anteriores han utilizado PMSG o estrógeno para estimular la proliferación endometrial en los ratones donantes antes de la cosecha endometrial23. PmSG se recomienda por las siguientes razones: La vida media de PMSG es de 40 h, mientras que la vida media de 17-beta-estradiol es de solo 2 h. La utilización de una sola inyección subcutánea de PMSG en los donantes 40 h antes de la obtención de tejido endometrial proporciona una duración sostenida de la exposición a la estimulación con gonadotropina, que actúa para estimular el estrógeno endógeno. Muchas preparaciones de estrógeno exógeno requieren múltiples inyecciones para preparar adecuadamente el endometrio. - Después de la inyección de PMSG, programe la necropsia, la obtención y el trasplante en el receptor entre 38-42 h. Cronometre la cosecha de tejido endometrial después de la inyección de gonadotropina para asegurar la recolección de tejido antes de la ovulación, que ocurre a las 42 h después de la inyección. La ovulación produce un ambiente alto de progesterona (P4), lo que reduciría el establecimiento de lesiones.
2. Obtención de tejido endometrial de ratón donante
- Después de la eutanasia del ratón donante (utilizando la cámara de CO2 seguida de dislocación cervical), rocíe el abdomen con una solución de etanol al 70%; esto sirve para reducir la contaminación del tejido obtenido de la flora de la piel y de los pelos desalojados. Con tijeras de disección, haga un recorte transversal poco profundo en la línea media a través de la piel y el tejido subcutáneo. Luego, agarrando cada lado de la incisión en la piel, use tracción contundente para abrir el abdomen.
- Identificar el útero. Antes de extirpar el útero, recorte el tejido conectivo adyacente. Transecte cada cuerno uterino justo debajo de su respectiva trompa de Falopio y luego transecte el cuello uterino para extirpar todo el útero en bloque.
- Después de la extracción de la cavidad abdominal, inspeccione el útero cuidadosamente y elimine cualquier grasa periférica adicional o tejido conectivo. Coloque el útero en una gota de PBS frío en una placa de Petri. Determinar y documentar la masa combinada de todo el útero.
- Transecte cada cuerno desde el fondo de fondo del útero, haciendo que la transección sea lo más cercana posible al fondo de la unión para maximizar la longitud de cada cuerno. Con la ayuda de un microscopio de disección, coloque una hoja de las tijeras de disección dentro de la luz del primer cuerno, luego corte a lo largo del eje principal del tubo. Abra cuidadosamente el tubo, teniendo en cuenta qué lado es la serosa y qué lado es el epitelio.
- Ponga 500 cc de solución salina o PBS en una nueva placa de Petri; el líquido permanecerá unido debido a la tensión superficial.
- Luego, realice la fragmentación del útero de manera uniforme. Es mejor tener menos lesiones más grandes que muchas lesiones más pequeñas. Comience separando el epitelio del miometrio agarrando la capa endometrial y pelándola.
- Alternativamente, simplemente fragmente el tejido sin separarse del miometrio (siempre que el lado epitelial esté completamente expuesto), pero retener el miometrio disminuye la relevancia fisiológica de este modelo para la enfermedad humana. Asegúrese de que los fragmentos sean lo más grandes posible pero lo suficientemente pequeños como para pasar a través de una aguja de 18 G; (Se recomienda 1 mm x 1 mm).
- Recolecte 10-12 de estos fragmentos de 1 mm x 1 mm del primer cuerno (que corresponde aproximadamente a 40 mg de tejido en los ratones C57BL / 6J). Coloque los fragmentos recolectados en la colección de líquidos.
- Realice los mismos pasos para el otro cuerno uterino para un total de aproximadamente 24 fragmentos por ratón. Documente el número total de fragmentos.
3. Inyección peritoneal de fragmentos de tejido en el ratón receptor
- Aspirar los fragmentos suspendidos de 1 mm x 1 mm utilizando el extremo romo de una jeringa de 1 cc; el volumen total debe ser de 1 ml.
- Conecte una aguja de 18 G a la jeringa completa y cargue el líquido en la aguja. Considere una inyección simulada de nuevo en la placa de Petri para asegurarse de que todo el tejido pase a través de la aguja.
- Tome el ratón receptor. Ya sea antes o después de la inyección IP, obtenga un frotis vaginal del ratón receptor para la documentación del ciclo estral (10 μL de solución salina utilizando la jeringa de bulbo en el orificio vaginal y chapada en el portaobjetos de vidrio con la funda).
- Realizar inyección intraperitoneal de los fragmentos con la jeringa en un ángulo de 45 grados, teniendo cuidado de no inyectar por vía subcutánea.
- Si quedan fragmentos después de la inyección, extraiga 200 μL adicionales del líquido en la jeringa para inyección para asegurarse de que todos los fragmentos se inyecten con éxito por vía intraperitoneal.
- Una vez que tenga la seguridad de que no habrá sangrado ni complicaciones, coloque a los ratones receptores de nuevo en sus jaulas y alimente con una dieta normal.
4. Cosecha de lesiones endometriósticas
- Sacrificar a los ratones receptores aproximadamente 21 días después de la inyección de fragmentos después del trasplante.
NOTA: Por experiencia y por discusión con colaboradores utilizando modelos similares, el tamaño máximo de la lesión y el número ocurren aproximadamente a las 3 semanas después del trasplante; después de 3 semanas, las lesiones comienzan a retroceder en tamaño. Se utiliza el método de eutanasia aprobado por la IACUC. - Después de la eutanasia y la dislocación cervical, rocíe el abdomen del animal con etanol al 70% y tienda la piel para cortar superficialmente con tijeras de disección. Incite la piel y el espacio subcutáneo con tijeras para abrir sin rodeos el abdomen.
- Antes de realizar cualquier disección adicional, se realiza un estudio completo de las lesiones macrópicas, con el tamaño medido por calibradores y documentado en cuanto a su región anatómica (ver más abajo).
- Realizar la recolección completa de tres regiones anatómicas distintas en bloque (independientemente de si las lesiones se pueden apreciar o no de forma grosera). Si se observan lesiones en otras regiones (por ejemplo, intestinos), estas deben ignorarse y no recogerse a menos que la lesión atraviese una de las tres áreas a continuación.
- A = pared abdominal/peritoneo (puede aplanarse en un cassette o enrollarse, siempre que sea consistente entre las muestras).
- B = páncreas y grasa mesentérica.
- C = tejido conectivo parauterino y grasa (tejido blanco brillante que rodea el útero pero no involucra ningún otro órgano que no sea la vejiga; tenga cuidado de no confundir la vejiga con una lesión).
- Coloque cada área diseccionada en un casete, debidamente etiquetada, y colóquela en formalina y procese según el protocolo de laboratorio para la seccionamiento histológico.
- Bloques de formalina de sección en dos diapositivas (D1 y D2) por área de tejido a dos profundidades uniformes.
5. Puntuación de las lesiones endometriósticas
- Escanee (con un aumento de 40x) y archive diapositivas.
- Utilice un software de lectura digital de diapositivas, defina la distancia más larga (X) entre los bordes de una lesión endometrióstica, ya sea que el borde consista en glándulas o estroma, y márquelo. Una lesión continua se define por glándulas rodeadas de estroma; la línea no necesariamente atraviesa solo tejido endometriósico (como en el caso de determinar puntos finales en un foco de endometriosis de forma irregular u ondulante), sino que los dos puntos finales deben estar conectados por estroma continuo y / o glándulas (ver Figura 4).
- Haga una segunda línea (Y) de 90 grados a través de la primera línea, con la longitud de la segunda línea determinada siguiendo las reglas anteriores.
- Si se encuentran múltiples lesiones no contiguas, dé a cada una sus propias medidas X e Y.
- Calcule la puntuación final de cada diapositiva como la suma de áreas (X*Y) de cada lesión.
- Tome la mayor de las puntuaciones de las dos diapositivas (D1 vs D2) como la puntuación final para esa región (A, B, C).
- Totaliza las puntuaciones de cada región para dar la puntuación microscópica final para ese animal.
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Representative Results
Para un experimento inicial de prueba de concepto, se inyectó endometrio de donantes de ratones RFP en ratones receptores de tipo salvaje. La tinción de H&E reveló la confirmación histopatológica de la arquitectura clásica de la lesión de endometriosis(Figura 3A). La microscopía fluorescente confirmó que la lesión observada en cuestión se originó en el donante (Figura 3B).
El segundo experimento se realizó utilizando 10 donantes de tipo salvaje C57BL/6J y 10 receptores. Otros 5 receptores recibieron tratamiento simulado (inyectado con PBS y no fragmentos endometriales) y se les asignó un número de identificación aleatorio; los revisores fueron cegados antes de la necropsia y la revisión histopatológica.
Todos los receptores recibieron tejido endometrial del donante dentro de las 42 h del tratamiento con donantes con PSMG. No hubo correlación entre este intervalo de tiempo y el peso uterino final o el tamaño de la lesión. En el momento de la obtención de la donante, el peso uterino total promedio fue de 54 ± 9,5 mg. El número promedio de fragmentos fue de 22,4 ± 5,2, lo que resultó en un peso promedio de fragmentos de 2,5 ± 0,5 mg. La cirugía de punto final ocurrió el día 20 o el día 22 para todos los receptores.
Con un número promedio de lesiones de 1,5 y un diámetro total bruto promedio de la lesión de 3,7 mm, estos puntos finales son similares a otros estudios que utilizan modelos de ratón con un peso similar de fragmentos endometriales inyectados (Figura 2)10. La prevalencia de lesiones en todos los ratones fue del 80%. Los ratones sin lesiones tuvieron un fraccionamiento endometrial significativamente mayor en comparación con los ratones con lesiones (30,5 fragmentos totales frente a 20,3, respectivamente; el promedio de fragmentos totales para todos los ratones fue de 22,4), lo que resultó en un tamaño de fragmento por debajo del promedio en el momento de la inyección (1,9 mg frente a 2,6 mg). Como era de esperar, los controles simulados (inyectados con solución salina y no con fragmentos endometriales) no tuvieron enfermedad macroscópica o microscópica. En un estudio posterior con un número ampliado de ratones, la fase estral del ratón receptor no se asoció con el número de lesiones o la puntuación microscópica de la enfermedad.
El número de lesiones macroscópicas parece ser un marcador sustituto pobre para la carga total de la lesión, ya que hubo discordancia entre la enfermedad macroscópica y la microscópica presente en los tejidos. En el 60% (n = 6) de los casos, hubo concordancia entre la puntuación macroscópica y microscópica (la concordancia definida como la presencia o ausencia y la diferencia en el tamaño total fue dentro de los 3 mm). Sin embargo, en el 40% (n = 4) de los casos, hubo desacuerdo, con el 10% (n = 1) del tiempo la enfermedad macroscópica estuvo ausente pero la enfermedad microscópica estuvo presente por histología, el 10% (n = 1) se observó enfermedad macroscópica a pesar de no ausencia de endometriosis en la histología confirmatoria(Figura 5),y el 20% restante (n = 2) hubo acuerdo en presencia pero no magnitud del tamaño de la lesión. Por lo tanto, el examen macroscópico de las lesiones por sí solo no es suficiente para la cuantificación de la carga de la enfermedad de la endometriosis.
Figura 1: Descripción general del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Regiones estudiadas para la cuantificación de lesiones. Si bien el intestino y otras ubicaciones intraperitoneales pueden albergar lesiones, es más difícil distinguirlas groseramente y un estudio exhaustivo del abdomen requeriría más tiempo con rendimientos decrecientes. Por lo tanto, se realiza un enfoque consistente y sistemático de recolección del tejido completo (independientemente de si hay enfermedad macroscópica) en las tres regiones más comunes de formación de endometriosis: la pared abdominal / peritoneo(A),el páncreas y la grasa mesentérica(B)y la grasa parauterina(C). Se etiquetan imágenes representativas de los hallazgos microscópicos de lesiones de cada una de las tres regiones. Aumento de 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inducción de endometriosis utilizando ratones donantes con endometrio que expresa proteína fluorescente roja. (A) Sección de H&E de la lesión. (B) Microscopía fluorescente con tinción DAPI. Aumento de 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas del software utilizado para medir las dimensiones de las dimensiones de la lesión y cuantificar la carga de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Muestras representativas de "lesiones" macroscópicas que no son endometriosis por examen histopatológico. 40x aumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro estudio demuestra que la endometriosis se puede inducir de manera confiable en ratones sin requerir el uso de ovariectomía y / o cirugía de supervivencia, y que las lesiones endometriales ectópicas se pueden identificar y cuantificar utilizando una encuesta estandarizada del abdomen y el análisis histológico.
Muchos estudios murinos de endometriosis utilizan endometriosis inducida quirúrgicamente en la que el endometrio del donante se sutura en su lugar en el intestino, la pared abdominal u otra ubicación intraperitoneal12,20. Esto tiene la ventaja de estandarizar el tamaño y la ubicación del tejido trasplantado. Sin embargo, además de los desafíos logísticos adicionales de la cirugía de supervivencia, esto puede introducir variables de confusión de la cirugía en sí, dado que la endometriosis es una enfermedad inflamatoria y que en un entorno clínico, la endometriosis generalmente se desarrolla antes de cualquier procedimiento quirúrgico. La inyección intraperitoneal, por otro lado, modela con mayor precisión la menstruación retrógrada que se cree que causa la mayoría de las lesiones de endometriosis.
La ovariectomía a menudo se realiza en modelos de roedores para reducir la variabilidad introducida por el ciclo estral; y como la endometriosis es una enfermedad hor hormona-dependiente, en estos casos se administran dosis suprafisiológicas de estradiol. Podría decirse que esta práctica limita la aplicabilidad de un modelo de ratón a la enfermedad humana. Nuestro estudio demuestra que la ovariectomía no es necesaria para crear lesiones de endometriosis de manera confiable y que la fase del ciclo estral no afecta la capacidad de establecer lesiones.
Un déficit de otros modelos de inyección intraperitoneal es la dependencia de medidas subjetivas del tamaño o la carga de la lesión. Si bien el uso de calibradores u otros instrumentos puede proporcionar medidas objetivas, estas mediciones se registran en el momento de la cosecha de la lesión y, por lo tanto, no pueden verificarse más tarde y pueden estar sujetas a la variabilidad intra-observador. En nuestro modelo, la cuantificación histológica se puede realizar y verificar mucho después de la necropsia, lo que significa que quienes realizan la necropsia no necesitan tener experiencia en la identificación de lesiones macrógicas y son más fácilmente cegados en cuanto a la intervención recibida. Además, como ilustra nuestro trabajo, una proporción de la enfermedad puede pasarse por alto cuando solo se basa en la enfermedad grave; además, muchas lesiones sospechosas pueden ser fisiológicas (por ejemplo, tejido linfoide) o fibrosis. Finalmente, tomar secciones estandarizadas de regiones anatómicas enteras en cada ratón reduce aún más la variabilidad. Este enfoque de obtener la misma cantidad de tejido por ratón evita el inevitable subrayado que ocurriría con muestras pequeñas y la puntuación excesiva de muestras grandes, especialmente porque la enfermedad microscópica puede estar presente.
En última instancia, estos refinamientos sirven para estandarizar y simplificar el enfoque, lo que resulta en un modelo de ratón que puede estudiar la endometriosis de una manera de alto rendimiento. Este modelo es un método ensayable para detectar vías y objetivos farmacológicos, y nuestro laboratorio está utilizando actualmente este modelo para un estudio de validación de fármacos. Este modelo es particularmente útil cuando se intenta determinar la importancia relativa de la expresión génica aberrante (o tratamiento farmacológico) en el endometrio del donante frente al entorno peritoneal del receptor. También se puede utilizar con ratones reporteros (como hemos demostrado) y ratones inmunocomprometidos y knockout.
En resumen, proporcionamos varias innovaciones importantes que proporcionan un modelo murino con alta confiabilidad, reproducibilidad y objetividad en el estudio de la endometriosis. Nuestro enfoque avanza en el campo no solo al proporcionar un proceso sencillo y simplificado para la inducción de lesiones, sino también una forma estandarizada de medir y reportar datos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Reizes por su revisión crítica y conocimientos durante la preparación del manuscrito, así como a los núcleos de Imágenes e Histología del Instituto de Investigación Lerner por su asistencia en la recopilación y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado a través de una subvención interna financiada a través del Comité del Programa de Investigación en la Clínica Cleveland y por una subvención externa a través de la Sociedad para la Investigación Reproductiva y Bayer. La investigación en el Laboratorio Reizes también se financia a través de VeloSano Bike to Cure, Centro de Excelencia en Investigación en Cáncer Ginecológico, y a través de la Cátedra Laura J. Fogarty para la Investigación del Cáncer Uterino. Cleveland Clinic posee el permiso de derechos de autor para la Figura 1 y la Figura 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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