Summary
자궁내막증의 많은 설치류 모델은 기술적 복잡성, 재현성 및/또는 면역 손상된 동물 또는 특수 리포터 마우스에 대한 필요성에 의해 제한됩니다. 우리는 독립적으로 검증 가능하고 객관적인 점수 매기기 시스템을 갖춘 실험용 마우스를 사용하여 병변 유도의 단순화 된 시스템을 제시하며, 난소 절제술 이나 생존 수술에 대한 요구 사항이 없습니다.
Abstract
자궁내막증은 골반 통증과 불임의 주요 원인입니다. 그것은 외피 위치에 자궁 내막 조직의 존재에 의해 정의된다. 자궁 내막증을 위한 새로운 치료 및 진단 공구의 발달은 질병을 공부에 있는 도전 때문에 부분적으로 제한되었습니다. 영장류 의 외부, 몇 포유동물 생리, 아무도 자발적인 자궁 내막증을 개발하지 않습니다. 설치류 모델은 인기가 있지만 많은 사람들이 면역 손상 된 마우스 또는 외과적으로 유도 된 질병을 활용하여 자궁 내막증의 인공 유도가 필요합니다. 최근에는 복막 주사와 관련된 모델에 더 많은 관심을 기울이고 있습니다. 기존 자궁내막증 모델의 여러 기능을 주관적인 채점 대신 미세한 정량화에 의존하는 새로운 단순화 된 시스템으로 통합하는 자궁 내막증의 뮤린 모델을 제시합니다. 이 모델에서는, 우리는 기증자 마우스의 호르몬 자극, 복막 주사, 체계적인 복부 조사 및 조직 수확, 및 부검 후에 언제든지 수행되고 검증될 수 있는 조직적 정량화를 능력을 발휘합니다. 이 모델에는 최소한의 리소스와 교육이 필요합니다. 뮤린 생존 수술이나 총 자궁 내막증 병변의 식별에 실험실 기술자에 의해 전문 지식을 필요로하지 않습니다; 면역 손상, 면역 무능, 및 돌연변이 마우스에서 사용할 수 있습니다. 안정적으로 인간 자궁 내막증 질환과 조직학적으로 일치하는 자궁 내막증 병변을 만듭니다.
Introduction
자궁내막증은 여성생식기관의수수께끼 질환으로, 여성1,2에상당한 재정적, 건강부담이 있다. 자궁내막증의 병인은 완전히 이해되지 않으며, 코엘로믹 대사증, 배아 뮐레리안 휴식, 골수 유래 전구세포의 모집, 역행 생리3을포함한 여러 가지 설명이 제안되었다. 이러한 제안된 기계장치의 다중 양상이 관련될 수 있고, 단 하나 설명이 질병의 모든 양식을 설명할 수 있는 동안, 자궁내막증 병인의 주요 모형은 역행생리입니다. 역행 생리는 나팔관을 통해 복막 구멍으로 생리 유출물의 통로입니다. 생리 여성의 90 %가 정기적으로 역행 생리4,5을겪는 것으로 추정됩니다. 역행 생리의 이 일반적인 현상을 감안할 때, 왜 자궁내막증은 여자의 부세트에서만 발전하는 것은불분명5. 이 질병의 병인학을 더 잘 이해하기 위해 직접적인 인간 연구는 실현 가능하지 않으며 동물 연구가 보증됩니다.
자궁내막증은 치료와 연구 모두에 도전이다. 질병의 보급은 알려지지 않았지만 10%1로추정된다. 자궁내막증의 몇몇 향상된 모형이 비침습적인 화상 진찰을 통해 정확하게 확인될 수 있는 동안, 결정적인 진단은 외과적으로 취득한 생검 견본의 조직병리학 분석을 통해서만 달성됩니다; 시각적으로 병에 걸린 것으로 보이는 병변은 실제로 다른 원인6에서 섬유증또는 흉터일 수 있다. 질병의 심각도 및 정도는 증상과 상관 관계가 없습니다7.
자궁내막증 병변은 마이크로환경 내에서 복잡한 방식으로 상호작용하는 이질성 세포 유형 및 집단으로 구성되므로, 따라서 세포모델의유용성을제한8,9. 생체 내에서 모델이 존재하지만, 이들은 고유의 도전과한계가 10,11,12. 영장류 모델은 이상적이지만종종13,14,15가가능하지 않습니다. 몇몇 비 영장류 포유동물은 생리하고 자발적으로 자궁내막증을개발16. 자궁 내막증의 설치류 모델은 존재하지만 각각은한계가 17. 이들 모델의 대부분은 기증자 수혜자 벽 또는 창자에 자궁내막 조직을 봉합하거나 이식하는 생존 수술을 요구하며, 기술적 복잡성을 추가하고 마취가 필요하며 수술 자체로부터 면역 인자를혼동18,19,20. 또한, 많은 모델 은 ovariectomy 및 에스트로겐 보충을 필요로; 병변 수율을 증가하는 동안, 이것은 시간, 비용 및 추가 생존 수술을 추가합니다. 인트라피오날(IP) 주사 모델은 마취 또는 생존 수술을 필요로 하지 않으며, 이들 모델은 논리적으로 역행 생리를 시뮬레이션하여 모델을 봉합하는모델(21,22,23)보다더 잘 한다. 그러나 대부분의 IP 모델은 주입 후 자궁내막 단편의 무작위 분산으로 인해 병변 위치에서 더 많은 가변성을 가지므로 병변 식별 및 측정에 더 많은 편견이 있습니다.
여기서 우리는 주관적인 채점 대신 현미경 정량화에 의존하는 새로운, 단순화되고 효율적인 시스템으로 기존 자궁 내막증 모델의 여러 기능을 통합하는 자궁 내막증의 뮤린 모델을 제시합니다.
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Protocol
참고 : 이 연구에서 동물의 사용은 클리블랜드 클리닉 러너 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 공개적으로 이용 가능한 모든 동물 관리 및 사용 기준은 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 절차는 무균 기술을 활용하고 있습니다. 페트리 접시는 멸균입니다. 사용되는 PBS/식염수는 멸균입니다. 부검 및 조직 해부에 대한 수술 기구는 오토 클레이브를 통해 살균됩니다. 우리는 오염을 줄이기 위해 동물 케이스 (세션 당 하나 이상)사이의 기기에 70 %의 EtOH를 사용합니다.
1. 기증자 및 수령마우스 준비(그림 1참조)
- 실험실 동물과 함께 작동하도록 적절한 승인이 마련되어 있는지 확인하십시오.
- 마우스의 변형을 결정합니다. 이러한 실험에서, C57BL/6J 배경을 갖는 야생형 및 돌연변이 마우스가 활용되었지만, 유사한 모델을 이용한 조사관들은 BALB/c마우스(10)와같은 다른 마우스 균주와 함께 성공을 보고하였다. 또한, 기증자 및/또는 수신자 마우스는 GFP 또는 RFP 마우스와 같은 기자 시스템을 활용할 수 있다(도 2 및 도 3참조).
- 자궁내막 조직 이식의 타이밍을 위해, 기증자 마우스가 생식샘호르몬 주사 시 22-24 일 사이인지 확인하십시오. 이것은 그들이 생식 순진하다는 것을 보장합니다, 예를 들면, 아직 에스트라스 사이클링을 시작하지 않습니다.
- 수령인 마우스가 2~4개월 사이에 생식이 손상되지 않았는지(이전 의 혈관 절제술 없음)가 있는지 확인하십시오. 필수는 아니지만, 지속적인 에스스트라스트 사이클링을 용이하게하고 자궁 내막 조직 이식 전에 72 h에서 다시 수컷 마우스 케이지에서 소변에 젖은 침구를 배치하는 것이 좋습니다.
참고: 이것은 수용자의 estrous 주기의 동기화를 보장 하지 않습니다., 배치 소변 젖은 침구는 사용 하는 남성 침구의 양에 크게 의존 하 고 변수 결과. 에스트라스 사이클의 동기화가 바람직한 경우, 100 ng/100 μL estradiol의 3회 연속 피하 주사는 모든 동물을 에스트라스 상으로 가져올 것이다. 우리는 estrous 주기의 단계에 근거를 둔 병변 유도에 있는 아무 다름도 찾아낸 동안, 그밖 단은 중요한10주기단계를 찾아냈습니다. - 피하하여 임신 한 마레 세럼 고나돌로핀 (PMSG, 2 IU2 IU 200 μL로 희석)을 기증자 마우스에 피하 로 주입하여 미세 바늘 (25-27 G권장)을 사용한다. 자궁내막증 형성에 덜 수용되는 배란 및 후속 고검소 환경을 유발하기 때문에 수신자 마우스에 PMSG를 제공하지 마십시오.
참고: 이전 마우스 모델은 PMSG 또는 에스트로겐을 활용하여 자궁내막수확(23)이전에 기증자 마우스의 자궁내막 증식을 자극하였다. PMSG는 다음과 같은 이유로 권장됩니다 : PMSG의 반감기는 40 시간인 반면 17 베타 에스트 라디오의 반감기는 2 시간밖에 되지 않습니다. 내막 조직의 조달 40 시간 전에 기증자에서 PMSG의 단일 피하 주사를 활용하면 내인성 에스트로겐을 자극하는 역할을하는 생식샘 호르몬 자극에 대한 지속적인 노출 기간을 제공합니다. 외인성 에스트로겐의 많은 준비는 내분담을 적절히 프라임하기 위해 다중 주사를 필요로한다. - PMSG 주사 후, 38-42 h 사이의 수령인으로 부검, 조달 및 이식일정을 잡습니다. 시간 자궁 내막 조직 수확 다음 생식샘 호르몬 주입 다음 배란 하기 전에 조직의 수집을 보장 하기 위해, 에서 발생 하는 42 시간 후 주입. 배란은 병변 설치를 감소시키는 높은 프로게스테론 (P4) 환경을 생성합니다.
2. 기증자 마우스 자궁 내막 조직의 조달
- 기증자 마우스의 안락사 후 (CO2 챔버를 사용하여 자궁 경부 탈구에 의해 다음), 70 % 에탄올 용액으로 복부를 스프레이; 이것은 피부 식물과 벗겨진 머리에서 조달된 조직의 오염을 감소시키는 역할을 합니다. 해부 가위를 사용하면 피부와 피하 조직을 통해 중간선에서 얕은 횡방향 스니핑을 합니다. 그런 다음 피부 절개의 각 면을 파악하면 무딘 견인력을 사용하여 복부를 엽니다.
- 자궁을 식별합니다. 자궁을 제거하기 전에 인접한 결합 조직을 잘라내면 됩니다. 각 자궁 경적을 각 나팔관 바로 아래에 분리한 다음 자궁 경부를 트랜스로 전환하여 자궁 엔 블록 전체를 제거합니다.
- 복강에서 제거 한 후 자궁을 주의 깊게 검사하고 추가 말초 지방 또는 결합 조직을 제거하십시오. 페트리 접시에 차가운 PBS의 액적에 자궁을 놓습니다. 전체 자궁의 결합된 질량을 결정하고 문서화합니다.
- 자궁 기금에서 각 뿔을 분리하여 각 뿔의 길이를 최대화하기 위해 가능한 한 기금에 가까운 트랜섹션을 만듭니다. 해부 현미경의 도움으로, 첫 번째 뿔의 루멘 내부에 해부 가위의 한 블레이드를 배치 한 다음 튜브의 주요 축을 따라 잘라. 조심스럽게 튜브를 열어 세로사이며 어느 쪽이 상피인지 염두에 두십시오.
- 새로운 페트리 접시에 식염수 또는 PBS 500 cc를 넣어; 액체는 표면 장력으로 인해 함께 유지됩니다.
- 그런 다음 자궁의 단편화를 균일한 방식으로 수행합니다. 그것은 많은 작은 병 변 보다 더 적은 더 큰 병 변을 가지고 하는 것이 좋습니다. 자궁내막층을 잡고 벗겨내어 근막에서 상피를 분리하는 것으로 시작합니다.
- 또는, 단순히 근막절을 분리하지 않고 조직을 단편화 (상피 측이 완전히 노출되는 한), 그러나 심근을 유지하는 것은 인간 질병에 이 모형의 생리적 관련성을 감소시다. 파편이 가능한 한 크지만 18 G 바늘을 통과 할 만큼 작다는 것을 확인하십시오. (1mm x 1mm를 권장합니다).
- 첫 번째 뿔에서 이러한 1mm x 1mm 조각의 10-12를 수집 (대략 에 해당 40 C57BL/6J 마우스에서 mg 조직). 수집된 조각을 액체 수집에 넣습니다.
- 마우스 당 약 24 개의 조각에 대해 다른 자궁 경적에 대해 동일한 단계를 수행합니다. 총 조각 수를 문서화합니다.
3. 수용자 마우스에 조직 조각의 회간 주입
- 1cc 주사기의 무딘 끝을 사용하여 일시 중단된 1mm x 1mm 조각을 흡인; 총 볼륨은 1mL여야 합니다.
- 전체 주사기에 18 G 바늘을 부착하고 바늘에 액체를로드합니다. 모든 조직이 바늘을 통과할 수 있도록 페트리 접시에 모의 주사를 다시 고려하십시오.
- 받는 사람 마우스를 가져 가라. IP 주입 전후에, 에스트라스트 사이클 문서화를 위해 받는 마우스의 질 얼룩을 얻습니다(질 오리피스에서 전구 주사기를 이용하여 식염수의 10 μL을 사용하고 커버슬립이 있는 유리 슬라이드에 도금).
- 피하 주사하지 않도록 주의하여 주사기로 조각의 복막 주사를 45도 각도로 수행합니다.
- 파편이 주입 후에 남아 있는 경우에, 모든 파편이 성공적으로 내회로 주입되는지 확인하기 위하여 주사를 위해 주사기에 액체의 추가 200 μL를 그립니다.
- 일단 출혈이나 합병증이 없는 경우, 수령인 마우스를 다시 케이지에 넣고 정상적인 식단을 먹입니다.
4. 자궁 내막병변 수확
- 이식 후 약 21일 후에 수령인 마우스를 안락사시킵니다.
참고: 경험과 유사한 모델을 사용하는 공동 작업자와의 토론에서 최대 병변 크기와 수는 이식 후 약 3주 동안 발생합니다. 3 주 후, 병변크기가 회귀하기 시작합니다. 안락사의 IACUC 승인 방법이 사용됩니다. - 안락사와 자궁 경부 탈구에 따라 동물의 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 피부를 텐트하여 해부 가위로 표면적으로 자릅니다. 가위로 피부와 피하 공간을 절개하여 복부를 무뚝뚝하게 엽니다.
- 추가 해제가 수행되기 전에, 총 병변에 대한 완전한 조사가 수행되며, 크기는 캘리퍼에 의해 측정되고 해부학 적 부위에 관해서는 문서화됩니다 (아래 참조).
- 3개의 명백한 해부학 지구 en bloc의 완전한 집합을 수행합니다 (병변이 심하게 평가될 수 있는지 여부에 관계없이). 병변이 다른 지역(예: 창자)에서 보이는 경우, 병변이 아래 세 영역 중 하나를 통과하지 않는 한 무시되고 수집되지 않아야 합니다.
- A = 복벽/복막(샘플 간에 일관된 한 카세트로 평평하게 하거나 롤업할 수 있음).
- B = 췌장 과 장막 지방.
- C = 파라우테린 결합 조직 및 지방 (자궁을 둘러싸고 있지만 방광 이외의 장기를 포함하지 않는 백색 빛나는 조직; 병변에 대한 방광을 착각하지 않도록주의하십시오).
- 각 해부된 영역을 적절하게 라벨로 카세트에 넣고, 히스토로지학적 단면에 대한 실험실 프로토콜에 따라 포르말린 및 프로세스에 넣습니다.
- 두 개의 균일 한 깊이에서 조직 영역 당 두 개의 슬라이드 (D1 및 D2)에서 섹션 포르말린 블록.
5. 자궁 내막증 병변의 점수
- 스캔(40배율) 및 아카이브 슬라이드.
- 디지털 슬라이드 읽기 소프트웨어를 사용하여 자궁내막병변의 가장자리 사이의 가장 긴 거리(X)를 정의하고 가장자리가 땀샘또는 기질로 구성되어 있는지 여부를 정의하고 표시하십시오. 연속 병변은 스트로마로 둘러싸인 땀샘으로 정의됩니다. 선은 반드시 자궁내막조직만을 통과하지는 않지만(자궁내막증의 불규칙한 모양 또는 기복 초점에서 엔드포인트를 결정하는 경우와 같이) 두 개의 끝점은 연속스트로마 및/또는 땀샘으로 연결되어야 합니다(그림 4참조).
- 두 번째 줄(Y)을 90도, 위의 규칙에 따라 두 번째 줄의 길이를 결정합니다.
- 여러 개의 비연속 병변이 발생하면 각 측정값을 자신의 X 및 Y 측정값을 부여합니다.
- 각 슬라이드의 최종 점수를 각 병변의 영역(X*Y)의 합계로 계산합니다.
- 해당 지역의 최종 점수(A, B, C)로 두 슬라이드(D1 vs D2)에서 더 큰 점수를 기록합니다.
- 각 지역의 점수를 합하여 해당 동물에 대한 최종 현미경 점수를 제공합니다.
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Representative Results
개념 실험의 초기 증거를 위해, RFP 마우스에서 기증자 내메트리움은 야생 형 받는 사람 마우스로 주입되었다. H&E 염색은 자궁내막증 병변의 고전적인 건축에 대한 조직병리학적 확인을공개했다(그림 3A). 형광 현미경 검사는 문제의 관찰 된 병변이 기증자(도 3B)로부터유래것을 확인했다.
두 번째 실험은 10개의 야생형 C57BL/6J 기증자와 10명의 수신자를 사용하여 수행하였다. 추가 5 명의 수령인은 가짜 치료 (PBS로 주입되고 자궁 내막 단편이 아님)을 받았으며 무작위 식별 번호를 할당했습니다. 검토자는 부검 및 조직 병리학 검토 전에 눈을 멀게했습니다.
모든 수령인은 PSMG 기증자 처리의 42 시간 안에 기증자 자궁내막 조직을 수신했습니다. 이 시간 간격과 최종 자궁 무게 또는 병변 크기 사이에는 상관관계가 없었습니다. 기증자 조달 시 평균 총 자궁 무게는 54 ± 9.5 mg이었습니다. 평균 단편 수는 22.4 ± 5.2였으며, 그 결과 평균 단편 중량은 2.5 ± 0.5 mg이었다. 엔드포인트 수술은 모든 수령인을 위해 20일 또는 22일째에 발생했습니다.
평균 병변 수가 1.5이고 평균 총 병변 직경 3.7mm로, 이러한 종점은 주입된 자궁내막 단편의 비슷한 무게를 가진 마우스 모델을 활용하는 다른 연구와유사하다(도 2)10. 모든 마우스를 위한 병변의 보급은 80%이었습니다. 병변이 없는 마우스는 병변을 가진 마우스에 비해 훨씬 더 큰 자궁내막 분획을 가졌다 (30.5 총 단편 대 20.3, 각각; 모든 마우스에 대한 평균 총 단편은 22.4) 주사 시 평균 단편 크기 이하의 결과 (1.9 mg 대 2.6 mg). 예상대로, 가짜 컨트롤 (식염수와 자궁 내막 단편을 주입) 더 중증 또는 현미경 질병이 없었다. 마우스의 확장 된 수를 사용 하 여 후속 연구에서, 받는 사람 마우스의 estrous 단계 는 병 변 번호 또는 현미경 질병 점수와 관련 되지 않았습니다.
총 병변 수는 조직에 존재하는 거시적 및 현미경 질병 사이 불일치가 있었기 때문에 총 병변 부담을 위한 가난한 대리 마커인 것처럼 보입니다. 60%(n=6)에서 거시적 점수와 현미경 점수 사이에 합의가 있었다(총 크기의 존재 또는 부재 및 차이를 모두 나타내는 것으로 정의된 계약은 3mm 이내였다). 그러나, 케이스의 40%(n =4)에서, 불일치가 있었다, 10% (n = 1) 시간 거시성 질환이 결석했지만 현미경 질환은 조직학에 의해 존재했다, 10 % (n = 1) 거시 질환은 확인 조직학에 자궁내막증의 부재에도 불구하고 보였다(도 5),나머지 20% (n = 2) 존재하지만 크기의 크기가 없는 합의가 있었다. 따라서 병변에 대한 거시적 검사는 자궁내막증 질환 부담의 정량화에 충분하지 않다.
그림 1: 모델 개요입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 병변 정량화를 위한 조사 된 영역. 창자 및 그밖 복막 위치는 병변을 품을 수 있는 동안, 이 심하게 구별하는 것이 더 도전이고 복부의 철저한 조사는 감소하는 반환으로 더 많은 시간 집중일 것입니다. 따라서, 전체 조직을 수확하는 일관되고 체계적인 접근법(총질병이 존재하는지 여부에 관계없이) 자궁내막증 형성의 3개의 가장 흔한 영역에서 수행된다: 복벽/복막(A), 췌장 및 백막지방(B), 및 파라우테린지방(C). 표지된 것은 3개의 지구의 각에서 병변의 현미경 사실 인정의 대표적인 심상입니다. 40배 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 적색 형광 단백질을 발현하는 기증자 마우스 내막을 사용하여 자궁내막증을 유도한다. (A)병변의 H&E 섹션. (B)DAPI 염색을 가진 형광 현미경 검사법. 40배 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 병변 치수의 치수를 측정하고 병변 부담을 정량화하는 데 사용되는 소프트웨어의 대표적인 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 조직병리학 검사에 의한 자궁내막증이 아닌 총 "병변"의 대표적인 샘플. 40배감. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 연구는 자궁 내막증이 난소 절제술 및 / 또는 생존 수술의 사용을 요구하지 않고 마우스에서 안정적으로 유도 될 수 있음을 보여 주며, 자궁 내막 병변은 복부 및 역사학 분석의 표준화 된 설문 조사를 사용하여 식별하고 정량화 할 수 있음을 보여줍니다.
자궁내막증의 많은 뮤린 연구는 기증자 자궁내막증을 사용하여 창자, 복벽 또는 기타 관구위치(12,20)에제명된다. 이것은 이식된 조직의 크기와 위치를 표준화하는 장점이 있습니다. 그러나, 생존 수술의 추가 물류 도전 이외에, 이것은 자궁내막증이 선동적인 질병이고 임상 조정에서, 자궁내막증이 전형적으로 어떤 외과 절차의 앞에 발전한다는 것을 주어진 수술 자체에서 혼란스러운 변수를 소개할 수 있습니다. 관면 주사, 다른 한편으로는, 더 정확하게 자궁 내막증 병변의 대부분을 일으키는 것으로 생각 되는 역행 생리를 모델.
ovariectomy는 종종 에스트라스트 사이클에 의해 도입 된 가변성을 줄이기 위해 설치류 모델에서 수행됩니다. 그리고 자궁 내막증은 호르몬 의존성 질병이기 때문에, estradiol의 supraphysiologic 복용량은 다음 이 경우에 관리됩니다. 이 관행은 틀림없이 인간 질병에 마우스 모델의 적용성을 제한합니다. 우리의 연구 결과는 ovariectomy가 안정적으로 자궁내막증 병변을 만들 필요가 없다는 것을 보여주고 estrous 주기의 그 단계는 병변을 설치하는 기능에 영향을 미치지 않습니다.
다른 관면 주사 모델의 부족은 병변 크기 또는 부담의 주관적인 측정에 의존이다. 캘리퍼 또는 기타 계측기를 사용하면 객관적인 측정을 제공할 수 있지만, 이러한 측정은 병변 수확 시에 기록되므로 나중에 확인할 수 없으므로 관찰자 내 가변성의 영향을 받을 수 있습니다. 우리의 모형에서, 관학적 정량화는 부검 후에 오래 수행되고 확인될 수 있습니다, 부검을 능력을 발휘하는 사람들은 총 병변의 식별에 있는 전문 지식을 가질 필요가 없으며 수신된 내정간섭에 관해서는 더 쉽게 눈이 멀었다는 것을 의미합니다. 또한, 우리의 작품에서 알 수 있듯이, 질병의 비율은 총 질병에만 의존 할 때 놓칠 수 있습니다; 추가적으로, 많은 의심되는 병변은 실제로 생리적인 (예를 들면, 림프구) 또는 섬유증일 수 있습니다. 마지막으로, 각 마우스에서 전체 해부학 영역의 표준화된 섹션을 복용하면 가변성이 더욱 줄어듭니다. 마우스 당 조직의 동일한 금액을 조달의이 접근은 작은 샘플과 큰 샘플의 과다 평가로 발생하는 피할 수없는 밑줄을 방지, 특히 미세한 질병이 존재 할 수 있기 때문에.
궁극적으로 이러한 세련미는 접근 방식을 표준화하고 단순화하여 높은 처리량 방식으로 자궁내막증을 연구할 수 있는 마우스 모델을 제공합니다. 이 모델은 경로 및 약물 표적을 선별하는 분석 가능한 방법이며, 현재 당사의 실험실은 약물 검증 연구를 위해 이 모델을 활용하고 있습니다. 이 모형은 수령인 간정 환경 대 기증자 심폐소에서 비정상적인 유전자 발현 (또는 약물 처리)의 상대적 중요성을 결정하기 위하여 시도할 때 특히 유용합니다. 또한 기자 마우스 (우리가 보여 준 대로) 및 면역 타협 및 녹아웃 마우스와 함께 활용할 수 있습니다.
요약하면, 우리는 자궁 내막증을 공부에 높은 신뢰성, 재현성 및 객관성을 가진 뮤린 모델을 제공하는 몇 가지 중요한 혁신을 제공합니다. 당사의 접근 방식은 병변 유도를 위한 간단하고 간소화된 프로세스뿐만 아니라 데이터를 측정하고 보고하는 표준화된 방법을 제공함으로써 필드를 발전시다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 원고를 준비하는 동안 중요한 검토와 통찰력에 대한 Reizes 실험실의 구성원뿐만 아니라 데이터 수집 및 데이터 분석에 대한 지원을 Lerner 연구소의 이미징 및 히스토로지 코어에 감사드립니다. 이 사업은 클리블랜드 클리닉의 연구 프로그램 위원회를 통해 내부 보조금 기금을 통해 지원되었으며 생식 조사 및 바이엘 협회를 통한 외부 보조금으로 지원되었습니다. Reizes 실험실에 있는 연구는 또한 치료벨로사노 자전거를 통해 투자됩니다, 부인과 암에 있는 연구 우수성의 센터, 그리고 Uterine 암 연구를 위한 로라 J. Fogarty 부여 의자를 통해. 클리블랜드 클리닉은 그림 1 및 그림 2에대한 저작권 권한을 소유하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A.
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