Summary
In vivo billeddannelse er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af biologi i sundhed og sygdom. Denne protokol beskriver transpupillær billeddannelse af musens nethinde med et standard to-fotonmikroskop. Det demonstrerer også forskellige in vivoimaging metoder til fluorescerende mærkning af flere cellulære kohorter i nethinden.
Abstract
Nethinden omdanner lyssignaler fra miljøet til elektriske signaler, der formeres til hjernen. Sygdomme i nethinden er udbredt og forårsager synshandicap og blindhed. At forstå, hvordan sådanne sygdomme udvikler sig, er afgørende for at formulere nye behandlinger. In vivo-mikroskopi i dyremodeller af sygdom er et kraftfuldt værktøj til forståelse af neurodegeneration og har ført til vigtige fremskridt i retning af behandlinger af tilstande lige fra Alzheimers sygdom til slagtilfælde. I betragtning af at nethinden er den eneste centralnervesystemstruktur, der i sagens natur er tilgængelig ved optiske tilgange, egner den sig naturligt til in vivo-billeddannelse. Imidlertid giver den oprindelige optik i linsen og hornhinden nogle udfordringer for effektiv billeddannelsesadgang.
Denne protokol skitserer metoder til in vivo to-fotonbilleddannelse af cellulære kohorter og strukturer i musens nethinde ved cellulær opløsning, der kan anvendes til både akutte og kroniske billeddannelseseksperimenter. Det præsenterer eksempler på retinal ganglioncelle (RGC), amakrine celle, microglial og vaskulær billeddannelse ved hjælp af en række mærkningsteknikker, herunder adeno-associeret virus (AAV) vektorer, transgene mus og uorganiske farvestoffer. Det er vigtigt, at disse teknikker strækker sig til alle celletyper i nethinden, og foreslåede metoder til adgang til andre cellulære populationer af interesse beskrives. Også detaljerede er eksempler på strategier til manuel billedefterbehandling til visning og kvantificering. Disse teknikker er direkte anvendelige til undersøgelser af retinal funktion i sundhed og sygdom.
Introduction
In vivo visualisering af centralnervesystemet kræver generelt invasive procedurer som kranieudtynding og installation af glasvinduer eller optiske relælinser. Nethinden er den eneste struktur i nervesystemet, der kan observeres direkte uden behov for invasiv forberedelse, da den naturligt modtager lys fra miljøet. Den lette optiske adgang til nethinden gør det til et attraktivt modelsystem til at studere centralnervesystemet.
Levende fluorescerende billeddannelse af nethinden hos mus er blevet brugt til at spore RGC-død i modeller af glaukom 1,2, optisk nerveskade 1,3,4 og slagtilfælde5 samt ændringer i mikroglialaktivering 6,7,8 og vaskulatur 9 under degenerative forhold. Iboende signaler kan også bruges til at visualisere fotoreceptorer 10,11,12 og retinale pigmentepitelceller 13. Mange tilgange til in vivo-billeddannelse af nethinden bruger enten højt specialiserede enheder, der er specielt designet til oftalmologiske formål6 eller stærkt modificerede optiske systemer til at korrigere for de indfødte afvigelser i hornhinden og linsen 8,9,11,12,13,14.
Den nuværende protokol demonstrerer en tilgang til in vivo-billeddannelse af fluorescerende signaler i nethinden ved cellulær opløsning ved hjælp af en grundlæggende metode til delvis korrektion for museøjets forreste optik. Denne strategi kræver meget små tilpasninger til multiphoton mikroskop opsætninger, der almindeligvis anvendes til in vivo billeddannelse af hjernen. Da denne tilgang er ligetil at sætte op, og musene er under lidt stress, er det befordrende at udføre time-lapse-forsøg over både akutte og kroniske varigheder. Derudover er genetiske og organiske farvestofbaserede procedurer, der mærker individuelle retinale komponenter, herunder RGC'er, amakrine celler, microglia og vaskulatur, kompatible med denne billeddannelsesteknik og muliggør in vivo-observation af celletyper og strukturer, der er kritiske for retinal funktion. Disse værktøjer kan tilpasses til at mærke de fleste andre neuronale celletyper samt glial og vaskulære komponenter i nethinden.
Protocol
BEMÆRK: Følgende procedure blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Washington University i St. Louis. Se materialetabellen for detaljer om reagenser, udstyr og dyr, der anvendes i denne undersøgelse.
1. Adeno-associeret virusinjektion
BEMÆRK: Mærkning af specifikke celler i nethinden kan udføres i Cre transgene muselinjer med begrænsede udtryksmønstre. Dette afsnit beskriver intravitreal levering af AAV-vektorer, der koder for Cre-afhængig ekspression af et fluorescerende protein og dermed mærker specifikke retinale celler. Injicer mus (mand og kvinde), startende ved 4 ugers alderen.
- Forberedelse af mikropipettenålen
- Brug en mikropipettetrækker til at skabe en borosilikatglaskapillærnål. Læg en glaskapillær i mikropipettettrækkeren, og udfør rampetesten, og registrer den resulterende værdi. Kassér glaskapillæren, der blev brugt til rampetesten.
- Træk mikropipetter med følgende indstillinger: varme: Rampetestværdi minus 10; træk: 55; hastighed: 65; tid: 120; lufttryk: 500; Sendetid ved træk start: 20.
BEMÆRK Indstillinger skal muligvis justeres for forskellige aftrækkere. - Under et dissekeringsmikroskop skal du bruge et barberblad til at skære spidsen af den trukne mikropipette på det sted, hvor glasspidsen afbøjes lidt under kraft, ~ 10 mm fra enden af den tilspidsede sektion. Skær i en skarp vinkel, således at snittet producerer en skrå spids. Kassér stumpe tip.
- Klargøring af injektionssprøjte
- Sæt en skåret glasmikropipette i et 2 cm segment af ethylvinylacetat (EVA) plastrør (0,05 " indvendig diameter, 0,09 " ydre diameter). Tilslut den anden ende af dette slangesegment til en 20 cm længde EVA-slange (0,02 " indvendig diameter, 0,06 " ydre diameter).
- Tilslut slangen til en 50 μL glassprøjte med en 22 G cementeret nål. Fjern stemplet fra glassprøjten, og fyld sprøjten og den tilsluttede slange op med mineralolie med en 25 G sprøjtenål. Efterlad 4 mm luftrum ved spidsen af mikropipetten.
- Intravitreal injektion af AAV
- Udfør intravitreal injektion med standard aseptisk teknik ved hjælp af sterile kirurgiske handsker, ren laboratoriefrakke, maske, sterilt felt og autoklaverede instrumenter i henhold til institutionelle protokoller for overlevelseskirurgi.
- Fjern en aliquot af AAV-vektor fra lageret ved -80 °C, og tø den op på is. Efter optøning centrifugeres i 10 s ved 2.000 × g for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Følg retningslinjerne for anæstesi og kontrollerede stoffer fra den institutionelle dyreforsøgskomité. Ved hjælp af en 30 G hypodermisk nål udføres en 0,1 ml / 10 g legemsvægt intraperitoneal (IP) injektion af en ketamin / xylazin cocktail (10 mg / ml ketamin, 1 mg / ml xylazin i saltvand, effektiv dosis til mus: 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin). Sæt musen tilbage i buret, og lad 5 minutter gå i gang med anæstesien.
- Brug en 30 G hypodermisk nål til at udføre en 0,1 ml / 10 g subkutan injektion af meloxicam (0,5 mg / ml i 0,9% natriumchlorid).
- Test dybden af anæstesi ved at bekræfte tab af hornhinderefleks og tilbagetrækningsrefleks til hale- og tåklemme. Hvis hornhinderefleks vedvarer efter tab af hale- og tåudtagningsrefleks, skal du anvende en dråbe 0,5% proparacainopløsning på hvert øje og vente i 10 s.
- Placer musen på sin side under stereomikroskopet. Brug en mini bulldog hæmostatisk klemme til at gribe huden bedre og ringere end kredsløbet, og fastgør klemmen ved den mediale canthus for delvist at forskyde kloden op af kredsløbet.
- Punktere den laterale sclera med den skårne mikropipette forbundet til glassprøjten, ~ 1-2 mm bageste til limbus. Undgå at forstyrre vaskulaturen, der løber omkreds umiddelbart bagud til limbus. Udfør punkteringen i en vinkel vinkelret på scleraen, og træk mikropipetten lidt tilbage umiddelbart efter gennemboring af sclera for at undgå at beskadige linsen.
- Brug glasstænkets stempel til at trække 1-2 μL glasagtig humor ud, hvilket svarer nogenlunde til væskevolumenet beregnet til injektion. Træk mikropipetten ud af øjet, og skub den fjernede glasagtige humor ud.
- Fyld spidsen af mikropipetten med 1-2 μL AAV, og efterlad ~ 4 mm luftrum mellem den virale vektor og mineralolien for at undgå blanding. Indsæt mikropipetten i hullet i sclera skabt ved den første punktering, og tryk langsomt på glasskrankens stempel for at injicere den virale vektor i løbet af 20-30 s. Visualiser væskeniveauet af den virale vektor i spidsen af mikropipetten, og pas på at stoppe injektionen, før der kommer luft ind i øjet.
- Hold mikropipetten i samme position i 10 s, og træk derefter mikropipetten tilbage. Fjern bulldog hæmostatisk klemme.
- Påfør oxytetracyclin / polymyxin B antibiotisk oftalmisk salve på det injicerede øje. Placer musen på en varmepude, og overvåg dens genopretning fra anæstesi (se 3.4.3).
- Returner musen til dens bolig, og udfør postoperativ pleje i henhold til institutionelle retningslinjer. Tillad 2-3 uger til viral-medieret ekspression af fluorophorer før billeddannelse.
2. Opsætning af mikroskop
BEMÆRK: Et skema over mikroskoplysstien er vist i figur 1.
- "Always-On"-udstyr: Disse instrumenter skal altid forblive tændt, medmindre de er under justering eller vedligeholdelse. Indstil laserkølesystemets høje temperatur til 20,0 °C. Tænd for hovedstrømmen til den ultrahurtige Ti:Sapphire-laser, giv tid til afslutning af systemstartprocesser, og drej "Laser Enable" -tasten til "On" -positionen.
- Konfiguration af emissionslysvej
- Konfigurer fluorescensemissionsindsamlingsstien til prøvebølgelængder ved hjælp af passende dikroiske og båndpasfiltersæt til fluorophorer af interesse.
BEMÆRK: I dette manuskript brugte Twitch2b-billeddannelse en filterterning bestående af en 505 long pass dikroic og 480/40 og 535/30 båndpasfilterpar. GFP blev afbildet ved hjælp af en rød / grøn filterterning bestående af et 560 long pass filter med 525/50 og 605/70 båndpasfiltre. Evans Blue blev afbildet ved hjælp af et 560 kort pass filter. Ændring af emissionsfiltre udsætter emissionslysvejen for vildfaren rumlys, der kan beskadige fotomultiplierrør (PMT'er). Sørg for, at PMT'er er slukket, og sluk for rumlyset, før du ændrer opsamlingslysstien, da lyseksponering kan påvirke PMT-funktionen negativt.
- Konfigurer fluorescensemissionsindsamlingsstien til prøvebølgelængder ved hjælp af passende dikroiske og båndpasfiltersæt til fluorophorer af interesse.
- Opstart af billedanskaffelse
BEMÆRK: Direkte eksponering for tofotonlaseren er farlig, især for øjet, da langt rødt lys ikke vil fremkalde et blinkrespons. Der skal udvises passende omhu for at sikre, at laseren lukkes langs lysbanen, og at der er fejlsikre for at beskytte brugeren mod eksponering via øjenstykkerne eller emissioner fra mikroskopmålet. Brugere bør forstå, under hvilke forhold laseren vil udsende fra målet, og tage passende forholdsregler for ikke at udsætte sig for sådanne farer.- Tænd for dataindsamlingsenheden, computeren, Pockels-cellen, mikroskopet og scenecontrolleren, den mekaniske lukkercontroller og PMT-hovedeffekten. Hold PMT'er i tilstanden "Deaktiveret", indtil de er klar til billedoptagelse og afskærmet fra omstrejfende lys. Åbn laserstyringsgrænsefladen på computeren og billedoptagelsessoftwaren. Tænd laseren fra computergrænsefladen, og sørg for tilstandslåsning.
- Indstil den ønskede laserbølgelængde. Sørg for, at laserlyset kommer ind i Pockels Cell ved at åbne laserlukkeren, og lad 30 minutter for laserkraften stabiliseres.
- Måling af lasereffekt ved målet og indstilling af maksimal laserprocent
BEMÆRK: Laserstråling udsendes fra objektivlinsen under effektmåling. Luk mikroskopkabinettets gardin, og brug passende øjenbeskyttelse, inden billedbehandlingslukkeren aktiveres. Mål lasereffekt på tidspunktet for den første systeminstallation for at etablere effektudgangskurven for hver bølgelængde af interesse og månedligt derefter for at verificere stabiliteten af excitationskraft.- Tænd for den optiske effektmåler, og vælg den målebølgelængde, der svarer til laserbølgelængden. Placer den optiske effektmålerdetektor på mikroskoptrinnet, og manøvrer den direkte under objektivlinsen i X-Y-dimensionerne. Brug det motoriserede fokusdrev i Z-dimensionen til at sænke objektivet, indtil effektmålerdetektoren er ~1 mm under objektivobjektivet.
- Skift fra epifluorescensbelysning til laseren som mikroskopet excitation lyssti. Aktiver den mekaniske lukker.
- I billedoptagelsessoftwaren skal du starte en punktscanning for at åbne billedlukkeren og sende laseren til den optiske effektmåler. Indstil lasereffekten til 100% i scanningssoftwaren. Optimer X-Y- og Z-positionerne for effektmålerdetektoren, indtil den højeste lasereffektmåling er opnået.
- Mål lasereffekten ved målet fra 0,1% til 100% på Pockels Cell, og tag målinger med 10% intervaller. Registrer Pockels Cell-procentdelen svarende til 45 mW effekt ved målet. Indstil denne procentdel som den maksimale lasereffekt i billedoptagelsessoftwaren.
BEMÆRK: Den højeste effekt, der blev observeret for in vivo-muse-retinal billeddannelse uden synlig skade på målvævet, var 45 mW, som analyseret ved histologisk farvning to uger efter billeddannelse. Tydelig nethindeskade er tydelig efter billeddannelse med 55 mW ved målet. - Deaktiver billedudløseren, og returner excitationslysstien til epifluorescens.
3. Forberedelse af mus til billedoptagelse
- Anæstesiering af mus til billeddannelse
BEMÆRK: Sørg for korrekt røggasrensning for at mindske eksponeringen for isofluran. Sørg for, at udstødningsporten i anæstesiinduktionskammeret er forbundet til en passiv rensningsgasfilterbeholder, og udløbet af musebedøvelsesnæsestykket er forbundet med en aktiv scavenging gasfilterbeholder med vakuum leveret af et gasevakueringsapparat. Følg producentens retningslinjer for overvågning af filterbeholderens vægt til udskiftning.- Bedøve musen ved hjælp af ketamin/xylazincocktailen som beskrevet ovenfor i trin 1.3.3. Alternativt kan du fremkalde anæstesi via isofluraninindånding, hvis du også bruger isofluran til vedligeholdelse af anæstesi (billeddannelse > 30 min). Indstil bedøvelsesanordningen til små dyr til at fylde induktionskammeret med 5% isofluran blandet med rumluft ved en strømningshastighed på 0,5 l / min. Placer musen i induktionskammeret, og lad 15 s for musen blive bedøvet.
- Skift isofluranfordamperen til 0%, og ret anæstesistrømmen til næsestykket. Udfør en 5-sekunders "O2 flush" af induktionskammeret. Tag musen ud af induktionskammeret, og fastgør den i hovedholderen (se pkt. 3.3), og fastgør næsestykket.
- Brug en blanding af 1% isofluran med rumluft ved en strømningshastighed på 0,5 l / min til vedligeholdelse af anæstesi. Overvåg respirationsfrekvensen med 5 minutters intervaller gennem anæstesi, juster isofluranprocenten for at opretholde en respirationsfrekvens på ~ 60 vejrtrækninger / min.
BEMÆRK: Disse indstillinger (% isofluran, strømningshastighed) kan også bruges til vedligeholdelse af anæstesi induceret af ketamin / xylazincocktailen.
- Pupil udvidelse
- Der fremstilles en opløsning af 1% w/v atropin og 2,5% w/v phenylephrinhydrochlorid i vand. Opbevar dilatatoropløsningen ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Brug en engangspipette øjendråber til at påføre en dråbe af dilatatoropløsningen på hvert øje, der vil blive afbildet. Sluk lyset i rummet, og vent 5 minutter på, at eleven udvider sig. Når pupillen er udvidet, skal du blotte dilatatoropløsningen med fnugfrit væv.
BEMÆRK: Sørg for, at dilatatoropløsningen ikke kommer ind i næseborene. - Påfør en stor dråbe smøremiddel øjengel på hvert øje, der vil blive afbildet. Hvis begge øjne skal afbildes, skal du anvende et lille stykke plastikklammende film over øjengelen på det ikke-billeddannende øje for at forhindre dehydrering. Hvis du kun forestiller dig et øje, skal du anvende smøremiddel øjensalve på øjet, der ikke vil blive afbildet.
- Placering af mus til billeddannelse
- For at fastgøre musen i billedhovedholderen skal du dreje hovedarmen på hovedholderen, indtil ørestykkestangen vippes i en vinkel på 60° eller mere under vandret. Fastgør den nederste øregangsstift i den indadgående forlængede position og overøregangens stift i den tilbagetrukne position.
- Med musen vendt mod bidestangen skal du montere det ene øre på den forlængede nederste stift og indsætte stiften i øregangen. Løsn skruen, der fastgør den øverste øregangsstift, og forlæng stiften ind i den anden øregang. Spænd skruen for at fastgøre hovedet.
- Skub bidestangen mod musens hoved. Løft forsigtigt musens hoved, og sænk derefter musens maksillære fortænder ned i hullet i bidstangen. Træk bidestangen tilbage med blid kraft for at fastgøre musens hoved, og fastgør bidestangens position ved at stramme skruen.
- Hvis du bruger isofluran, skal du skubbe næsestykket gennem dets åbning på bidestangen, inden du fastgør musens fortænder. Bidestangens position fastgøres og strammes som i trin 3.3.3. Spænd næsestykket med de to skruer på oversiden, indtil det sidder tæt på musens næse, men ikke indsnævrer snuden.
- Overfør musen i hovedholderen til mikroskoptrinnet under målet. Drej hovedarmen på hovedholderen, indtil øjets pupil er orienteret lige op i overensstemmelse med lysbanen (figur 2).
- Placer en #1.5 coverslip i den kompakte filterholder, og fastgør holderen til mikroskoptrinnet. Sænk dækslippet mod øjet, og kontakt smøremiddeløjegelen, således at dækslippet ligger vandret umiddelbart over hornhinden (figur 2). Sørg for, at dækslippet ikke rører hornhinden.
BEMÆRK: På mikroskopet skal du sikre dig, at excitationslysstien er indstillet til epifluorescens, og emissionslysstien er indstillet til okular. Tænd for epifluorescensbelysningen med den laveste effekt, og åbn lysudløseren. Vælg epifluorescensbelysningsbølgelængde og fluorescensfilter svarende til fluoroforen, der afbildes. - Manøvrer scenen i X-Y-dimensionerne og målet i Z-positionen ved hjælp af trinstyringen og motoriseret fokusdrev, indtil widefield-excitationslyset dækker hornhinden fuldt ud. Når du kigger gennem okularet, skal du fortsætte med at justere scenens Z-position, indtil de fluorescerende celler eller strukturer i nethinden kommer i fokus. Forøg epifluorescensbelysningseffekten, hvis prøvesignalet ikke er tilstrækkeligt lyst til at løse individuelle celler eller strukturer af interesse gennem okularet.
BEMÆRK: Hvis du har problemer med at finde nethinden, er iris et vartegn med høj kontrast at forankre på og derefter fokusere ned mod nethinden. Dette trin vil også muliggøre verifikation af, at eleven er maksimalt udvidet. - Få et billedområde på aksen med muselinsen. Juster musens vinkel ved hjælp af de forskellige frihedsgrader på hovedholderen, indtil der kun sker udvidelse eller sammentrækning af lys, der er ude af fokus, når fokusplanet justeres. Sluk for epifluorescensbelysningen, og luk lysudløseren.
BEMÆRK: Signifikant X-Y-parallakse af lys, der er ude af fokus, mens du ruller gennem Z-retningens fokusplaner, indikerer, at nethinden ikke er på aksen med hensyn til billeddannelseslysbanen.
4. Erhvervelse af to-fotonbilleder
- Parametre for opsætning og anskaffelse af billeder
BEMÆRK: Sluk for rumlys, og dæk omstrejfende lyskilder i rummet. Sørg for, at epifluorescensbelysningen er slukket, og at belysningslukkeren er lukket.- Skift excitationslysstien til laser- og emissionslysstien til PMT'erne.
- I billedoptagelsessoftwaren skal du indstille en rammestørrelse på 512 x 512 og rammegennemsnit på 3. Indstil trinene pr. skive til -8 μm. Udpeg z-trin for at starte øverst i stakken og gå nedad, hvilket minimerer to-foton laseraktivering af fotoreceptorer.
BEMÆRK: Trinstørrelsen kan reduceres for at øge Z-opløsningen til en pris af øget billeddannelsestid, men 8 μm trin er tilstrækkelige til at løse cellesomata i denne billeddannelseskonfiguration. - Tænd og aktiver PMT'erne. Juster PMT-spændingen til 680 V. Aktiver excitationslukkeren.
BEMÆRK: Drevne PMT'er er modtagelige for lette skader. Sørg for, at epifluorescensbelysningen er slukket, mikroskopkabinetgardinet er trukket, og rumbelysningen er slukket. - Start en forhåndsvisning af et levende billede af målvævet, startende med 1% lasereffekt. Juster automatisk skærmens lysstyrke for at visualisere de celler eller strukturer af interesse. Juster automatisk scanningsfasen. Hvis målvævet er svagt eller uklart, øges lasereffektprocenten, indtil strukturer bliver synlige uden at overskride den grænse, der er angivet i trin 2.4.4 svarende til 45 mW.
BEMÆRK: For et 16-bit billede angiver en visningsværdi på ~ 1000, når automatisk justering af lysstyrken i et Z-plan, der indeholder strukturer af interesse, tilstrækkelig lysstyrke af prøven. - Manøvrer mikroskoptrinnet i X-Y-retningen for at centrere sig om et ønsket billeddannelsesområde, og naviger derefter til Z-planet med de interessante strukturer i fokus.
BEMÆRK: Billeddannelse ved siden af det optiske nervehoved gør det muligt at tjene som et entydigt vartegn for kroniske billeddannelseseksperimenter. - Hvis dette er et kronisk time-lapse-eksperiment, skal du have et tidligere billede åbent på anskaffelsescomputeren og bruge det som reference til at finde det samme interesseområde. Sørg for, at billedvinklen svarer til tidligere billeder for at erhverve det samme sæt celler med minimal parallakse.
BEMÆRK: Yderligere justering af musehovedets position er sandsynligvis nødvendig for at afbilde de samme celler som i tidligere tidspunkter (figur 3). - Indstil Z-grænserne for billedstakken ved at navigere til de øverste og nederste Z-planer af interesse, og anskaf billedet. Når billedoptagelsen er afsluttet, skal du deaktivere PMT'erne og emissionslukkeren. Skift emissionslysstien tilbage til okularet og excitationslysstien til epifluorescensbelysning. Fjern musen fra mikroskoptrinnet.
- Nedlukning af systemsoftware og hardware
- Afslut billedoptagelsessoftwaren. Sluk for laseren i computergrænsefladen. Luk hardware i omvendt opstartsrækkefølge, med undtagelse af "Always-On" -udstyret.
- Mus opsving
- Fjern hovedholderen og musen fra mikroskoptrinnet. Hvis det er relevant, indstilles isofluranfordamperen til 0%. Fjern musen fra hovedholderen.
- Tør forsigtigt smøremiddeløjengelen af med et fnugfrit væv, og påfør hvid petrolatum-mineralsk oliesmøremiddel øjensalve på begge øjne. Placer musen på varmepladen med varmt vand, der cirkulerer (indstillet til 37 °C), fortsæt med at tage sig af musen og overvåge dens åndedrætsfrekvens, indtil musen vågner op og genvinder ambulant kapacitet. Returner musen til sit hus.
- Hvis det er relevant, vurderes dyreaktivitet og sygelighed ved 24 timer efter intravitreal injektion. Efter afslutningen af undersøgelsen aflives musen med en overdosis tribromoethanol (250 mg/kg) og udfører transkardial perfusion med 4% paraformaldehyd for at bevare retinalt væv.
5. Billedbehandling og analyse
- Deinterleave og flet multikanaldata
- Da visse billedoptagelsessoftwareprogrammer gemmer multikanalbilleder i et sammenflettet format, skal du åbne .tif-billedfilen ved hjælp af software, såsom Fiji (https://imagej.net/Fiji), for at adskille kanalerne.
- I Fijis billedmenu skal du vælge Stakke | Værktøjer | Deinterleave. Indtast antallet af kanaler, der komponerer billedet, og klik på OK.
- Hvis du vil flette de adskilte kanaler til en enkelt fil, skal du gå til Billede | Farve | Flet kanaler. Placer de deinterleavede billedkanaler i separate farvekanaler, og klik på OK for at oprette det sammensatte billede med flere kanaler. Gem dette sammensatte billede som en ny .tif fil.
- Kvantificering af fluorescensintensitet i multikanalbilleder
BEMÆRK: Fluorescensintensitet inden for udpegede interesseområder (ROI'er) kan kvantificeres i enkeltbilledplaner ved hjælp af Fiji. Kvantificering af ratiometriske aflæsninger kan opnås ved at måle fluorescensintensiteten i forskellige kanaler af et sammensat billede inden for samme ROI. Til kroniske billeddannelseseksperimenter er det bedst at bruge biosensorer baseret på excitations- eller emissionsforholdmetrisk output.- I Fiji skal du gå til Analyser | Værktøjer | ROI Manager. Åbn det sammensatte billede i Fiji. Rul til det z-udsnit, der svarer til interessestrukturen, og brug markeringsværktøjerne (f.eks. rektangelmarkering, ovalt valg, polygonvalg) til at skitsere investeringsafkastet.
- Tryk på T på tastaturet for at føje hvert valg til ROI Manager. Når du har gennemført ROI-valg, skal du klikke på Måling i ROI Manager for at registrere forskellige data fra ROI'erne, såsom område- og middelintensitetsværdi.
- Kopiér målingerne for den aktuelt valgte kanal, der er registreret i vinduet Resultater, til et regneark. Skift til den næste kanal i vinduet Sammensat billede, og klik på Mål for at få målinger for den kanal inden for det samme sæt investeringsafkast. Inden for ROI Manager skal du gå til Mere | Gem, og gem investeringsafkastene som en .zip fil.
- Fremskrivninger af maksimal intensitet til visning
- For at oprette visninger af billeddataene skal du bruge Z-projektfunktionen i Fiji. I menuen Billede skal du vælge Stak | Z-projektet. Vælg kun de rammer, inden for hvilke interesseområder er til stede for at reducere baggrunden.
- Hvis der ønskes fjernelse af PMT-skudstøj, skal du bruge Median-filterfunktionen. I menuen Proces skal du vælge Proces | Filtre | Median. Vælg en værdi på 1,0 for at bevare rumlige detaljer.
- For at oprette fremskrivninger med maksimal intensitet fokuseret på enkeltceller skal du gentage denne proces ved kun at vælge de billedrammer, der svarer til cellen af interesse.
BEMÆRK: Dette kan i høj grad forbedre evnen til at løse cellulære arbors (figur 4). Målinger af fluorescensintensitet bør udføres i enkeltbilledplaner og ikke på maksimale intensitetsfremskrivninger.
Representative Results
Forskellige transgene, virale vektor- eller uorganiske farvemærkningsmetoder kan bruges til specifikt at visualisere flere retinale celletyper og strukturer in vivo ved hjælp af en simpel tilpasning af et grundlæggende multifotonmikroskop. For at visualisere RGC'er og amakrine celler fik henholdsvis VGlut2-Cre og VGat-Cre transgene mus en intravitreal injektion af en Cre-afhængig AAV-ekspressionskonstruktion, der koder for Twitch2b, en cytoplasmisk fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret Ca 2+ sensor, der indeholder cyan og gule fluorescerende proteiner (henholdsvis CFP og YFP) og Ca2+ bindende domæne af troponin15 . I VGlut2-Cre-mus er RGC-somaer tydeligt synlige, og fascikler af axoner er ofte tydelige (figur 3).
Det skal bemærkes, at axonernes bane og det negative billede af vaskulaturen gør det meget ligetil at identificere det optiske nervehoved i VGlut2-Cre-mus, hvilket er nyttigt som et vartegn i kroniske billeddannelseseksperimenter (figur 3). Selvom amakrine celler ser mindre lyse ud end RGC'er, muligvis på grund af deres mindre somastørrelse og / eller mindre effektive AAV-transduktion, er deres somas stadig let synlige i det indre nukleare lag. I modsætning til RGC'er observeres amakrine celleneuritter oftere i de indre plexiformlag (figur 4). Retinal microglia kan afbildes i Cx3cr1-GFP transgene muselinje6. Microglia associeres med vaskulaturen, hvilket gør det muligt at finde den samme region i time-lapse billeddannelseseksperimenter.
Denne tilgang kan bruges til at spore dynamikken i fine microglia-processer, en procedure, der har bedre rumlig opløsning i enkeltplanbilleder, eller hvis der udarbejdes fremskrivninger med maksimal intensitet med fokus på individuelle celler (figur 5). Den dårlige aksiale opløsning forårsaget af optisk aberration gennem muselinsen udelukker undersøgelse af fine detaljer i z-dimensionen. For at afgøre, om denne billeddannelsesteknik kan observere degenerative ændringer i cellulær ultrastruktur, blev 1 μL 50 mM N-methyl-D-aspartat (NMDA) injiceret i glaslegemet for at inducere excitotoksisk læsion. En dag efter injektionen viste microglia korte processer eller amoeboid morfologi (figur 5) i overensstemmelse med tidligere rapporter16. Det skal bemærkes, at celler i den transgene Cx3cr1-GFP-linje udviste mere ensartet og komplet fluorescerende proteinekspression på tværs af den cellulære kohorte end i eksperimenter med AAV-medieret levering af fluorescerende proteinekspressionskassetter. Fordelene ved varieret og sparsom versus komplet og ensartet mærkning bør overvejes, når man designer eksperimenter.
For at mærke retinal vaskulatur som tidligere beskrevet8 blev mus injiceret intraperitonealt med 200 μL Evans blåt farvestof (20 mg / ml i sterilt saltvand) 30-60 minutter før billeddannelse. Dette førte til stærk mærkning af blodkar, der stammer fra det optiske nervehoved (figur 6). Overraskende nok fortsatte det fluorescerende signal om en enkelt injektion i mindst syv dage. To forskellige metoder blev brugt til at estimere dimensionerne af in vivo-billederne. Først blev de samme nethindeområder afbildet in vivo og efter fiksering i fladtrykte retinale helbjerge ved hjælp af konfokal mikroskopi (figur 7). Tilfældige cellepar blev udvalgt fra fire forskellige in vivo-prøver, og den sande afstand mellem cellepar blev målt i konfokale scanninger og matchet med in vivo-pixelafstand for at opnå en gennemsnitlig pixelstørrelse på 0,99 μm med 1x digital forstørrelse. Brug af lignende metoder, der korrelerer in vivo-billeder med konfokale helmonterede scanninger, har afsløret, at en enkelt hovedposition giver mulighed for billeddannelse over en ca. 650 mm2 patch af nethinden.
Omplacering af hovedholderen langs en vridningsakse kan give adgang til et lineært område af nethinden 2,2 mm i længden (ikke vist). Endvidere blev fluorescerende mikrosfærer med en diameter på 1 eller 2 μm injiceret i musenes øjne, og deres diameter blev målt som fuld bredde halvt maksimum af linjescanninger fra in vivo-billeder med 10x digital zoom. Dette gav et lidt større pixelstørrelsesestimat, men med større varians (figur 7). Samlet set er konfokal billeddannelse af helmonterede prøver efter afslutning af in vivo-eksperimenter den mest konsekvente metode til at tildele skala til individuelle billeder, da varians i hornhinde- og linseegenskaber kan ændre billedskala fra prøve til prøve.
Figur 1: Lysvej skematisk. De grundlæggende komponenter i to-fotonmikroskopet, der anvendes i denne protokol, består af en Pockels-celle til modulering af laserkraft, et linsepar til at reducere laserstrålediameteren for at matche mikroskopmålets bagåbning og et par galvo-scanningsspejle til strålestyring. Et par styrespejle er til stede før hver større optisk komponent. Fokus styres af en motor, der driver målbeslaget. Emissionslysvejen kan tilpasses til forskellige fluorophorer ved at udskifte dikroiske og barrierefiltre. Der vises en generel opsætning til cyan / gul / rød billeddannelse, hvor et kort pass dikroisk spejl leder rødt lys til den første PMT, og et langt pass dikroisk spejl parret med passende båndpasfiltre bruges til at adskille cyan og gule emissioner. Forkortelse: PMT = fotomultiplier rør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Positionering af mus til in vivo-billeddannelse. For at placere musen med eleven på aksen med lysbanen fastholdes den bedøvede mus først i en hovedholder, hovedet drejes og vinkles, en stor dråbe smøremiddeløjegel placeres på øjet, og musen placeres på scenen. En coverslip er monteret i coverslipholderen vinkelret på lysbanen og sænket ned mod øjet. Dækslikket bør ikke komme i kontakt med hornhinden eller musehovedet (til venstre), hvilket vil være tydeligt, hvis dækslippet afbøjes. Dækslikket skal dog også være tæt nok til at undgå talje af dråben (højre), fordi dette vil have en forsvækkende virkning på prøven. Efter påføring af gelnedsænkningen og fastgørelse af dækslippet skal trinnet flyttes på plads direkte under mikroskopmålet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeddannelse af retinale ganglionceller. Til billedvisning oprettes projektioner med maksimal intensitet med z-planerne, der indeholder celler af interesse, og resulterende billeder er medianfiltreret for at fjerne PMT-skudstøj. To eksempler på retinale ganglionceller mærket ved at injicere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus vises, specifikt CFP-signalet. Billeder blev erhvervet ved sessioner med fire dages mellemrum, og vaskulære vartegn blev brugt til at vende tilbage til den samme region nær synsnervehovedet. Det optiske nervehoved er orienteret mod bunden af billedet. Selvom begge prøver viser en vis varians i orientering (regioner med nedsat intensitet er angivet med pile), er de fleste celler til stede på begge tidspunkter. Skala bar = ca. 50 μm. Forkortelser: PMT = fotomultiplier rør; AAV = adeno-associeret virus; EF1α = forlængelsesfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2; CFP = cyan fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Billeddannelse af amakrine celler. Amacrine celler blev mærket ved at injicere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGat-Cre transgene mus. CFP-signalet fra Twitch 2b vises specifikt. Små maksimale intensitetsfremskrivninger fokuseret på dybden af det indre nukleare lag indikerer amakrine cellesomas, mens fokus på den indre plexiform løser amakrine celleneuritter (pil). Det optiske nervehoved er orienteret mod højre for billedet. Skala bar = ca. 50 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; EF1α = forlængelsesfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGat = vesikulær gamma aminosmørsyretransportør; CFP = cyan fluorescerende protein; INL = indre nukleart lag; IPL = indre plexiformlag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Billeddannelse microglia. Den transgene muselinje Cx3cr1-GFP blev brugt til at mærke microglia. En maksimal intensitetsprojektion af den fulde scanningsvolumen viser mange mikroglia, nogle med fine procesdetaljer, der kan løses. Bemærk, at celler nederst til venstre i feltet har mindre forvrængning i den maksimale projektion end dem mod øverste højre på grund af parallakse i denne region. Maksimale intensitetsfremskrivninger, der kun indeholder cellen af interesse, reducerer denne parallakse betydeligt (center, bokset i tilsvarende farver). Desuden kan denne billeddannelsesstrategi dokumentere dynamikken i fin microglia-procesombygning (nedre paneler). Til sammenligning kan mange microglia ses med korte processer eller amoeboid morfologi en dag efter en excitotoksisk læsion ved intravitreal injektion af 50 mM NMDA (højre). Skala bar = ca. 50 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; Cx3cr1 = Cx3 kemokinreceptor 1; NMDA = N-methyl-D-aspartat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Mærkning af vaskulære vartegn. Mus blev injiceret med 200 μL 20 mg / ml Evans blå intraperitonealt 30-60 minutter før den første billeddannelsessession. Fremskrivninger med maksimal intensitet i fuld tykkelse viser varig fluorescens i retinal vaskulaturen, der vedvarede i mindst syv dage. Skalabjælke = ca. 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Billeddimensioner. Retinale ganglionceller mærket ved at injicere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus blev afbildet in vivo, og den samme region blev derefter afbildet ved konfokal laserscanningsmikroskopi efter fiksering og helmonteret forberedelse af nethinden. Gul fluorescerende proteinkanal er vist for begge. Farvede pilepar angiver den samme celle i begge præparater (øvre paneler). Enkeltplansbillede af fluorescerende mikrosfærer med en diameter på 2 μm injiceret intravitreally og afbildet in vivo (nederste venstre panel). Mikrosfærer satte sig ikke og var således i konstant bevægelse, hvilket gjorde måling af aksial opløsning umulig. Pixelstørrelser beregnet ud fra halvmaksimumsmålinger i fuld bredde af in vivo fluorescerende mikrosfærer eller korrelative konfokale målinger taget fra 2-4 nethinder pr. gruppe (nederst til højre). Skala bar = 50 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; EF1α = forlængelsesfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Calciumaktivitet induceret af to-foton scanning. Retinale ganglionceller mærket ved at injicere AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b i VGlut2-Cre transgene mus, YFP er pseudofarvet magenta og CFP grøn, afbildet i et enkelt plan som en tidsserie ved 4,22 Hz. Alle RGC'er havde et lignende start-YFP/CFP-forhold. De fleste reagerede med en stigning i FRET-forholdet (eksklusive den orange celle), og man opretholdt et højt YFP / CFP-forhold i hele tidsserien (gul celle). YFP / CFP-forhold blev normaliseret til det første rammegennemsnit, og farvede cirkler matcher med farvede spor. Stjerner angiver tidspunkter med repræsentative billeder vist til venstre. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AAV = adeno-associeret virus; EF1α = forlængelsesfaktor-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = vesikulær glutamattransportør 2; YFP = gult fluorescerende protein; CFP = cyan fluorescerende protein; RGC'er = retinale ganglionceller; FRET = fluorescensresonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den to-foton billeddannelsesprocedure, der er beskrevet heri, muliggør langsgående in vivo-billeddannelse af musens nethinde. Repeterbare billeder af samme nethinden kan opnås i en kontinuerlig periode på op til 6 eller mere h under isofluran. Musen kan også afbildes på forskellige dage ved hjælp af cellulære og vaskulære landemærker for at lokalisere det samme billedområde (figur 3). Brugen af en klar gelnedsænkning kombineret med dækglas til dette formål er tidligere blevet anvendt på en række procedurer, herunder visualisering af nethinden til subretinal injektion, laserinducerede retinale skademodeller og fundusbilleddannelse20,21,22.
Øjets anatomi giver unikke udfordringer for in vivo-billeddannelse, da musens hornhindes og linsens høje optiske kraft hindrer direkte billeddannelse gennem eleven uden korrektion. Flere andre in vivo-billeddannelsesmetoder er afhængige af brugen af en plano-konkav kontaktlinse til korrektion af museøjets forreste optik 7,17,18,19. Med kun optisk korrektion ved hornhinden resulterer muselinsens høje optiske kraft i en uundgåelig mængde parallakse, især af strukturer i det perifere scanningsfelt, der manifesterer sig som strækning og translationel bevægelse i X-Y-dimensionen ved forskellige Z-planer. For at minimere billedparallakserelateret forvrængning i X- og Y-dimensioner er det afgørende, at museøjet er orienteret, således at tangentplanet til nethinden ved billedområdet er vinkelret på mikroskopets lysbane. Opsætningen beskrevet her er befordrende for præcis manipulation af øjets vinkel for at opnå denne justering. En justerbar musehovedholder, der tillader rotation langs to akser, giver mulighed for nem manuel justering af øjets vinkel, når eksperimentatoren ruller gennem Z-dimensionen for at minimere parallakse. Denne hældning omgår også pupillens feltstopeffekt for at muliggøre billeddannelse af større områder af nethinden. Fastholdelsen af hovedholderen reducerer også i høj grad bevægelsesartefakter forårsaget af åndedræt.
Der skal udvises forsigtighed for at bevare klarheden i museøjet, da billedkvaliteten forringes med opacification under kontinuerlig billeddannelse. Hyppig genanvendelse af smøremiddelgel under billeddannelse og salvepåføring efter hver billeddannelsessession hjælper med at forhindre øjet i at tørre og udvikle opaciteter. Nogle hornhindeopaciteter vil spontant løse efter 24-48 timer. Brugen af klar gel og dækglas som beskrevet i denne protokol giver mulighed for lignende billedkvalitet og aberrationskorrektion som en kontaktlinse7, samtidig med at det giver mulighed for lettere justering af øjenvinklen uden behov for at justere dækglasset. Derudover giver gelen kontinuerlig hydrering til øjet, hvilket gør det muligt at udføre akutte billeddannelsessessioner på op til flere timer. Endelig, da dækglasset ikke kommer i kontakt med hornhinden, forårsager det minimal irritation af øjet, hvilket kan reducere optisk klarhed til gentagne billeddannelsessessioner.
En begrænsning af denne tilgang er, at optiske afvigelser ikke er helt korrigeret. Mens dette alvorligt mindsker aksial opløsning på grund af den tunge parallakse, kan kvantitative målinger af soma opnås i enkeltbilledplaner. Det skal bemærkes, at da fluorescenssignalintensiteten af retinale neuroner er afhængig af prøvejustering med denne metode, er excitations- og emissionsforholdetrisk baserede sensorer mere egnede til eksperimenter, der sammenligner prøver kronisk på tværs af forskellige billeddannelsessessioner. En tilgang til at korrigere optiske aberrationer på systemniveau er adaptiv optik, som giver mulighed for subcellulær opløsning i nethinden 8,9,14,21. Adaptiv optik kræver dog højt specialiseret udstyr og omfattende ekspertise at implementere.
Alternative tilgange til to-foton in vivo retinal billeddannelse er konfokal mikroskopi eller oftalmoskopi6. Den tilgang, der præsenteres her, bør let kunne oversættes til widefield eller konfokal mikroskopi. Enkeltfotonbilleddannelse er måske mere robust og udgør mindre risiko for at beskadige nethinden på grund af høj energi fra den to-fotonlaser, der er nødvendig for at opnå effektiv to-fotoneffekt gennem hornhinden og øjets linse. For at undgå to-foton laserskader bør tærsklen for maksimal lasereffekt bestemmes empirisk ved at undersøge helmonterede nethinder efter afslutning af billeddannelseseksperimenter og immunostaining for celletyper i de afbildede lag. I det system, der præsenteres her, blev RGC'er mærket med pan-RGC-markøren, Rbpms, og tætheder var normale op til 45 mW billeddannelseseffekt, mens 55 mW forårsagede et betydeligt tab af RGC'er (ikke vist).
En ulempe ved enkeltfotonbilleddannelse er det faktum, at denne tilgang meget kraftigt vil stimulere de indfødte visuelle kredsløb i nethinden sammenlignet med to-fotonbilleddannelse23. Tidligere forsøg med retinale helmonteringer eller øjenkoppræparater har vist, at to-foton laserscanning fremkalder kredsløbsaktivering, der stort set er forbigående24. Her viser billeddannelse af RGC-aktivitet med Ca 2+ sensoren Twitch2b, at starten på laserscanning inducerer Ca 2+ højder, som vender tilbage til baseline i løbet af5-20 s i de fleste RGC'er (figur 8). I betragtning af at laserkraften i denne protokol ligger inden for rækkevidden af tidligere eksperimenter, der rapporterer in vivo retinal lysrespons8, er den aktuelt beskrevne metode sandsynligvis modtagelig for optagelser af kredsløbsaktivitet i nethinden. Sådanne overvejelser er vigtige for eksperimenter, der kan påvirkes af kredsløbsaktivitet.
Denne protokol demonstrerer in vivo billeddannelse af to typer retinale neuroner, RGC'er og amakrine celler. Lignende mærkning af andre større celletyper kan opnås, herunder vandrette celler (Cx57-Cre 25), bipolære celler (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), keglefotoreceptorer (S- eller M-opsin-Cre 28), stangfotoreceptorer (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) og pericytter (NG2-DsRed9). Transgene mus er også tilgængelige til mærkning af diskrete delmængder af RGC'er (f.eks. KCNG4-Cre for αRGCs30; OPN4-Cre til ipRGCs31; JAM-B-CreER til J-RGC'er 32) og amakrine celler (f.eks. ChAT-Cre til starburst amacrine celler26 og neuropeptid promotor drivere til forskellige amakrine celle undertyper 3,34). Virale vektorer kan bruges til at målrette mod specifikke cellepopulationer i stedet for transgene mus. Intravitreale injektioner af AAV2 med et allestedsnærværende CAG-promotorelement mærker næsten udelukkende RGC'er, amakrine celler og vandrette celler25. Parring af den modificerede AAV2.7m8-Y444F capsid med en konstrueret mGluR6 promotorkonstruktion muliggør bred mærkning af ON bipolære celler35. Subretinale injektioner af AAV fører til en berigelse af fotoreceptorer, hvor serotype AAV2/5 har den højeste transduktionseffektivitet36. Shh10, et modificeret AAV6 capsidprotein, parret med glialfibrillære sure proteinpromotorelementer, er blevet demonstreret specifikt for Müller glia37.
Evnen til at observere celler i centralnervesystemet med en fuldstændig ikke-invasiv tilgang kan bruges til at studere både grundlæggende egenskaber ved neurale kredsløb8 såvel som mekanismer for neurodegeneration 3,4,5,6,38. Mange blændende sygdomme er målrettet mod cellulære populationer i nethinden, og in vivo-billeddannelsesmetoder hos mus er blevet brugt til at studere optisk nerveskade 1,3,4, makuladegeneration13, slagtilfælde 5, glaukom 2,6 og uveitis 7. Desuden manifesterer mange neurodegenerative tilstande i centralnervesystemet sig i nethinden, herunder Alzheimers sygdom39, multipel sklerose40 og Parkinsons sygdom41. Derfor kan denne let tilgængelige teknik til in vivo-billeddannelse af nethinden anvendes som et værktøj til at studere et bredt sæt neurodegenerative tilstande.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award til P.R.W. og et ubegrænset tilskud til Institut for Oftalmologi og Visuelle Videnskaber ved Washington University School of Medicine i St. Louis), National Glaucoma Research (et program fra BrightFocus Foundation) og McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. støttes af en Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Dette arbejde blev også støttet af Hope Center Viral Vectors Core ved Washington University School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
- Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Scientific Reports. 8 (1), 1490 (2018).
- Liu, H., Ding, C. Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).
- Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), 40352 (2012).
- Leung, C. K., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).
- Murata, H., et al. Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. Journal of Visualized Experiments. (99), e52731 (2015).
- Bremer, D., et al. Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer. Frontiers in Immunology. 7, 642 (2016).
- Qin, Z., et al. Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo. Light: Science & Applications. 9, 79 (2020).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Williams, D. R. Imaging single cells in the living retina. Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).
- Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).
- Rossi, E. A., et al. Imaging retinal mosaics in the living eye. Eye. 25 (3), 301-308 (2011).
- Rossi, E. A., et al. In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration. Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).
- Geng, Y., et al. Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye. Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Takeda, A., et al. Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells. Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).
- Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice. Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (102), e53030 (2015).
- Biss, D. P., et al. In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics. Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Palczewska, G., et al. Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).
- Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).
- Zhang, Y., et al. Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
- Akimoto, M., et al. Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).
- Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors. Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion. Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. Genetically targeted binary labeling of retinal neurons. Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).
- Lu, Q., et al. AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates. Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).
- Yao, K., et al. Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas. Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).
- Williams, P. R., et al. A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo. Nature Communications. 5, 5683 (2014).
- Cheung, C. Y., et al. Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).
- Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. Retinal pathologic changes in multiple sclerosis. Retina. 14 (5), 445-451 (1994).
- Sung, M. S., et al. Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease. Scientific Reports. 9 (1), 11832 (2019).
