Summary
体内成像是研究健康和疾病生物学的有力工具。该协议描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像。它还展示了不同的活体成像方法，以荧光标记视网膜的多个细胞队列。
Abstract
视网膜将来自环境的光信号转换为传播到大脑的电信号。视网膜疾病很普遍，会导致视力障碍和失明。了解这些疾病如何进展对于制定新的治疗方法至关重要。疾病动物模型中的体内显微镜是了解神经变性的有力工具，并在治疗从阿尔茨海默病到中风等疾病方面取得了重要进展。鉴于视网膜是唯一可以通过光学方法固有的中枢神经系统结构，它自然适合体内成像。然而，晶状体和角膜的原生光学元件对有效的成像访问提出了一些挑战。
该协议概述了以细胞分辨率对小鼠视网膜中的细胞队列和结构进行体内双光子成像的方法，适用于急性和慢性持续时间的成像实验。它提供了使用一套标记技术（包括腺相关病毒 （AAV） 载体、转基因小鼠和无机染料）的视网膜神经节细胞 （RGC）、无分泌细胞、小胶质细胞和血管成像的示例。重要的是，这些技术扩展到视网膜的所有细胞类型，并描述了访问其他感兴趣细胞群的建议方法。还详细介绍了用于显示和量化的手动图像后处理的示例策略。这些技术直接适用于视网膜功能在健康和疾病中的研究。
Introduction
中枢神经系统的体内可视化通常需要侵入性手术，如颅骨变薄和安装玻璃窗或光学中继透镜。视网膜是神经系统中唯一可以直接观察到的结构，无需侵入性准备，因为它本身接收来自环境的光。光学进入视网膜的便利性使其成为研究中枢神经系统的有吸引力的模型系统。
小鼠视网膜的实时荧光成像已被用于跟踪青光眼1，2，视神经损伤1，3，4和中风5模型中的RGC死亡，以及退行性疾病中小胶质细胞激活6，7，8和脉管系统9的变化。内在信号也可用于可视化光感受器10，11，12和视网膜色素上皮细胞13。许多视网膜活体成像方法使用专为眼科目的设计的高度专业化的设备6或高度修改的光学系统来校正角膜和晶状体的天然像差8，9，11，12，13，14。
本协议展示了一种以细胞分辨率对视网膜中的荧光信号进行体内成像的方法，利用部分校正小鼠眼睛前光学的基本方法。这种策略需要对通常用于大脑体内成像的多光子显微镜设置进行非常小的调整。由于这种方法易于设置，并且小鼠承受的压力很小，因此有利于在急性和慢性持续时间内进行延时实验。此外，标记单个视网膜成分（包括RGC，无杏碱细胞，小胶质细胞和脉管系统）的基于遗传和有机染料的程序与这种成像技术兼容，并且能够体内观察对视网膜功能至关重要的细胞类型和结构。这些工具可以适用于标记大多数其他神经元细胞类型以及视网膜的神经胶质和血管成分。
Protocol
注意：以下程序是根据圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的指导方针执行的。有关本研究中使用的试剂、设备和动物的详细信息，请参阅 材料表 。
1.腺相关病毒注射
注意：视网膜中特定细胞的标记可以在表达模式受限的Cre转基因小鼠系中完成。本节描述编码荧光蛋白Cre依赖性表达的AAV载体的玻璃体内递送，从而标记特定的视网膜细胞。注射小鼠（雄性和雌性），从4周龄开始。
- 制备微量移液器针头
- 使用微量移液器拉拔器制作硼硅酸盐玻璃毛细管针。在微量移液器拉拔器中装入玻璃毛细管并执行斜坡测试，记录结果值。丢弃用于斜坡测试的玻璃毛细管。
- 使用以下设置拉动微量移液器：加热：斜坡测试值减去10;拉力：55;速度：65;时间：120;气压：500;拉动开始时的空气时间：20。
注意 可能需要针对不同的拉拔器调整设置。 - 在解剖显微镜下，使用剃须刀片在玻璃尖端在力作用下略微偏转的位置切割拉动微量移液器的尖端，距离锥形部分的末端~10毫米。以锐角切割，使切割产生斜角尖端。丢弃钝头。
- 准备注射器
- 将切割好的玻璃微量移液器装入 2 cm 的醋酸乙烯乙酯 （EVA） 塑料管段（0.05 英寸内径，0.09 英寸外径）。将此管段的另一端连接到 20 cm 长的 EVA 管（0.02“ 内径，0.06” 外径）。
- 将管子连接到带有 22 G 水泥针头的 50 μL 玻璃注射器。从玻璃注射器中取出柱塞，并使用25 G注射器针头用矿物油回填注射器和连接的管子。在微量移液器的尖端留出4毫米的空气空间。
- 玻璃体内注射AAV
- 根据生存手术的机构方案，使用无菌手术手套、干净的实验室外套、面罩、无菌区域和高压灭菌器械，使用标准无菌技术进行玻璃体内注射。
- 从-80°C的储存中取出等分试样的AAV载体，并在冰上解冻。解冻后，以 2，000 × g 离心 10 秒以去除任何气泡。
- 遵循机构动物研究委员会的麻醉和受控物质指南。使用 30 G 皮下注射针头，腹膜内 （IP） 注射 0.1 mL/10 g 体重氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（10 mg/mL 氯胺酮，1 mg/mL 甲苯噻嗪盐水，小鼠有效剂量：100 mg/kg 氯胺酮、10 mg/kg 甲苯噻嗪）。将小鼠放回笼子并等待5分钟以使麻醉生效。
- 使用 30 G 皮下注射针头，皮下注射 0.1 mL/10 g 体重的美洛昔康（0.5 mg/mL 的 0.9% 氯化钠溶液）。
- 通过确认角膜反射丧失和尾部和脚趾夹伤的退出反射来测试麻醉深度。如果失去尾巴和脚趾撤回反射后角膜反射仍然存在，则在每只眼睛上滴0.5%丙帕卡因溶液并等待10秒。
- 将鼠标侧放在体视显微镜下。使用迷你斗牛犬止血钳抓住眼眶上下的皮肤，并将夹子固定在内眦处，使眼球部分移出眼眶。
- 用连接到玻璃注射器的切割微量移液器刺穿巩膜外侧巩膜，在角膜缘后方~1-2毫米。避免干扰紧靠角膜缘后方的脉管系统。以垂直于巩膜的角度进行穿刺，并在刺穿巩膜后立即稍微缩回微量移液器，以避免损坏晶状体。
- 使用玻璃注射器的柱塞抽出1-2μL玻璃体液，大致对应于用于注射的液体量。从眼睛中取出微量移液器，并弹出去除的玻璃体液。
- 用 1-2 μL AAV 填充微量移液器的尖端，在病毒载体和矿物油之间留出 ~4 mm 的空气空间以避免混合。将微量移液管插入由第一次穿刺产生的巩膜孔中，并在20-30秒的过程中缓慢按压玻璃注射器的柱塞以注射病毒载体。可视化微量移液器尖端病毒载体的液位，并注意在任何空气进入眼睛之前停止注射。
- 将微量移液器保持在同一位置10秒，然后缩回微量移液器。取下斗牛犬止血钳。
- 将土霉素/多粘菌素 B 抗生素眼药膏涂抹在注射的眼睛上。将鼠标放在加热垫上，并监测其从麻醉中恢复（见3.4.3）。
- 将小鼠放回其外壳，并根据机构指南进行术后护理。成像前允许病毒介导的荧光团表达 2-3 周。
2. 显微镜设置
注：显微镜光路示意图如图 1所示。
- “始终在线”设备：除非进行调整或维护，否则这些仪器应始终保持打开状态。将激光冷却系统的高温设置为20.0°C。 打开超快Ti：Sapphire激光器的主电源，留出时间完成系统启动过程，然后将“激光启用”键转到“On”位置。
- 发射光路配置
- 使用适合目标荧光团的二向色性和带通滤光片组配置荧光发射收集路径以采样波长。
注意：在本手稿中，Twitch2b 成像使用了一个由 505 长通二向色性以及 480/40 和 535/30 带通滤光片对组成的滤光片立方体。GFP使用红色/绿色滤光片立方体成像，该滤光片由560长通滤光片与525/50和605/70带通滤光片组成。Evans Blue使用560短通滤波器进行成像。更换发射滤光片会使发射光路暴露在杂散的室内光下，这可能会损坏光电倍增管 （PMT）。确保 PMT 已关闭，并在修改收集光路之前关闭室内灯，因为光照会对 PMT 功能产生不利影响。
- 使用适合目标荧光团的二向色性和带通滤光片组配置荧光发射收集路径以采样波长。
- 启动图像采集
注意：直接暴露于双光子激光是危险的，尤其是对眼睛，因为远红光不会引起眨眼反应。应采取适当的措施，确保激光沿光路闭合，并设置故障保险装置，以保护用户免受目镜照射或显微镜物镜的发射。用户应了解激光将在哪些条件下从物镜发射，并采取适当的预防措施，以免将自己暴露在此类危险中。- 打开数据采集设备、计算机、Pockels单元、显微镜和载物台控制器、机械快门控制器和PMT主电源。使PMT保持“禁用”状态，直到准备好进行图像采集并屏蔽杂散光。打开电脑和图像采集软件上的激光控制界面。从计算机界面打开激光器并确保锁模。
- 设置所需的激光波长。通过打开激光快门确保激光进入Pockels单元，并等待30分钟以使激光功率稳定下来。
- 测量物镜上的激光功率并设置最大激光百分比
注意：在功率测量期间，激光辐射从物镜发射。关闭显微镜外壳窗帘，并在启用成像快门之前佩戴适当的护目镜。在初始系统安装时测量激光功率，以建立每个感兴趣波长的功率输出曲线，此后每月测量一次，以验证激发功率的稳定性。- 打开光功率计，选择激光波长对应的测量波长。将光功率计检测器放在显微镜载物台上，并在X-Y尺寸的物镜下直接操纵它。使用Z尺寸电动对焦驱动器，降低物镜，直到功率计检测器低于物镜~1 mm。
- 从落射荧光照明切换到激光作为显微镜激发光路。启用机械快门。
- 在图像采集软件中，启动点扫描以打开成像快门，并将激光发送到光功率计。在扫描软件中将激光功率设置为 100%。优化功率计探测器的 X-Y 和 Z 位置，直到达到最高的激光功率测量值。
- 在Pockels单元上测量0.1%至100%物镜的激光功率，以10%的间隔进行测量。记录对应于物镜处45 mW功率的Pockels单元百分比。在图像采集软件中将此百分比设置为最大激光功率。
注意：在体内小鼠视网膜成像中观察到的最高功率没有对目标组织造成可见损伤，如成像后两周的组织学染色所测定的那样。在物镜处以55 mW成像后，明显的视网膜损伤很明显。 - 禁用成像快门并将激发光路恢复为落射荧光。
3. 图像采集用鼠标的准备
- 用于成像的麻醉小鼠
注意：确保适当的废气清除，以减少异氟醚的暴露。确保麻醉诱导室的排气口连接到被动清除气体过滤器罐，并且小鼠麻醉物镜转换器的出口连接到由气体疏散装置提供的真空的主动清除气体过滤器罐。请遵循制造商的指南来监控过滤器罐重量以进行更换。- 如上述步骤1.3.3中所述，使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。或者，如果也使用异氟醚维持麻醉（成像会议>30分钟），则通过异氟烷吸入诱导麻醉。设置小动物麻醉装置，以0.5 L / min的流速将5%异氟醚与室内空气混合填充诱导室。将小鼠置于诱导室中，并等待15秒以使小鼠麻醉。
- 将异氟醚蒸发器切换到 0%，并将麻醉流引导至物镜转换器。对感应室进行 5 秒钟的“O2 冲洗”。将鼠标从感应室中取出，并将其固定在头架中（见第 3.3 节），连接物镜转换器。
- 使用1%异氟醚与室内空气的混合物，流速为0.5 L / min以维持麻醉。在整个麻醉过程中每隔 5 分钟监测一次呼吸频率，调整异氟醚百分比以保持 ~60 次呼吸/分钟的呼吸频率。
注意：这些设置（%异氟醚，流速）也可用于维持氯胺酮/甲苯噻嗪混合物诱导的麻醉。
- 瞳孔扩张
- 在水中制备1%w/v阿托品和2.5%w/v盐酸去氧肾上腺素的溶液。将扩张器溶液储存在室温避光。
- 使用一次性移液器滴管，将一滴扩张器溶液滴在每只将要成像的眼睛上。关掉房间的灯，等待5分钟让瞳孔扩张。当瞳孔散大时，用无绒组织吸干扩张器溶液。
注意：确保扩张器溶液不会进入鼻孔。 - 在每只将要成像的眼睛上涂抹一大滴润滑性眼部凝胶。如果要对双眼进行成像，请在非成像眼睛的眼部凝胶上涂上一小块塑料保鲜膜以防止脱水。如果只对一只眼睛进行成像，请在不会成像的眼睛上涂抹润滑性眼膏。
- 用于成像的定位鼠标
- 要将鼠标固定在成像头架中，请旋转头架的主臂，直到听筒杆倾斜到水平以下 60° 或更大角度。将下耳道销固定在向内伸展位置，将上耳道销固定在缩出位置。
- 当鼠标面向咬杆时，将一只耳朵安装在伸出的下针上，将针插入耳道。松开固定上耳道销的螺钉，然后将销伸入另一个耳道。拧紧螺钉以固定头部。
- 将咬杆滑向鼠标头部。轻轻抬高小鼠头部，然后将小鼠的上颌门牙降低到咬杆的孔中。用力轻轻缩回咬杆以固定鼠标头，并通过拧紧螺钉固定咬杆位置。
- 如果使用异氟醚，请在固定鼠标门牙之前将物镜转盘通过其插槽滑到咬杆上。固定并拧紧咬杆位置，如步骤3.3.3所示。使用其上表面的两个螺钉拧紧物镜转换器，直到它紧贴鼠标的鼻子，但不会收缩鼻子。
- 将头架中的鼠标转移到物镜下方的显微镜载物台上。旋转头架的主臂，直到眼睛的瞳孔垂直向上，与光路对齐（图2）。
- 将#1.5盖玻片放入紧凑型滤光片支架中，并将支架连接到显微镜载物台上。将盖玻片朝向眼睛降低，接触润滑性眼部凝胶，使盖玻片水平位于角膜上方（图2）。确保盖玻片不接触角膜。
注意：在显微镜上，确保将激发光路设置为落射荧光，将发射光路设置为目镜。以最低功率打开落射荧光照明器并打开照明器快门。选择与正在成像的荧光团相对应的落射荧光照明器波长和荧光滤光片。 - 使用载物台控制和电动聚焦驱动器在X-Y尺寸上操纵载物台，并在Z位置操纵物镜，直到宽场激发光完全覆盖角膜。通过目镜观察，继续调整载物台的Z位置，直到视网膜中的荧光细胞或结构进入焦点。如果样品信号不够亮，无法通过目镜分辨感兴趣的单个细胞或结构，则增加落射荧光照明器的功率。
注意：如果难以定位视网膜，虹膜是一个高对比度的标志，可以锚定，然后向下聚焦到视网膜。此步骤还将允许验证瞳孔是否最大扩张。 - 使用鼠标镜头在轴上获取成像区域。使用头架上的各种自由度调整鼠标的角度，直到调整焦平面时仅发生失焦光的扩展或收缩。关闭落射荧光照明器并关闭照明器快门。
注意：滚动Z方向焦平面时，失焦光的显着X-Y视差表明视网膜相对于成像光路不在轴上。
4. 双光子图像采集
- 图像设置和采集参数
注意：关闭房间灯，并盖住房间内的杂散光源。确保落射荧光照明器已关闭，并且照明器快门已关闭。- 将激发光路切换到激光，将发射光路切换到光电倍增管。
- 在图像采集软件中，设置帧尺寸为512 x 512，帧平均值为3。将每个切片的步骤设置为 -8 μm。指定 z 步进从堆栈顶部开始并向下推进，最大限度地减少光感受器的双光子激光激活。
注意：可以减小步长以提高Z分辨率，但代价是增加成像时间，但在此成像配置中，8μm步足以解析细胞体细胞。 - 打开并启用光电倍增管。 将光电倍增管电压调整为 680 V。启用激发快门。
注意：有源光电倍增管容易受到光损坏。确保落射荧光照明器关闭，显微镜外壳帘帘拉上，室内灯关闭。 - 开始目标组织的实时图像预览，从1%激光功率开始。自动调整显示屏亮度以可视化感兴趣的细胞或结构。自动调整扫描阶段。如果目标组织暗淡或不清楚，则增加激光功率百分比，直到结构变得可见，而不会超过步骤2.4.4中设定的对应于45mW的极限。
注意：对于 16 位图像，在包含感兴趣结构的 Z 平面中自动调整亮度时，显示值为 ~1000 表示样品的亮度足够。 - 在X-Y方向上操纵显微镜载物台以所需的成像区域为中心，然后导航到Z平面，聚焦感兴趣的结构。
注意：与视神经头相邻的成像使其可以作为慢性成像实验的明确标志。 - 如果这是一个长期的延时实验，请在采集计算机上打开以前的图像，并将其用作参考以查找相同的感兴趣区域。确保成像角度与先前图像的角度相似，以最小的视差获得同一组细胞。
注意：可能需要进一步调整鼠标头位置，以成像与先前时间点相同的细胞（图3）。 - 通过导航到感兴趣的最上层和最下层的 Z 平面来设置成像堆栈的 Z 限制，并获取图像。完成图像采集后，禁用光电倍增光转换器和发射快门。将发射光路切换回目镜，将激发光路切换回落射荧光照明。将鼠标从显微镜载物台上移开。
- 系统软件和硬件关闭
- 退出图像采集软件。在计算机界面中关闭激光器。以反向启动顺序关闭硬件，“始终在线”设备除外。
- 鼠标恢复
- 从显微镜载物台上取下头架和鼠标。如果适用，将异氟烷蒸发器设置为 0%。从头架上取下鼠标。
- 用不起毛的纸巾轻轻擦去润滑性眼部凝胶，然后将白色凡士林矿物油润滑性眼膏涂抹在双眼上。将鼠标放在温水循环加热垫（设置为37°C）上，继续照顾小鼠并监测其呼吸频率，直到小鼠醒来并恢复行走能力。将鼠标放回其外壳。
- 如果适用，在玻璃体内注射后24小时评估动物活动和发病率。研究完成后，用过量的三溴乙醇（250mg / kg）对小鼠实施安乐死，并用4%多聚甲醛进行经心灌注以保护视网膜组织。
5. 图像处理与分析
- 去交错和合并多渠道数据
- 由于某些图像采集软件程序以交错格式存储多通道图像，因此请使用斐济（https://imagej.net/Fiji）等软件打开.tif图像文件以分离通道。
- 在斐济 的图像菜单中， 选择 堆栈 |工具 |去交错。输入组成图像的通道数，然后单击 确定。
- 要将分离的通道合并为单个文件，请转到 “图像 |颜色 |合并频道。将去交错的图像通道放入单独的颜色通道中，然后单击“ 确定” 创建多通道合成图像。将此复合图像另存为新的.tif文件。
- 多通道图像中荧光强度的量化
注意：指定感兴趣区域（ROI）内的荧光强度可以使用斐济在单图像平面中量化。比率读数的量化可以通过在同一ROI内测量合成图像不同通道中的荧光强度来实现。对于慢性成像实验，最好使用基于激发或发射比率输出的生物传感器。- 在斐济，请转至 “分析”|”工具 |投资回报率经理。在斐济打开合成映像。滚动到与感兴趣结构对应的 z 切片，然后使用选择工具（例如矩形选择、椭圆选择、多边形 选择 ）勾勒出 ROI。
- 按键盘上的 T 将每个选择添加到 ROI 管理器。完成ROI选择后，单击ROI管理器中的“测量”以记录ROI中的各种数据，例如面积和平均强度值。
- 将“结果”窗口中记录的当前所选通道的测量值复制到电子表格中。切换到合成图像窗口中的下一个通道，然后单击测量以获取同一组ROI内该通道的测量值。在投资回报率管理器中，转到“更多 |保存 ROI 并将其另存为.zip文件。
- 用于显示的最大强度投影
- 要创建影像数据的显示，请使用斐济的 Z 投影功能。在“ 图像 ”菜单中，选择 “堆栈 |Z 项目。仅选择存在感兴趣区域的帧以缩小背景。
- 如果需要去除 PMT 散粒噪声，请使用 中值滤波器功能。在“进程”菜单中，选择 “进程 ” |”过滤器 |中位数。选择值 1.0 以保留空间细节。
- 要创建聚焦于单个像元的最大强度投影，请重复此过程，仅选择与感兴趣像元对应的图像帧。
注意：这可以大大提高解析蜂窝心轴的能力（图4）。荧光强度的测量应在单图像平面上进行，而不是在最大强度投影上进行。
Representative Results
各种转基因、病毒载体或无机染料标记方法可用于使用基本多光子显微镜的简单调整来特异性地观察体内几种视网膜细胞类型和结构。为了可视化RGC和amacrin细胞，分别给VGlut2-Cre和VGat-Cre转基因小鼠玻璃体内注射编码Twitch2b的Cre依赖性AAV表达构建体，基于细胞质荧光共振能量转移（FRET）的Ca 2+传感器，其中包含青色和黄色荧光蛋白（分别为CFP和YFP）和肌钙蛋白15的Ca2+结合域。.在VGlut2-Cre小鼠中，RGC体细胞清晰可辨，轴突束通常很明显（图3）。
应该注意的是，轴突的轨迹和脉管系统的负像使得识别VGlut2-Cre小鼠的视神经头变得非常简单，这是慢性成像实验中有用的标志（图3）。尽管无细胞细胞看起来不如RGCs明亮，可能是由于它们的体细胞尺寸较小和/或AAV转导效率较低，但它们的体细胞在内核层中仍然很容易明显。与RGC相比，无杏碱细胞神经突更常在内部丛状层中观察到（图4）。视网膜小胶质细胞可以在Cx3cr1-GFP转基因小鼠系6中成像。小胶质细胞与脉管系统相关，使得在延时成像实验中找到相同的区域成为可能。
这种方法可用于跟踪精细小胶质细胞过程的动力学，该过程在单平面图像中具有更好的空间分辨率，或者如果准备针对单个细胞的最大强度投影（图5）。通过鼠标镜头的光学像差引起的轴向分辨率差妨碍了对z维细节的检查。为了确定这种成像技术是否可以观察到细胞超微结构的退行性变化，将 1 μL 的 50 mM N-甲基-D-天冬氨酸 （NMDA） 注射到玻璃体中以诱导兴奋性毒性病变。注射后一天，小胶质细胞表现出短过程或变形虫形态（图5），符合先前的报告16。应该注意的是，与AAV介导的荧光蛋白表达盒递送实验相比，Cx3cr1-GFP转基因系中的细胞在细胞队列中表现出更均匀和完整的荧光蛋白表达。在设计实验时，应考虑多样化和稀疏与完整和统一标记的好处。
为了如前所述标记视网膜脉管系统8，在成像前30-60分钟腹膜内注射200μL埃文斯蓝染料（20mg / mL无菌盐水）。这导致从视神经头发出的血管的强烈标记（图6）。令人惊讶的是，单次注射的荧光信号持续了至少七天。使用两种不同的方法来估计体内图像的尺寸。首先，使用共聚焦显微镜在体内和固定后在扁平的视网膜整体上对相同的视网膜区域进行成像（图7）。从四个不同的体内样本中随机选择细胞对，并在共聚焦扫描中测量细胞对之间的真实距离，并与体内像素距离匹配，以1倍数字放大倍率获得0.99 μm的平均像素尺寸。使用将体内图像与共聚焦整体扫描相关联的类似方法表明，单个头部位置允许在大约 650 mm2 的视网膜上成像。
沿一个扭转轴重新定位头部支架可以进入视网膜的线性区域，长度为 2.2 mm（未显示）。此外，将1或2μm直径的荧光微球注射到小鼠的眼睛中，并用10倍数码变焦从体内图像中测量其直径为全宽半峰线扫描。这给出了一个稍大的像素大小估计值，但差异更大（图7）。总体而言，完成体内实验后对整个样品进行共聚焦成像是为单个图像分配比例的最一致方法，因为角膜和晶状体特性的差异可能会改变样品之间的图像比例。
图 1：光路原理图。本协议中使用的双光子显微镜的基本组件包括用于调制激光功率的Pockels单元，用于减小激光束直径以匹配显微镜物镜背孔径的透镜对，以及一对用于光束转向的振镜扫描镜。每个主要光学元件之前都有一对转向镜。焦点由驱动物镜支架的电机控制。通过更换二向色性和屏障滤光片，可以针对不同的荧光团定制发射光路。显示了青色/黄色/红色成像的一般设置，其中短通二向色镜将红光引导至第一个PMT，而长通二向色镜与适当的带通滤光片配对用于分离青色和黄色发射。缩写：PMT = 光电倍增管。请点击此处查看此图的大图。
图2：定位小鼠进行体内成像。 为了将瞳孔定位在光路轴上，首先将麻醉小鼠约束在头部支架中，旋转头部并倾斜头部，将大量润滑剂眼凝胶滴在眼睛上，然后将鼠标放在载物台上。盖玻片安装在垂直于光路的盖玻片支架中，并朝眼睛向下降低。盖玻片不应接触角膜或小鼠头（左），如果盖玻片偏转，这将很明显。但是，盖玻片也应足够近，以避免液滴（右）的腰部，因为这会对样品产生放大作用。应用凝胶浸没并固定盖玻片后，应将载物台直接移动到显微镜物镜下方。 请点击此处查看此图的大图。
图3：成像视网膜神经节细胞。 对于图像显示，创建包含感兴趣像元的z平面的最大强度投影，并对生成的图像进行中位数滤波以消除PMT散粒噪声。显示了通过将AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b注射到VGlut2-Cre转基因小鼠中标记的视网膜神经节细胞的两个示例，特别是CFP信号。在相隔四天的会议上获取图像，并使用血管标志物返回视神经头附近的同一区域。视神经头朝向图像底部。尽管两个样本在方向上都显示出一些差异（强度降低的区域用箭头表示），但大多数细胞都存在于两个时间点。比例尺 = 约 50 μm。缩写：PMT = 光电倍增管;AAV = 腺相关病毒;EF1α = 伸长系数-1α;FLEX = 翻转切除;VGlut2 = 囊泡谷氨酸转运蛋白 2;CFP = 青色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：成像无细胞。 通过将AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b注射到VGat-Cre转基因小鼠中来标记Amacron细胞。特别显示了Twitch 2b的CFP信号。聚焦于内核层深度的小最大强度投影表明无细胞体细胞体，而聚焦于内丛状可解决无核细胞神经突（箭头）。视神经头朝向图像右侧。比例尺 = 约 50 μm。缩写：AAV = 腺相关病毒;EF1α = 伸长系数-1α;FLEX = 翻转切除;VGat = 囊泡 γ 氨基丁酸转运蛋白;CFP = 青色荧光蛋白;INL = 内核层;IPL = 内部丛状层。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：成像小胶质细胞。 转基因小鼠系Cx3cr1-GFP用于标记小胶质细胞。全扫描体积的最大强度投影显示许多小胶质细胞，其中一些具有可以解决的精细过程细节。请注意，由于该区域的视差，磁场左下角的像元在最大投影中的失真小于朝向右上角的像元。仅包含感兴趣像元的最大强度投影会显著降低这种视差（中心，以相应的颜色框住）。此外，这种成像策略可以记录精细小胶质细胞过程重塑的动力学（下图）。相比之下，许多小胶质细胞在玻璃体内注射50mM NMDA兴奋性毒性病变后一天可以看到短过程或变形虫形态（右）。比例尺 = 约 50 μm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;Cx3cr1 = Cx3趋化因子受体1;NMDA = N-甲基-D-天冬氨酸。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：标记血管标志。 在第一次成像前30-60分钟腹膜内注射200μL20mg / mL埃文斯蓝小鼠。全层最大强度投影显示视网膜脉管系统中的荧光持续至少 7 天。比例尺 = 约 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：图像尺寸。 将AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b注射到VGlut2-Cre转基因小鼠中标记的视网膜神经节细胞在体内成像，然后在视网膜固定和全装制备后，通过共聚焦激光扫描显微镜对同一区域进行成像。显示了两者的黄色荧光蛋白通道。彩色箭头对表示两种制剂中的相同细胞（上图）。玻璃体内注射并在体内成像的2μm直径荧光微球的单平面图像（左下图）。微球不会沉降，因此处于恒定运动状态，使得轴向分辨率的测量变得不可能。根据体内荧光微球的全宽半最大值测量或每组 2-4 个视网膜的相关共聚焦测量（右下）计算的像素大小。比例尺 = 50 μm。缩写：AAV = 腺相关病毒;EF1α = 伸长系数-1α;FLEX = 翻转切除;VGlut2 = 囊泡谷氨酸转运蛋白 2。 请点击此处查看此图的大图。
图8：双光子扫描诱导的钙活性。 通过将AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b注射到VGlut2-Cre转基因小鼠中标记的视网膜神经节细胞，YFP是假色洋红色和CFP绿色，在单个平面上成像为4.22Hz的时间序列。所有RGC的起始YFP/CFP比率相似。大多数人的响应是FRET比率增加（不包括橙色细胞），并且在整个时间序列中保持较高的YFP / CFP比率（黄色细胞）。YFP/CFP比率归一化为第一帧平均值，彩色圆圈与彩色迹线匹配。星号表示时间点，左侧显示代表性图像。比例尺 = 20 μm。缩写：AAV = 腺相关病毒;EF1α = 伸长系数-1α;FLEX = 翻转切除;VGlut2 = 囊泡谷氨酸转运蛋白 2;YFP = 黄色荧光蛋白;CFP = 青色荧光蛋白;RGC = 视网膜神经节细胞;FRET=荧光共振能量转移。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
本文描述的双光子成像程序能够对小鼠视网膜进行纵向体内成像。在异氟醚下，可以在连续长达6小时或更长时间内获得同一视网膜区域的可重复图像。还可以使用细胞和血管标志物在不同的日子对小鼠进行成像，以定位相同的成像区域（图3）。为此目的，使用透明凝胶浸泡与盖玻片相结合，以前已应用于一系列程序，包括视网膜下注射的视网膜可视化，激光诱导的视网膜损伤模型和眼底成像20，21，22。
眼睛的解剖结构对体内成像提出了独特的挑战，因为小鼠角膜和晶状体的高光功率阻碍了通过瞳孔的直接成像而无法矫正。其他几种体内成像方法依赖于使用平凹隐形眼镜来矫正小鼠眼睛的前光学元件7，17，18，19。由于仅在角膜上进行光学校正，鼠标晶状体的高光功率导致不可避免的视差，特别是周边扫描视野中的结构，表现为不同Z平面上X-Y维度的拉伸和平移运动。为了最大限度地减少X和Y维度上与图像视差相关的失真，小鼠眼睛的方向必须使成像区域与视网膜的切线平面垂直于显微镜光路。这里描述的设置有利于精确操纵眼睛的角度以实现这种对齐。可调节的鼠标头支架允许沿两个轴旋转，允许在实验者滚动Z维度时轻松手动调整眼睛的角度，以最小化视差。这种倾斜还规避了瞳孔的视场停止效应，允许对视网膜的更大区域进行成像。头部支架的约束也大大减少了呼吸引起的运动伪影。
必须注意保持鼠标眼睛的清晰度，因为在连续成像过程中图像质量会随着不透明度而下降。在成像过程中频繁地重新涂抹润滑凝胶，并在每次成像后涂抹软膏，有助于防止眼睛干燥和出现混浊。一些角膜混浊会在24-48小时后自发消退。如本协议中所述，使用透明凝胶和盖玻片可提供与隐形眼镜7相似的图像质量和像差校正，同时允许更轻松地调整眼角，而无需重新对齐盖玻片。此外，该凝胶为眼睛提供持续的水合作用，使其可以进行长达数小时的急性成像。最后，由于盖玻片不接触角膜，因此对眼睛的刺激最小，这可能会降低重复成像的光学清晰度。
这种方法的局限性在于光学像差不能完全校正。虽然由于高视差，这严重降低了轴向分辨率，但可以在单图像平面中获得体细胞的定量测量。应该注意的是，由于视网膜神经元的荧光信号强度取决于该方法的样品对齐，因此基于激发和发射比率的传感器更适合于在不同成像会话中长期比较样品的实验。在系统级别校正光学像差的一种方法是自适应光学，它允许视网膜中的亚细胞分辨率8，9，14，21。然而，自适应光学需要高度专业化的设备和广泛的专业知识才能实现。
双光子体内视网膜成像的替代方法是共聚焦显微镜或检眼镜检查6。这里介绍的方法应该很容易转化为宽场或共聚焦显微镜。单光子成像可能更强大，并且由于通过眼睛的角膜和晶状体实现有效的双光子效应所必需的双光子激光的高能量，损坏视网膜的风险较小。为避免双光子激光损伤，最大激光功率的阈值应通过完成成像实验后检查整个视网膜和成像层中细胞类型的免疫染色来根据经验确定。在这里介绍的系统中，RGC被标记为泛RGC标记Rbpms，密度在高达45 mW成像功率时是正常的，而55 mW会导致RGC的显着损失（未显示）。
单光子成像的一个缺点是，与双光子成像相比，这种方法将非常严重地刺激视网膜的原生视觉电路23。先前使用视网膜整体安装或眼罩制剂的实验表明，双光子激光扫描引起的电路激活在很大程度上是瞬态的24。在这里，使用Ca 2+传感器Twitch2b对RGC活动进行成像显示，激光扫描的开始诱导Ca 2+抬高，在大多数RGC中，Ca 2+抬高在5-20秒的过程中恢复到基线（图8）。鉴于该协议中的激光功率在先前报告体内视网膜光响应8的实验范围内，目前描述的方法可能适用于记录视网膜中的电路活动。这些考虑对于可能受电路活动影响的实验非常重要。
该协议展示了两种类型的视网膜神经元，RGC和无分泌细胞的体内成像。可以实现其他主要细胞类型的类似标记，包括水平细胞（Cx57-Cre 25），双极细胞（Chx10-Cre 26;mGluR6-GFP 27），锥形光感受器（S-或M-视蛋白-Cre 28），杆状光感受器（Nrl-Cre 29），Müller胶质细胞（Foxg1-Cre 26）和周细胞（NG2-DsRed9）。转基因小鼠也可用于标记RGC的离散亚群（例如，αRGC30的KCNG4-Cre;OPN4-Cre 用于 ipRGC31;用于 J-RGC32 的 JAM-B-CreER）和无细胞（例如，用于星爆无红细胞26 的 ChAT-Cre 和用于各种无糖核细胞亚型 3，34 的神经肽启动子驱动物）。病毒载体可用于靶向特定细胞群，代替转基因小鼠。玻璃体内注射具有无处不在的CAG启动子元件的AAV2几乎完全标记RGC，无碱细胞和水平细胞25。将修饰的AAV2.7m8-Y444F衣壳与工程化的mGluR6启动子构建体配对，可以广泛标记ON双极细胞35。AAV的视网膜下注射导致光感受器的富集，血清型AAV2 / 5具有最高的转导效率36。Shh10是一种修饰的AAV6衣壳蛋白，与胶质原纤维酸性蛋白启动子元件配对已被证明对Müller胶质细胞37具有特异性。
用完全非侵入性的方法观察中枢神经系统细胞的能力可用于研究神经回路的基本特性8，以及神经变性3，4，5，6，38的机制。许多致盲疾病针对视网膜中的细胞群，小鼠体内成像方法已被用于研究视神经损伤1，3，4，黄斑变性13，中风5，青光眼2，6和葡萄膜炎7。此外，许多中枢神经系统神经退行性疾病表现在视网膜上，包括阿尔茨海默病39，多发性硬化症40和帕金森病41。因此，这种易于获得的视网膜活体成像技术可以用作研究各种神经退行性疾病的工具。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了预防失明研究基金会（PRW职业发展奖和圣路易斯华盛顿大学医学院眼科和视觉科学系的无限制资助），国家青光眼研究（BrightFocus基金会的一个项目）和麦克唐纳细胞和分子神经生物学中心的资助。Z.W.获得了机构国家研究服务奖T32 EY013360的支持。这项工作还得到了华盛顿大学医学院希望中心病毒载体核心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
| 50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
| Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
| Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
| Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
| Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
| Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
| CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
| ChromoFlex - Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
| Cling film | VWR | 10713-916 | |
| Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
| Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
| DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
| Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
| Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
| FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
| Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ Fiji software | Freeware | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
| Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
| ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
| Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
| Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
| Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
| Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
| Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
| Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
| sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
| Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
| ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
| Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
| VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
| xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
References
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