Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إدارة إيقاع القلب المتقدمة من خلال تطبيق التحفيز الضوئي متعدد المواقع البصري الوراثي في قلوب الفئران

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62335
Automatic Translation
*1,2, *1, 8,9, 1,3,4,6, 8,9, 1,5,6,7
1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg
* These authors contributed equally

Summary

يشير هذا العمل إلى طريقة للتحكم في إيقاع القلب لقلوب الفئران الفئران المعدلة وراثيا من القناة المعدلة وراثيا رودوبسين-2 (ChR2) باستخدام التحفيز الضوئي المحلي مع مصفوفة micro-LED ورسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات غشاء فوق القلب.

Abstract

يعد اضطراب نظم القلب البطيني سببا رئيسيا للوفيات والأمراض في جميع أنحاء العالم. إزالة الرجفان الكهربائي باستخدام الصدمات الكهربائية عالية الطاقة هو حاليا العلاج الوحيد للرجفان البطيني الذي يهدد الحياة. ومع ذلك ، قد يكون لإزالة الرجفان آثار جانبية ، بما في ذلك الألم الذي لا يطاق ، وتلف الأنسجة ، وتفاقم التشخيص ، مما يشير إلى وجود حاجة طبية كبيرة لتطوير استراتيجيات أكثر لطفا لإدارة ضربات القلب. إلى جانب النهج الكهربائية التي تقلل من الطاقة ، تم تقديم علم البصريات القلبية كأداة قوية للتأثير على نشاط القلب باستخدام قنوات أيون الغشاء الحساسة للضوء والنبضات الضوئية. في هذه الدراسة ، سيتم وصف طريقة قوية وصالحة للتحفيز الضوئي الناجح لقلوب الفئران السليمة في Langendorff استنادا إلى سرعة متعددة المواقع تطبق مجموعة 3 × 3 من الثنائيات الصغيرة الباعثة للضوء (micro-LED). يسمح رسم الخرائط البصرية المتزامنة لموجات الجهد الغشائي فوق القلبي بالتحقيق في آثار التحفيز الخاص بالمنطقة وتقييم نشاط القلب المستحث حديثا مباشرة في الموقع. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن فعالية إزالة الرجفان تعتمد بشدة على المعلمات المختارة للتحفيز الضوئي أثناء عدم انتظام ضربات القلب. سيتم إثبات أن المنطقة المضيئة من القلب تلعب دورا حاسما في نجاح الإنهاء وكذلك كيف يمكن تحقيق التحكم المستهدف في نشاط القلب أثناء الإضاءة لتعديل أنماط عدم انتظام ضربات القلب. باختصار ، توفر هذه التقنية إمكانية تحسين معالجة الآلية في الموقع على الطريق إلى التحكم في التغذية المرتدة في الوقت الفعلي لإيقاع القلب ، وفيما يتعلق بخصوصية المنطقة ، نهج جديدة في الحد من الضرر المحتمل لنظام القلب مقارنة باستخدام تطبيقات الصدمات الكهربائية غير المحددة.

Introduction

كشفت التحقيقات المبكرة للديناميكيات المكانية الزمانية أثناء عدم انتظام ضربات القلب أن الأنماط الكهربائية المعقدة أثناء الرجفان القلبي مدفوعة بموجات الإثارة الدوارة الشبيهة بالدوامة1. أعطت هذه النتيجة رؤى جديدة حول الآليات الأساسية لعدم انتظام ضربات القلب ، مما أدى بعد ذلك إلى تطوير علاجات إنهاء كهربائية جديدة تعتمد على الإثارة متعددة المواقع لعضلة القلب2،3،4. ومع ذلك ، فإن العلاجات التي تستخدم تحفيز المجال الكهربائي غير محلية وقد تعصب جميع الخلايا القابلة للإثارة المحيطة ، بما في ذلك الأنسجة العضلية ، مما يسبب تلفا للخلايا والأنسجة ، بالإضافة إلى ألم لا يطاق. وعلى النقيض من العلاجات الكهربائية، توفر الأساليب البصرية الجينية تقنية محددة وواقية للأنسجة لاستحضار إمكانات عمل الخلايا العضلية القلبية بدقة مكانية وزمنية عالية. لذلك ، فإن التحفيز البصري الوراثي لديه القدرة على التحكم في الحد الأدنى من التدخل الجراحي في أنماط التنشيط الفوضوية أثناء الرجفان القلبي.

إن إدخال قناة الأيونات الحساسة للضوء قناة رودوبسين-2 (ChR2) في الخلايا القابلة للإثارة عن طريق التلاعب الجيني5،6،7 ، مكن من إزالة الاستقطاب من إمكانات الغشاء للخلايا القابلة للإثارة باستخدام التحفيز الضوئي. تم تطوير العديد من التطبيقات الطبية ، بما في ذلك تنشيط الشبكات العصبية ، والتحكم في نشاط القلب ، واستعادة الرؤية والسمع ، وعلاج إصابات الحبل الشوكي ، وغيرهامن 8،9،10،11،12،13،14. تطبيق ChR2 في أمراض القلب لديه إمكانات كبيرة بسبب وقت الاستجابة بالمللي ثانية15 ، مما يجعله مناسبا تماما للتحكم المستهدف في ديناميكيات القلب غير المنتظمة.

في هذه الدراسة ، يظهر التحفيز الضوئي متعدد المواقع للقلوب السليمة لنموذج الفأر المعدل وراثيا. وبإيجاز، أنشئ خط فأر ألفا - MHC-ChR2 معدل وراثيا في نطاق البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) وتفضلت بتقديمه البروفيسور س. إ. لينارت. بشكل عام ، تم إقران الذكور البالغين المعدلة وراثيا C57 / B6 / J ، التي تعبر عن Cre-recombinase تحت سيطرة alpha-MHC للتزاوج مع الإناث B6.Cg-GT (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J. منذ حذف كاسيت STOP القلبي في الجيل الثاني ، أظهر النسل تعبيرا مستقرا MHC-ChR2 وتم استخدامه للحفاظ على مستعمرات القلب الحساسة للضوء. أجريت جميع التجارب على الفئران البالغة من كلا الجنسين في سن 36 - 48 أسبوعا. يتم تحقيق الإضاءة باستخدام صفيف 3 × 3 micro-LED ، تم تصنيعه كما هو موضح في16,17 باستثناء عدم تنفيذ السكن القائم على السيليكون والألياف الزجاجية البصرية القصيرة. تم العثور على أول استخدام له في تطبيق القلب في18. تم تطبيق مصفوفة micro-LED خطية تعتمد على تقنية تصنيع مماثلة كمسبار اختراق لسرعة القلب19. يتم ترتيب مصابيح LED الدقيقة في صفيف 3 × 3 على درجة 550 ميكرومتر ، مما يوفر دقة مكانية عالية وقوة إشعاع عالية على مساحة صغيرة جدا. يوضح المؤلفون في هذا العمل تحجيما ضوئيا محليا متعدد الاستخدامات متعدد المواقع قد يفتح الطريق لتطوير طرق علاج جديدة مضادة لعدم انتظام ضربات القلب.

يتضمن البروتوكول التجريبي التالي تروية Langendorff الرجعية خارج الجسم الحي ، والتي يعمل فيها الشريان الأورطي المعلب كمدخل تروية. بسبب ضغط التروية المطبق وتقلص القلب ، يتدفق البيرفوسات عبر الشرايين التاجية ، التي تتفرع من الشريان الأورطي. في العمل المقدم ، يتم تشغيل القلب باستخدام إعداد ضغط ثابت يتم تحقيقه عن طريق رفع خزانات البيرفوسات إلى ارتفاع 1 متر ، أي ما يعادل 73.2 مم زئبق ، مما يؤدي إلى معدل تدفق يبلغ 2.633 ± 0.583 مل / دقيقة. يتم استخدام نوعين من محلول Tyrode كعطور أثناء التجربة. يدعم محلول Tyrode العادي إيقاع الجيوب الأنفية المستقر ، في حين يتم خلط محلول Low-K + Tyrode مع Pinacidil لتمكين تحريض عدم انتظام ضربات القلب في قلوب الفئران. يسمح استخدام حمام مائي سداسي الأضلاع بمراقبة القلب من خلال ست نوافذ مستوية مختلفة ، مما يسمح باقتران العديد من المكونات البصرية مع تشوه أقل عن طريق الانكسار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع التجارب بدقة لائحة رعاية الحيوان ، بالاتفاق مع التشريعات الألمانية ، والأحكام المحلية ، ووفقا لتوصيات الاتحاد الأوروبي لجمعيات علوم المختبرات الأوروبية (FELASA). تمت الموافقة على طلب الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل السلطة المسؤولة عن رعاية الحيوان ، وتم الإبلاغ عن جميع التجارب إلى ممثلي رعاية الحيوان لدينا.

1. إعداد التجربة والمواد

  1. إعداد الخرائط البصرية
    ملاحظة: يظهر الإعداد البصري، وكذلك الإعداد الكهربائي، في الشكل 1. يتم سرد جميع المكونات المستخدمة في الإعداد البصري والكهربائي بالتفصيل في جدول المواد.
    1. استخدم LED 1 و LED 2 لتحريض عدم انتظام ضربات القلب وإزالة الرجفان الاحتياطي. اختر مصابيح LED عالية الطاقة ذات الطول الموجي λالأزرق بالقرب من 475 نانومتر ، وهي ذروة الطول الموجي للإثارة في ChR26. لزيادة تضييق الطيف البصري ، استخدم مرشح ممر النطاق الترددي 470 ± 20 نانومتر.
      ملاحظة: في هذا العمل ، يكون ل LED 1 و LED 2 تدفق إشعاعي نموذجي من 3.9 إلى 5.3 واط ، وفقا لورقة البيانات20.
    2. قم بإضاءة epicardium لرسم الخرائط البصرية باستخدام LED أحمر عالي الطاقة (LED 3 في الشكل 1) ، والذي ينبعث منه ضوء بطول موجي مركزي يبلغ λأحمر = 625 نانومتر وتدفق مشع يبلغ 700 mW21. يتم ترشيح الضوء الأحمر باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي 628 ± 20 نانومتر وينعكس بواسطة مرآة ثنائية اللون طويلة المرور (DM) بطول موجي قاطع يبلغ λDM = 685 نانومتر.
    3. استخدم مرشح الانبعاثات معλ filter-cam = 775 ± 70 نانومتر أمام هدف الكاميرا لتسجيل انبعاث التألق للنشاط القلبي فقط. استخدم هدفا سريعا مناسبا تماما لتطبيقات الإضاءة المنخفضة.
      ملاحظة: يتراوح تواتر الرجفان في قلب الفأر من 20 إلى 35 هرتز. لذلك ، استخدم كاميرا سريعة بما يكفي للتسجيل بتردد من 1 إلى 2 كيلو هرتز ، أو حتى أعلى.
  2. صفيف مايكرو إل إي دي
    ملاحظة: يتم تحقيق صفائف micro-LED المطبقة هنا باستخدام معالجة الأنظمة الدقيقة كما هو مفصل في مكان آخر16,17.
    1. قم بتدوير طبقة بوليميد (PI) بسماكة 5 ميكرومتر على ركائز سيليكون مقاس 4 بوصات (مصقولة من جانب واحد ، بسماكة 525 ميكرومتر).
    2. علاج طبقة PI هذه عند درجة حرارة قصوى تبلغ 450 درجة مئوية تحت جو النيتروجين. حافظ على درجة الحرارة القصوى ثابتة لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإيداع ونمط مقاومة ضوئية عكسية للصورة (PR) باستخدام الطباعة الحجرية فوق البنفسجية (UV) وإيداع طبقة بلاتينية رقيقة 250 نانومتر (Pt).
    4. قم بتكثيف هذا التمعدن القائم على Pt عن طريق الطلاء الكهربائي لطبقة ذهبية بسماكة 1 ميكرومتر (Au) مع العلاقات العامة المنقوشة التي تعمل كطبقة إخفاء.
    5. قبل طلاء طبقة PI ثانية ، قم بتعريض الرقاقة بطبقة PI الأولى والمعادن المطلية بالكهرباء Au إلى بلازما أكسجين تنشط كيميائيا سطح طبقة PI.
    6. عالج طبقة PI الثانية مرة أخرى عند 450 درجة مئوية ، وطبق الطباعة الحجرية بالأشعة فوق البنفسجية لنمط طبقة العلاقات العامة وافتح منصات التلامس الخاصة بالمصفوفة لرقائق LED الدقيقة ولوحة الدوائر المطبوعة المتداخلة (PCB) عن طريق النقش الأيوني التفاعلي (RIE) باستخدام PR المزخرف كطبقة إخفاء.
      ملاحظة: في خطوات عملية RIE هذه، يوصى بتطبيق 200 واط و100 واط لمدة 10 و30 دقيقة، على التوالي، لتحديد فتحات لوحة التلامس بالإضافة إلى الشكل الخارجي لصفيف micro-LED ثنائي الأبعاد (2D).
    7. تجريد العلاقات العامة باستخدام المذيبات وحفر البلازما. زيادة سماكة منصات التلامس عن طريق الطلاء الكهربائي لطبقة ذهبية إضافية بسماكة 6 ميكرومتر.
    8. قم بتوصيل رقائق micro-LED بمنصات التلامس باستخدام جهاز ربط رقاقة قابلة للطي.
    9. قم بتنشيط سطح PI في بلازما الأكسجين وقم بملء رقائق micro-LED بمادة لاصقة خالية من المذيبات. علاج ثم المادة اللاصقة لمدة 12 ساعة عند 120 درجة مئوية.
    10. لتغليف رقائق LED الدقيقة ، قم بإجراء معالجة بلازما أخرى باستخدام الأرجون وتطبيق طبقة رقيقة من الفلوروبوليمر يدويا. قبل علاج هذه الطبقة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    11. قم بتطبيق السيليكون يدويا كطبقة تغليف نهائية بعد تعريض صفيف micro-LED لبلازما الأكسجين ، المستخدمة لتحسين التصاق السيليكون بطبقة الفلوروبوليمر الأساسية. علاج طبقة السيليكون عند 80 درجة مئوية و 180 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لكل منهما. هذه الخطوات النهائية للعلاج أيضا علاج طبقة الفلوروبوليمر تماما.
    12. قم بلحام منصات التلامس الخاصة بركيزة PI بلوحة دوائر مطبوعة تحمل موصلات شريطية لتوصيل الصفيف بجهاز خارجي. قم بتغطية منصات اللحام على ثنائي الفينيل متعدد الكلور باستخدام مادة لاصقة.
  3. الإعداد الكهربائي
    1. استخدم أقطاب كهربائية مناسبة لتسجيل مخطط كهربية القلب (ECG)، على سبيل المثال، أقطاب الفضة / كلوريد الفضة أو أقطاب جهد العمل الأحادي (MAP) ومضخم ECG لمراقبة النشاط الكهربائي للقلب بشكل مستمر. علاوة على ذلك ، استخدم جهاز اقتناء مناسب (AD) لتسجيل جميع الإشارات الكهربائية التي تم الحصول عليها.
    2. اختر سائقا مناسبا تماما لمصابيح LED عالية الطاقة (LED 1 و LED 2 و LED 3) ، والتي يمكنها إدارة الحد الأقصى للتيار المطبق على كل جهاز. استخدم مولد وظائف عشوائي (AFG) للتحكم في إخراج برامج تشغيل LED بدقة.
    3. استخدم برنامج تشغيل LED متعدد القنوات للتحكم في التيار المتدفق عبر صفيف LED الصغير. AFG مع مخرجات متعددة مناسبة أيضا لهذه المهمة.
      ملاحظة: من المستحسن اختيار برامج تشغيل LED التي تحد من التيار إلى الحد الأقصى لتيار الصمام الصغير ، وإلا فقد تتلف الثنائيات. تم وصف أحد الأمثلة على برنامج تشغيل micro-LED متعدد القنوات في عمل آخر18. إذا لزم الأمر، قد يتم توصيل AFG أو أي برنامج تشغيل LED آخر بجهاز كمبيوتر للتحكم عن بعد في إعدادات micro-LED. إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بتوصيل برنامج تشغيل LED بالكمبيوتر باستخدام بروتوكول الاتصال الذي تختاره ، على سبيل المثال ، ناقل واجهة الأغراض العامة (GPIB) أو اتصال تسلسلي.

   

2. الإجراءات التجريبية

  1. إعداد الحلول
    1. تحضير محلول Tyrode: 130 mM NaCl ، 4 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 24 mM NaHCO3 ، 1.8 mM CaCl 2 ، 1.2 mM KH2 PO 4 ، 5.6 mM Glucose ، 0.1٪ BSA / Albumin.
    2. تحضير حل Low-K+ Tyrode: يتم تصنيع Low-K + Tyrode بنفس طريقة حل Tyrode العادي باستثناء أنه يتم إضافة نصف كمية KCl فقط (2 mM بدلا من 4 mM KCl).
      ملاحظة: بالنسبة للتجربة التي تدوم 3 ساعات ، عادة ما يكون 2-3 لتر من Tyrode منخفض K + Tyrode (بالإضافة إلى ذلك مختلطا مع Blebbistatin (الخطوة 2.1.5) إذا تم إجراء رسم الخرائط البصرية) و 1-2 لتر من Tyrode العادي كافية.
    3. أضف Pinacidil إلى محلول Low-K + Tyrode لتسهيل عملية تحريض عدم انتظام ضربات القلب ، كما هو موضح في22 ، للحصول على تركيز 100 mM. ارتداء قفازات المختبر الواقية عند التعامل مع Pinacidil.
    4. تحضير 1 مل من 50 ميكرومتر DI-4-ANBDQPQ مع حل Tyrode العادي. حماية الصبغة من الضوء لمنع التبييض الضوئي.
    5. اصنع محلول مخزون 10 mM من Blebbistatin. بالنسبة للرسم الخرائط البصرية، امزج Blebbistatin مع محلول Pinacidil-Tyrode سعة 100 ملليمتر (الخطوة 2.1.3) للحصول على محلول 5 ميكرومتر. ارتداء قفازات المختبر الواقية عند التعامل مع Blebbistatin.
      ملاحظة: احتفظ بكل من الصبغة ومحلول Blebbistatin جانبا حتى يبدأ رسم الخرائط البصرية.
  2. لانغندورف التروية
    ملاحظة: يتكون الإعداد من خزانين لحلي Tyrode. وهي متصلة بفخ فقاعة عبر أنابيب مع ديوك ثلاثية الاتجاهات. يتم توصيل القلب لاحقا بمصيدة الفقاعات بواسطة موصل قفل Luer ، ثم يتم تعليقه في حمام مائي سداسي الأضلاع. الحمام المائي ، بدوره ، متصل بحاوية نفايات لجمع محلول Tyrode المستخدم.
    1. نظف جميع الأنابيب قبل كل تجربة بمياه منزوعة المعادن بالكامل.
    2. قم بتهوية كل من حلول Tyrode باستخدام Carbogen (5٪ CO 2 و 95٪ O2) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجربة. اضبط قيمة الرقم الهيدروجيني لحلول Tyrode إلى 7.4 باستخدام NaOH.
    3. املأ 500 مل من محلول Tyrode في الخزان المقابل وقم بإزالة تهوية الأنابيب وكذلك مصيدة الفقاعات عن طريق تشغيل محلول Tyrode من خلال نظام التروية حتى لا يتم رؤية المزيد من فقاعات الهواء المحاصرة في الأنابيب أو في مصيدة الفقاعة.
    4. استمر في تهوية محاليل Tyrode خلال التجربة بأكملها في الخزانات باستخدام Carbogen لضمان بقاء الرقم الهيدروجيني لل perfusate مستقرا لاحقا أثناء التروية.
    5. قم بتسخين نظام التروية إلى 37 درجة مئوية باستخدام مضخة حرارية للمياه. حافظ على ثبات درجة حرارة العطر داخل الحمام المائي باستخدام عنصر تسخين إضافي مثل كابل تسخين مقاوم للماء.
      ملاحظة: أثناء التجربة، من الأهمية بمكان إعادة ملء خزانات Tyrode قبل أن تصبح فارغة. خلاف ذلك ، يمكن أن تدخل فقاعات الهواء إلى القلب ، والتي يمكن أن تسد الأوعية وتؤدي إلى نقص التروية.
  3. إعداد الماوس
    1. حقن تحت الجلد 0.1 مل من 500 أي الهيبارين 30 دقيقة قبل إجراء عزل القلب.
    2. املأ طبق بتري 6 سم ومحقنة سعة 2 مل بمحلول Tyrode المثلج. ضع تحت المجهر المجسم.
    3. إجراء تخدير قصير الوقت للفئران بواسطة بيئة Isoflurane المشبعة لمدة 2 دقيقة وخلع عنق الرحم الفوري بعد ذلك.
      ملاحظة: من أجل التحقق من التخدير الكافي ، من الضروري للغاية التحقق من المنعكس السلبي بين أصابع القدمين.
    4. افتح الصدر ، وأزل القلب ، كما هو موضح في مكان آخر23 ، وضعه في طبق Petri الذي يبلغ طوله 6 سم مع محلول Tyrode البارد المثلج. سوف يتضاءل ضربات القلب بسبب انخفاض درجة الحرارة.
    5. قم بالتحضير الدقيق تحت المجهر المجسم، كما هو مفصل في مكان آخر23. نعلق الشريان الأورطي على إبرة حادة وإصلاح الوعاء بمادة خياطة.
    6. كعنصر تحكم ، حقن محلول Tyrode البارد من خلال الإبرة في القلب وتحقق من أن القلب مثبت بإحكام. هذه الخطوة أيضا شطف الدم المتبقي من القلب.
    7. انقل القلب المثبت إلى نظام التروية. تأكد من تدفق العطر لمنع الهواء من دخول القلب أثناء توصيل الإبرة بفخ الفقاعة. تحقق من أن القلب مغطى بمحلول Tyrode في الحمام المائي. ويوضح الشكل 2 الخطوات 2-3-4 و2-3-5 و2-3-7.
    8. تأكد من أن القلب يبدأ في النبض في غضون بضع دقائق. دع القلب يتكيف مع إعداد التروية لمدة 15 إلى 20 دقيقة ، ثم انتقل إلى محلول Low K + Tyrode مع Pinacidil (الخطوة 2.1.3) على التوالي محلول Tyrode منخفض K + مع Pinacidil و Blebbistatin (الخطوة 2.1.5) إذا كان سيتم إجراء رسم الخرائط البصرية.
  4. تحريض عدم انتظام ضربات القلب وإزالة الرجفان البصري
    1. ضع أحد أقطاب تخطيط القلب الكهربائي في أقرب مكان ممكن من سطح القلب لضمان جودة إشارة جيدة. قطب ECG الثاني في محلول Tyrode. تأكد من أن ECG المكتسبة يتم تسجيلها بواسطة AD الذي تختاره.
    2. ضع مصفوفة micro-LED في المنطقة التي تهم الدراسة ، على سبيل المثال ، على البطين الأيسر.
    3. قم بتغيير التروية إلى Tyrode منخفض K + مع Pinacidil وقم بتحريك القلب لمدة 15 إلى 30 دقيقة.
    4. للحث على عدم انتظام ضربات القلب ، قم بإضاءة القلب باستخدام LED 1 و LED 2 بقطار من 20 إلى 50 نبضة ضوئية بتردد f ind من 25 إلى 35 هرتز ، ومدةالنبض Wind من 2 إلى 15 مللي ثانية ، وشدة الضوء LIopt_ind من 2.8 ميجاوات مم-2.
    5. كرر العملية حتى يتم تحفيز عدم انتظام ضربات القلب.
      ملاحظة: من السهل تحديد عدم انتظام ضربات القلب في إشارة تخطيط القلب لأن تردد الإشارة ومورفولوجيتها يختلفان عن إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعي. إذا انتهى عدم انتظام ضربات القلب خلال ال 5 ثوان التالية ، فقم بتصنيفه على أنه إنهاء ذاتي ، وابدأ محاولة تحريض جديدة.
    6. بمجرد اكتشاف عدم انتظام ضربات القلب المستمر بصريا ، قم بتطبيق دفعة من النبضات بعروض مختلفة W def والترددات fdef ، باستخدام ثلاثة أو ستة أو تسعة مصابيح LED دقيقة من الصفيف عندنبضة I الحالية النابضة من 15 mA مما يؤدي إلى شدة الضوء LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2.
    7. إذا استمر عدم انتظام ضربات القلب بعد خمس تجارب لإزالة الرجفان تعتمد على صفيف LED الصغير ، فقم بتصنيف المحاولة على أنها غير ناجحة وابدأ إزالة الرجفان الاحتياطي.
    8. لإزالة الرجفان الاحتياطي ، استخدم LED 1 و LED 2 باستخدام نفس معلمات التوقيت المحددة لصفيف micro-LED.
      ملاحظة: نظرا لأن القلب يتعرض لإجهاد نقص تروية واستقلابية طوال الفترة التجريبية بأكملها ، فمن الممكن أن تكون محاولات إنهاء عدم انتظام ضربات القلب غير ناجحة حتى مع إزالة الرجفان الاحتياطي. كلما حدث هذا ، قم بتغيير محلول التروية إلى Tyrode العادي واترك القلب يتعافى لمدة 5 إلى 10 دقائق. عندما يعود تخطيط كهربية القلب إلى إيقاع الجيوب الأنفية، كرر البروتوكول من الخطوة 2.4.3 مرة أخرى.
  5. الخرائط البصرية
    1. قم بدمج القلب بمحلول Blebbistatin المعد في الخطوة 2.1.5 وانتظر حتى يحدث فك الارتباط الميكانيكي. يتم تحقيق ذلك عندما يتوقف القلب عن النبض ، ولكن إشارة تخطيط القلب لا تزال قابلة للقياس.
      ملاحظة: إن خلط محلول Blebbistatin مع التركيز المذكور والحفاظ على القلب مندمجا مع هذا المحلول يحافظ على النشاط الميكانيكي للقلب غير المقترن بالنشاط الكهربائي أثناء التجربة بأكملها.
    2. أعط صبغة الجهد 1 مل DI-4-ANBDQPQ (أعدت في الخطوة 2.1.4) كبلعة في فخ الفقاعة من تروية لانغندورف. انتظر لمدة 5 إلى 10 دقائق للسماح للصبغة بأداء القلب بشكل موحد.
      ملاحظة: تجنب التبييض الضوئي للصبغة عن طريق إيقاف تشغيل الضوء الأحمر كلما لم يتم إجراء أي تسجيل. إذا أصبحت نسبة الإشارة إلى الضوضاء في التسجيل صغيرة جدا (الإشارة المكتسبة صاخبة جدا)، كرر الخطوتين 2.1.4 و2.5.2.
    3. ركز الكاميرا على سطح القلب، وقم بتشغيل LED 3، واستخدم طاقة بصرية تبلغ 1.27 ميجاوات مم-2 .
    4. أطفئ أضواء المختبر وابدأ التسجيل. تأكد من الحصول على إشارة بصرية من خلال مقارنة تردد الإشارة التي تم الحصول عليها بتردد تخطيط القلب المسجل. هذا يضمن أن الإشارة الضوئية التي تم الحصول عليها مرتبطة تماما بالنشاط الكهربائي للقلب.
      ملاحظة: نظرا لأن الضوء الفلوري المنبعث من الصبغة هو أسبوع واحد جدا ، يتم رسم الخرائط البصرية في غرفة مظلمة. هذا يتجنب تداخل الإشارة من أي مصادر ضوء أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح البروتوكول بتحريض عدم انتظام ضربات القلب البطيني في قلوب الفئران السليمة باستخدام نبضات التحفيز الضوئي الناتجة عن LED 1 و LED 2 (الشكل 1) بتردد f ind بين 25 هرتز و 35 هرتز ومدة نبض Wind بين 2 مللي ثانية و 10 مللي ثانية. يرجى ملاحظة أن الهدف من هذه النبضات الضوئية السريعة ليس التقاط إيقاع القلب ولكن بدلا من ذلك عدم توازن نشاط القلب بحيث يمكن توليد موجات كهربائية غير منتظمة ، مما يسهل بعد ذلك عدم انتظام ضربات القلب. تتمثل ميزة تحفيز عدم انتظام ضربات القلب بالضوء على الحث مع التحفيز الكهربائي في عدم إثارة أي قطع أثرية في تخطيط القلب ، مما يوفر إمكانية تحليل الإشارة المكتسبة دون قيود وحتى تقييم الاستجابة الكهربائية للقلب أثناء الوتيرة السريعة ، كما توفر هذه الحقيقة إمكانية مراقبة سلوك القلب أثناء إزالة الرجفان الضوئي. هذا غير ممكن مع طرق الحث الكهربائي أو إزالة الرجفان. ومع ذلك ، إذا كان الإعداد المستخدم لا يسمح باستخدام مصابيح LED خارجية عالية الطاقة ، على سبيل المثال ، بسبب قيود المكان ، يمكن وضع قطب كهربائي إضافي على القلب للحث على عدم انتظام ضربات القلب ، كما هو موضح في مكان آخر3،22،24.

بمجرد حدوث الرجفان ، يجب أن يستمر عدم انتظام ضربات القلب لمدة 5 ثوان على الأقل لضمان استمراره ، وبعد ذلك تبدأ محاولات إزالة الرجفان المستندة إلى LED الصغير. نظرا لأن المعلمات الرئيسية لعدم انتظام ضربات القلب ، مثل طول الدورة الأساسية أو التردد السائد والسعة والمورفولوجيا ، تتغير باستمرار ، وبما أنه من غير الممكن التنبؤ بمعلمات إزالة الرجفان الضوئي التي توفر أفضل نتيجة ، فقد كان من المهم للغاية فهم ما إذا كانت هناك علاقة بين التردد وعرض النبض ، منطقة التحفيز الضوئي ومعدل الإنهاء. لذلك ، تم اختبار سلسلة من التجارب ذات الترددات المختلفة f def ، وعدد من مصابيح LED الدقيقة ، وفترات النبض Wdef ، وتم استخراج معدل نجاح N = 11 فأرا ، كما هو موضح في الشكل 3.

يمكن إثبات أن النبضات من 1 إلى 20 مللي ثانية يمكن أن تزيل الرجفان بمعدلات نجاح مختلفة (الشكل 3). نظرا لأن شدة الضوء LIμLED ظلت ثابتة خلال كل نبضة تحفيز ضوئي ، كما هو مذكور في الخطوة 2.4.6 ، وكان معدل نجاح ثلاثة مصابيح LED صغيرة مقابل تسعة أقل بشكل ملحوظ ، تشير النتائج المقدمة إلى أن المنطقة المغطاة على القلب ، وعدد مصابيح LED الدقيقة ، وبالتالي التدفق الإشعاعي الكلي المطبق هي عوامل حاسمة في تحقيق إزالة الرجفان. وبالنظر إلى أن كل مصباح LED صغير على الصفيف هو مصدر ضوء لامبرتيان وأنه يتم وضعه مباشرة على سطح القلب بحيث تكون المسافة التقريبية إلى الأنسجة صفرا، يمكن افتراض أن محيط الإشعاع للمنطقة المضاءة على القلب عند استخدام مصباح LED صغير واحد يعادل AμLED = 0.059 مم²، كما هو موضح أيضا في25 لمصابيح LED المستطيلة المسطحة. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن بعض الفوتونات قد تترك الصمام الصغير أفقيا من الحواف ، إلا أن مساهمة تلك الفوتونات في شدة الضوء الكلية تعتبر صغيرة جدا بحيث يمكن إهمال تأثيرها. لتحديد كمية الضوء المشعع للصفيف ، قام المؤلفون بقياس التدفق المشع من صفيف micro-LED باستخدام مقياس طاقة تجاري وحسبوا شدة الضوء التي تصل إلى القلب كما هو موضح في الجدول 1. من الجدول 1 ، يمكن أيضا قراءة أن التدفق الإشعاعي يزداد مع عدد مصابيح LED الصغيرة المستخدمة ، لكن شدة الضوء تظل ثابتة بسبب آثار ملف تعريف الإضاءة المذكورة من قبل.

ومن المثير للاهتمام ، يمكن أيضا ملاحظة أن معدل نجاح تسعة مصابيح LED مع W def = 1 مللي ثانية (الشكل 3a) و W def = 20 مللي ثانية (الشكل 3d) عند تردد إزالة الرجفان f def = 18 Hz و f def = 20 Hz مرتفع نسبيا. بالنظر إلى أن متوسط تردد عدم انتظام ضربات القلب المستحث هو 22.55 ± 4.03 هرتز ، فقد تشير هذه الحقيقة إلى أنه بالنسبة لقلوب الفئران ChR2 ، يزداد معدل النجاح بشكل كبير كلما اقترب تردد السرعة من تردد عدم انتظام ضربات القلب. ويظهر هذا أيضا في المحاكاة العددية26. ومع ذلك ، لا يمكن تعميم هذا بسهولة لأن التردد السائد لعدم انتظام ضربات القلب المعقد يتغير باستمرار. لتوضيح ذلك ، يوضح الشكل 4 محاولتين مختلفتين لإزالة الرجفان مع fdef = 14 Hz. في بداية جزء تخطيط القلب في الشكل 4 أ) ووفقا لمورفولوجيا إشارة تخطيط القلب ، يظهر الرجفان البطيني (VF). عندما يبدأ التحفيز الضوئي micro-LED ، يتحول الرجفان إلى نمط أكثر ترتيبا والذي من المرجح أن يكون تسرع القلب البطيني (VT). كلما تم إيقاف تشغيل صفيف micro-LED ، تتولى موجات VF الفوضوية الأصلية زمام الأمور مرة أخرى. وبالتالي ، لا يتم إنهاء عدم انتظام ضربات القلب. على الرغم من أنه في هذا المثال لا يمكن إنهاء VF باستخدام المعلمات المحددة ، إلا أنه يتم إزعاجه ويمكن تغييره إلى نمط أكثر انتظاما (VT). الشكل 4 ب ويبين الجزء 1 أن التردد المهيمن البالغ 24 هرتز يزداد قليلا حتى يبدأ التحفيز الضوئي ويتحول VF إلى VT في الجزء 2، حيث ينخفض التردد السائد إلى 14 هرتز. علاوة على ذلك ، يوضح الشكل 4c VT الذي يمكن إنهاؤه بنفس f def كما في الشكل 4a ، ولكن معW def مختلف. أولا ، يغير التحفيز الضوئي micro-LED مورفولوجيا عدم انتظام ضربات القلب ، لإنهائه أخيرا بالتقاط سرعة 1: 1 منالنبضة 19 فصاعدا. قد تشير هذه النتائج إلى أن معلمات إزالة الرجفان الضوئي ، على سبيل المثال Wdef ، يجب أن تتكيف مع التغيير المورفولوجي لعدم انتظام ضربات القلب بمرور الوقت. أجريت التجارب التي أدت إلى هذه النتائج دون استخدام Blebbistatin بسبب التغيير الناتج في مدة العمل المحتملة (APD)27. لذلك، لم يتم إجراء أي رسم خرائط بصرية في هذه السلسلة.

تم إجراء مجموعة أخرى من التجارب لرسم الخرائط البصرية باستخدام صبغة الجهد ذات الانزياح الأحمر (الخطوة 2.1.4). يسمح رسم الخرائط البصرية باستخدام كاميرات عالية السرعة بمراقبة موجات الإثارة المنتشرة على سطح القلب أثناء إيقاع الجيوب الأنفية (الشكل 5) و tachyarrhythmias28 المعقدة. نظرا لأن التغيير الجزئي لصبغة الجهد منخفض جدا ، فقد تمت معالجة مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها بعد المعالجة باستخدام لغة برمجة رياضية. الخطوة الأولى لتحسين جودة الإشارات الضوئية هي إزالة الضوضاء باستخدام مرشح تجانس غاوسي مع انحراف معياري σ = 1 ، يليه مرشح ممر النطاق الترددي مع ترددات الزاوية fعالية = 0.1 هرتز و fمنخفضة = 70 هرتز. يزيل نطاق التوقف عند fhigh التغيرات البطيئة في الإشارة التي لا ترتبط بتردد الجيوب الأنفية للقلب الذي يقع بين 3 هرتز < fالجيوب الأنفية < 8 هرتز ، بينما يزيل نطاق التوقف fالمنخفض الضوضاء عالية التردد التي تلتقطها الكاميرا. من المهم ملاحظة أن كل من انبعاثات الضوء الأزرق من LED 1 و LED 2 ومن صفيف micro-LED يمكن أن تسبب محادثة متقاطعة وإشارة تداخل عالية جدا في رسم الخرائط البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أنه حتى مرشح ممر النطاق الترددي الضيق جدا أمام الكاميرا، مع طول موجي λمرشح كامة ، كما هو مذكور في الخطوة 1.2.3، لن يقوم بتصفية تأثير الضوء الأزرق. قد يكون سبب ذلك جزئيا استجابة الإثارة للصبغة نفسها. لذلك كن حذرا جدا عند اختيار البصريات لرسم الخرائط البصرية. بالنسبة لوسائل تحليل الفيديو ، كان لا بد من إهمال جميع الإطارات التي تم تسجيل الضوء الأزرق فيها بحيث لا يمكن في كثير من الحالات تصور القلب أثناء التحفيز الضوئي ، كما ذكر أيضا في دراسة أخرى29.

Figure 1
الشكل 1: مخطط الإعداد الكهربائي والبصري. (أ) يوفر LED 1 و LED 2 مصدرا للضوء الأزرق يستخدم لتحريض عدم انتظام ضربات القلب وإزالة الرجفان الاحتياطي. يستخدم LED 3 كمصدر ضوء مثير للصبغة ذات الانزياح الأحمر DI-4-ANBDQPQ. يتم توجيه الضوء الأحمر إلى القلب عن طريق المرآة ثنائية اللون DM. يتم تسجيل ضوء الانبعاثات الموضح باللون الأحمر الداكن بواسطة الكاميرا عالية السرعة من خلال مرشح الانبعاثات ، كما هو مذكور في النص. لا تظهر أقطاب LED 2 و ECG للبساطة. (ب) جزء واحد من إشارة تخطيط كهربية القلب المسجلة المبينة باللون الأحمر. يظهر اللون الأزرق الداكن نبضات الضوء من LED 1 و LED 2 بتردد f ind = 35 Hz و Wind = 4 مللي ثانية المستخدمة للحث على الرجفان. مباشرة بعد الانتهاء من التحفيز الخفيف ، يمكن ملاحظة الرجفان البطيني (VF). التحفيز الضوئي القائم على LED الصغير الموضح باللون الأزرق الفاتح (f def = 16 Hz ، Wdef = 20 ms) ينهي بنجاح عدم انتظام ضربات القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحضير القلب. (أ) فتح صدر الفأر الذي يظهر القلب السليم والأعضاء المحيطة به. (ب) قلب مزروع مغمور في محلول تيرود المثلج البارد لمزيد من التحضير. (ج) قلب الفأر متصل بشكل صحيح بإبرة حادة. (د) قلب مورين معلق في محلول تيرود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: معدلات النجاح المستخرجة تجريبيا. معدلات نجاح 30 نبضة تحفيز ضوئي تعتمد على المصابيح الدقيقة باستخدام ثلاثة وستة وتسعة مصابيح LED في فترات نبض مختلفة W def والترددات fdef ل N = 11. أشرطة الخطأ المعروضة مع الخطأ القياسي لمتوسط S.E.M. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التلاعب بإيقاع القلب عن طريق التحفيز الضوئي . (أ) جزء من تسجيل تخطيط القلب لعدم انتظام ضربات القلب غير المنتهية. (ب) الطيف الطيفي لتخطيط كهربية القلب المبين في اللوحة ألف. تظهر الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) للجزء (1) عدم انتظام ضربات القلب بتردد مهيمن يبلغ 24 هرتز. يمكن ملاحظة أن التردد السائد ينخفض إلى 14 هرتز. الجزء (3) الإنهاء غير الناجح والعودة إلى السلوك غير الإيقاعي مع تردد مهيمن يبلغ 24 هرتز. (ج) تخطيط القلب لمحاولة إزالة الرجفان الناجحة. (د) الطيف الطيفي للإنهاء الناجح المعروض في اللوحة ج. يظهر الجزء (1) تسرع القلب البطيني (VT) بتردد مهيمن يبلغ 23 هرتز. يعرض الجزء (3) إنهاءا ناجحا ، مما يؤدي إلى إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعي بتردد أساسي يبلغ 3.5 هرتز والتوافقيات الناتجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: رسم الخرائط البصرية للقلب كله. يظهر تغير شدة التألق خلال نبضة واحدة من القلب في إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعي. تم وضع القلب في مواجهة الكاميرا بحيث يكون البطين الأيمن والأيسر مرئيين (RV و LV). تعرض العلامة النجمية البكسل الذي تم فيه اتخاذ الإجراء المحتمل الموضح في الأعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عدد المايكرو إل إي دي المنطقة المشععة Aμled [مم2] تدفق مشع φ [mW] شدة الضوء LI [mW mm-2]
3 0.178 5.9 ± 0.47 33.11 ± 2.66
6 0.356 11.91 ± 0.84 33.42 ± 2.37
9 0.535 17.85 ± 0.61 33.39 ± 1.14

الجدول 1: قياس التدفق الإشعاعي لمصفوفة micro-LED وشدة الضوء المقابلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العلاج الناجح لاضطرابات نظم القلب هو مفتاح علاج القلب. ومع ذلك ، فإن الآليات الفيزيائية الحيوية الكامنة وراء بدء عدم انتظام ضربات القلب واستمراره وإنهائه ليست مفهومة تماما. لذلك ، تهدف أبحاث القلب إلى تحسين العلاج بالصدمة الكهربائية نحو إنهاء أكثر لطفا لعدم انتظام ضربات القلب ، وبالتالي زيادة نوعية حياة المرضى28،29،30،31. تعد الأساليب الكهربائية منخفضة الطاقة بانخفاض كبير في الآثار الجانبية الشديدة ، ومع ذلك قد لا تزال تحفز إثارة العضلات غير المرغوب فيها. يمكن لعلم البصريات الوراثي القلبي التغلب على هذا القيد وتوفير ليس فقط تقنية إنهاء الأنسجة اللطيفة ولكن أيضا منصة مرنة للتحقيق في التحكم المستهدف الخاص بعدم انتظام ضربات القلب لموجات الإثارة الشبيهة بالدوامة في قلب الفئران السليم وفي مزارع الخلايا32,33.

وبالنظر إلى هذا الدافع، تم تصميم وتنفيذ إعداد قوي للمحاكاة الضوئية، فضلا عن بروتوكول، وكلاهما يوفر نظاما بصريا قابلا للتكيف بدرجة عالية، والذي يمكن توسيعه بسهولة ليشمل دراسات رسم الخرائط البصرية البانورامية ثلاثية الأبعاد34.

يمكن إثبات أن عدم انتظام ضربات القلب يمكن إنهاؤه بنجاح بمعدلات نجاح مختلفة اعتمادا على المعلمات التي يتم اختيارها للتحفيز الضوئي ، على سبيل المثال المنطقة المضاءة على القلب. تشير النتائج المقدمة إلى أن زيادة السطح المشعع جندت عددا حرجا من الخلايا العضلية القلبية التي تطفئ النشاط الفوضوي عن طريق كتلة التوصيل كما هو موضح أيضا في22. في هذه الدراسة ، تكون الطاقة اللازمة لإزالة الرجفان الضوئي هي E = 10.69 ± 0.37 mJ (باستخدام تسعة مصابيح LED صغيرة و 30 نبضة وعرض النبضة Wdef = 20 مللي ثانية). اتضح أن هذا أقل مما تم الإبلاغ عنه سابقا في 22,24 مع E 22 = 228.8 mJ و E 24 = 153.6 mJ ، حيث تمت إضاءة مساحة أكبر22 أو القلب بأكمله 24 ، على التوالي. ومع ذلك ، بالمقارنة مع النهج الموضح في 35 ، حيث يتم إضاءة منطقة منقوشة محددة جيدا ب 10 نبضات إزالة الرجفان الضوئي مما يؤدي إلى E 35 = 1.8 mJ ، فإن طاقة إزالة الرجفان الضوئي في هذه الدراسة أعلى بشكل ملحوظ. وعلى النقيض من النهج الثلاثة الأخرى، لم يكن بالإمكان الوصول إلى معدل نجاح يزيد عن 90 في المائة باستخدام البروتوكول المعروض. قد يكون أحد الأسباب المحتملة لانخفاض الأداء على الرغم من ارتفاع طاقة إزالة الرجفان الضوئي هو عدم النظر في تعقيد عدم انتظام ضربات القلب الأساسي. فيما يتعلق بالنتائج المقدمة في 35 ، حيث يتم تحقيق معدل إنهاء مرتفع عن طريق إضاءة منطقة صغيرة على القلب ، وفي الوقت نفسه قياس الديناميكيات المكانية والزمانية لعدم انتظام ضربات القلب ، يمكن بالتأكيد تحسين النهج المقدم من خلال النظر في التحكم في التغذية المرتدة ، والذي يستجيب بنمط مختلف من إضاءة micro-LED اعتمادا على الحالة الحالية للقلب.  علاوة على ذلك ، ثبت أيضا أنه على الرغم من أنه لا يمكن دائما إنهاء عدم انتظام ضربات القلب بالطريقة الحالية ، إلا أنه يمكن إزعاج الديناميكيات المعقدة الجوهرية أثناء التحفيز الضوئي مما يؤدي إلى حالة زمنية أكثر ترتيبا. كما هو موضح في36 ، يختلف معدل الإنهاء اختلافا كبيرا عند معالجة عدم انتظام ضربات القلب أحادي الشكل (أكثر ترتيبا) ومتعدد الأشكال (أقل ترتيبا). وبالتالي فإن الخطوة المنطقية نحو معدل أفضل لإزالة الرجفان قد تكون التأثير على ديناميكيات القلب خلال حلقة VF ، وتحويل عدم انتظام ضربات القلب إلى نمط أقل تعقيدا وتنتهي بمجموعة أخرى من النبضات ، وبناء نهج التحفيز الضوئي من خطوتين بهذه الطريقة.

فيما يتعلق ببروتوكول التروية ، توجد أهم الخطوات في الاستخراج الصحيح للقلب وإعداده وكذلك في التعديل الصحيح لبصريات الخرائط البصرية. يتطلب تضمين الخرائط البصرية بدقة الاختيار الصحيح لأطياف الصبغة ومصادر ضوء الإثارة المناسبة والمرشحات البصرية المختارة جيدا للكاميرا29. خلاف ذلك ، قد تكون الإشارات الضوئية المسجلة صاخبة للغاية ويمكن أن تحتوي أيضا على حديث متقاطع عن التحفيز الضوئي مع إثارة الصبغة. ولذلك فإن التحليل اللاحق سيتطلب المعالجة اللاحقة للإشارات بعدة مرشحات تحليلية وتنعيم الصور مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى التدهور.

خطوة أخرى حاسمة في هذا البروتوكول هي الموضع الصحيح والدقيق لصفيف micro-LED. نظرا لأن الخيط المترابط بين صفيف micro-LED والسائق رقيق ومرن للغاية ، فمن الصعب في بعض الأحيان التأكد من أن الصفيف سيكون موجودا في نفس الموقع تقريبا على سطح القلب لكل تجربة. لتسهيل تحديد المواقع وإصلاح الموضع المكتسب لصفيف micro-LED ، تم تصميم حامل وطباعته في 3D ، مما يسمح بتوصيل الصفيف بجهاز micromanpulator. هذا يعطي المزيد من التحكم في حركة الصفيف في حل Tyrode. اعتمادا على المواد المختارة للرصاص المترابط لصفيف micro-LED ، قد لا يكون استخدام حامل ضروريا.

إلى جانب ذلك ، هناك خطوة حاسمة أخرى للبروتوكول تتمثل في إضافة أدوية مؤيدة لعدم انتظام ضربات القلب ، مثل Pinacidil37 على سبيل المثال. نظرا لأن العديد من المركبات الكيميائية معروفة جيدا بتغيير الاستجابة الفسيولوجية للقلب ، فيجب مراعاة ذلك عند تحليل النتائج وتفسيرها. فيما يتعلق برسم الخرائط البصرية ، يستخدم البروتوكول المقترح Blebbistatin كوحدة ميكانيكية غير مقترنة. هذا له ميزة إزالة القطع الأثرية المتحركة أثناء التسجيل ، ولكن يمكنه أيضا إطالة APD27. للتغلب على هذا العيب ، يمكن اعتبار تحليل طرق تتبع الحركة أثناء التسجيل38,39. بهذه الطريقة ، سيتم الحفاظ على الحالة الفسيولوجية الطبيعية للقلب ، ويمكن الحصول على إشارة عالية الجودة.

على الرغم من أنه ثبت أن البروتوكول المقدم يمكن استخدامه لإزالة الرجفان الضوئي متعدد المواقع ، إلا أنه لا يزال لديه بعض القيود. وقد وجد أنه في بعض الحالات لا يمكن إنهاء الرجفان عن طريق التحفيز الضوئي القائم على الصمام الصغير ولكن يتم إزعاجه فقط ، مما يؤدي إلى تغييرات في التردد. إحدى الفرضيات هي أن الموجات المتعرجة على القلب يتم تهجيرها فقط من البطين الأيسر ، وتجدد نفسها في أجزاء أخرى من القلب. بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل الإضاءة العالمية24 ، توفر الطريقة الحالية معدل نجاح أقل بسبب تغطية أصغر للقلب. على الرغم من ذلك ، نحن واثقون من أنه مع طريقة التعرف المناسبة القائمة على الأجهزة للنشاط الحلزوني ، فإن تحسين معدل نجاح الإنهاء أمر ممكن.

في الختام ، يؤسس نظام التحفيز الضوئي المقدم أداة تجريبية قوية لنهج تقويم نظم القلب المتعددة ودراسات التلاعب بعدم انتظام ضربات القلب. سيتم استخدام المعرفة المستفادة في هذا النظام للتحقيق في بروتوكولات إزالة الرجفان المحتملة الجديدة (الصورة) وتقييمها في النماذج الحيوانية الكبيرة ذات الصلة سريريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا ماريون كونزي وتينا ألتهاوس على دعمهم الفني الممتاز أثناء التجارب. وقد تلقى البحث الذي أدى إلى النتائج تمويلا من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية FP7/2007-2013 بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241526. كما تم تقديم الدعم من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، DZHK e.V. (المشروع MD28)، والموقع الشريك Goettingen، ومؤسسة الأبحاث الألمانية CRC 1002 (المشروع C03)، وجمعية ماكس بلانك. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل BrainLinks-BrainTools ، مجموعة التميز التي تمولها مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG ، رقم المنحة EXC 1086).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemical Components
Blebbistatin TargetMol T6038 10 mM stock solution
BSA/Albumin Sigma-Aldrich A4919
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Carbogen Westfalen 50 l bottle
DI-4-ANBDQPQ AAT Bioquest 21499 Dye for Optical Mapping
Glucose Sigma-Aldrich D9434 C6H12O6
Heparin LEO Pharma Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription
Hydrochlorid Acid Merck 1.09057.1000 HCl, 1 M stock solution
Isoflurane CP Pharma 1 ml/ml, available only on prescription
Magnesium Chloride Merck 8.14733.0500 MgCl2
Monopotassium Phosphate Sigma-Aldrich 30407 KH2PO4
Pinacidil monohydrate Sigma-Aldrich P154-500mg 10 mM stock solution
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 KCl
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 NaCl
Sodium Hydroxide Merck 1.09137.1000 NaOH, 1 M stock solution
Electrical Setup
Biopac MP150 Biopac Systems MP150WSW data acquisition and analysis system
Custom-built ECG, alternative ECG100C Biopac Systems ECG100C Electrocardiogram Amplifier
Custom-built water bath heater using heating cable RMS Heating System HK-5,0-12 Heating cable 120W
Hexagonal water bath
LED Driver Power supply Thorlabs KPS101 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube.
LEDD1B LED Driver Thorlabs LEDD1B T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current
MAP, ECG Electrode Hugo Sachs Elektronik BS4 73-0200 Mini-ECG Electrode for isoalted hearts
micro-LED Driver e.g. AFG Agilent Instruments A-2230 Arbitrary function generator (AFG)
Signal Generator Agilent Instruments A-2230 AFG
micro-LED Array Components
Epoxid glue Epoxy Technology EPO-TEK 353ND Two component epoxy
Fluoropolymer  Asahi Glass Co. Ltd. Cytop 809M Fluoropolymer with high transparency
Image reversal photoresist Merck KGaA AZ 5214E Image Reversal Resist for High Resolution
LED chip  Cree Inc. C460TR2227-S2100 Blue micro-LED
Photoresist Merck KGaA AZ 9260 Thick Positive Photoresists
Polyimide UBE Industries Ltd. U-Varnish S Polyimide Solution
Silicone NuSil Technology LLC MED-6215 Low viscosity silicone elastomer
Solvent free adhesive John P. Kummer GmbH Epo-Tek 301-2 Epoxy resin with low viscosity
Optical Mapping
Blue Filter Chroma Technology Corporation ET470/40x Blue excitation filter
Camera Photometrics Cascade 128+ High performance EMCCD Camera
Camera Objective Navitar DO-5095 Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras
Dichroic Mirror Semrock FF685-Di02-25x36 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter
Emmision Filter Semrock FF01-775/140-25 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter
Heatsink Advanced Thermal Solutions ATSEU-077A-C3-R0 Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware
LED 1 and LED 2 LED Engin Osram LZ4-00B208 High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3 Thorlabs M625L3 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA
Lenses LED Engin Osram LLNF-2T06-H LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Photodiode for power meter Thorlabs S120VC Standard Photodiode Power Sensor
Power Meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter
Red Filter Semrock FF02-628/40-25 BrightLine® single-band bandpass filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
  3. Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
  4. Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  6. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  7. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  8. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
  9. Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
  10. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  11. Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
  12. Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
  13. Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
  14. Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
  15. Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
  16. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. 36th Annual Internation Conference IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Chicago, IL, , 5252-5255 (2014).
  17. Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. 28th IEEE Proceedigns. MEMS, Estoril, , 162-165 (2015).
  18. Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light - From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. 40thAnnual International Conference of IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Honolulu, HI, , 4832-4835 (2018).
  19. Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
  20. mouser.de, LED Engin, [Online]. , Available: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208- 1531969.pdf (2020).
  21. thorlabs.com, thorlabs, [Online]. , Available: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020).
  22. Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
  23. Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
  24. Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
  25. Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
  26. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Computing in Cardiology, Belfast, , 345-348 (2010).
  27. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
  28. Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
  29. O'Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping - Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
  30. Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
  31. Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
  32. Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
  33. Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
  34. Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
  35. Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
  36. Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
  37. Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
  38. Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
  39. Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).

Tags

الطب، العدد 174، علم البصريات القلبية، رسم الخرائط البصرية، LED، DI-4-ANBDQPQ، بليبيستاتين، قناة رودوبسين-2، ChR2
إدارة إيقاع القلب المتقدمة من خلال تطبيق التحفيز الضوئي متعدد المواقع البصري الوراثي في قلوب الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz-Maue, L., Steinebach, J.,… More

Diaz-Maue, L., Steinebach, J., Schwaerzle, M., Luther, S., Ruther, P., Richter, C. Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (174), e62335, doi:10.3791/62335 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter