Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kontrollerte halvautomatiske laserinduserte skader for å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk larver

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å indusere vevsspesifikke og svært reproduserbare skader i sebrafisk larver ved hjelp av et laserlesjonssystem kombinert med en automatisert mikrofluidisk plattform for larvehåndtering.

Abstract

Sebrafisk larver har et fullt funksjonelt sentralnervesystem (CNS) med høy regenerativ kapasitet bare noen få dager etter befruktning. Dette gjør denne dyremodellen veldig nyttig for å studere ryggmargsskade og regenerering. Standardprotokollen for å indusere slike lesjoner er å transektere den dorsale delen av stammen manuelt. Denne teknikken krever imidlertid omfattende trening og skader ekstra vev. En protokoll ble utviklet for laserinduserte lesjoner for å omgå disse begrensningene, noe som muliggjør høy reproduserbarhet og fullstendig ryggmargstranseksjon over mange dyr og mellom forskjellige økter, selv for en utrent operatør. Videre er vevsskade hovedsakelig begrenset til selve ryggmargen, noe som reduserer forvirrende effekter fra å skade forskjellige vev, for eksempel hud, muskler og CNS. Videre er hemi-lesjoner i ryggmargen mulig. Forbedret bevaring av vevsintegritet etter laserskade letter ytterligere disseksjoner som trengs for ytterligere analyser, for eksempel elektrofysiologi. Derfor gir denne metoden presis kontroll over skadeutbredelsen som ikke kan oppnås manuelt. Dette gir mulighet for nye eksperimentelle paradigmer i denne kraftige modellen i fremtiden.

Introduction

I motsetning til pattedyr kan sebrafisk (Danio rerio) reparere sentralnervesystemet (CNS) etter skade1. Bruken av sebrafisk larver som modell for ryggmargsregenerering er relativt nylig. Det har vist seg verdifullt å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for reparasjon2. Dette skyldes enkel manipulering, den korte eksperimentelle syklusen (nye larver hver uke), vevets optiske gjennomsiktighet og larvenes lille størrelse, ideelt egnet for in vivo fluorescensmikroskopi.

Ved regenerering av ryggmargen er to ekstra fordeler ved å bruke larver hastigheten på utvinning, noen dager sammenlignet med noen uker for voksne, og den enkle å indusere skader ved hjelp av manuelle teknikker. Dette har blitt brukt i mange studier3,4,5, inkludert nyere undersøkelser6,7. Totalt sett fører dette til økt meningsfull dataproduksjon, høy tilpasningsevne av eksperimentelle protokoller og reduserte eksperimentelle kostnader. Bruken av larver yngre enn 5 dager etter befruktning reduserer også bruken av dyr etter 3R-prinsippene i dyreforskning8.

Etter en ryggmargsskade i sebrafisk larver, forekommer mange biologiske prosesser, inkludert inflammatorisk respons, celleproliferasjon, nevrogenese, migrasjon av overlevende eller nylig genererte celler, reformasjon av funksjonelle aksoner og en global ombygging av nevrale prosesser kretser og ryggvev6,7,9,10 . For å lykkes orkestrert, innebærer disse prosessene en finregulert interaksjon mellom en rekke celletyper, ekstracellulære matrisekomponenter og biokjemiske signaler11,12. Unraveling detaljene i denne betydelige omorganiseringen av et komplekst vev som ryggmargen krever bruk og utvikling av presise og kontrollerte eksperimentelle tilnærminger.

Det primære eksperimentelle paradigmet som brukes til å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk er å bruke kirurgiske midler for å indusere vevsskader ved reseksjon, stabbing eller kryoinjury3,13. Disse tilnærmingene har ulempen med å kreve spesifikk opplæring i mikrokirurgiferdigheter, noe som er tidkrevende for enhver ny operatør og kan forhindre bruk i kortsiktige prosjekter. Videre fremkaller de vanligvis skade på det omkringliggende vevet, noe som kan påvirke regenerering.

En annen tilnærming er å indusere celleskade kjemisk14 eller ved genetiske manipulasjoner15. Sistnevnte gir svært målrettet skade. En slik teknikk krever imidlertid langt forberedende arbeid for å generere ny transgen fisk før du gjør noe eksperiment, fornyet hver gang en unik celletype er målrettet.

Det er dermed behovet for en metode som tillater målrettede, men allsidige lesjoner som passer til en rekke studier i regenerering. En løsning er å bruke en laser for å indusere lokalisert skade i vev av interesse16,17,18,19,20. Faktisk presenterer bruken av laserindusert vevsskade en robust tilnærming for å generere ryggmargslesjoner med mange fordeler. Mikroskopene utstyrt med slike lasermanipuleringsmoduler gjør det mulig å spesifisere et tilpasset formet område der celleablasjon vil oppstå, med den ekstra fordelen av temporal kontroll. Lesjonens størrelse og posisjon kan dermed tilpasses for å ta opp eventuelle spørsmål.

Den manglende egenskapen til de fleste laserlesjonssystemer er muligheten til å indusere skader på en svært reproduserbar måte for en rekke larver. Her beskrives en original protokoll ved hjelp av en UV-laser for å indusere halvautomatiske presise og kontrollerte lesjoner i sebrafisklarver basert på en mikrofluidisk plattform designet for automatisert larvehåndtering21. Videre, i systemet som presenteres her, settes larver inn i en glasskapillær, noe som tillater fri rotasjon av dyret rundt rostrocaudalaksen. Brukeren kan velge hvilken side av larven som skal presenteres for laseren, samtidig som fluorescensavbildningen kan målrette laserstrålen nøyaktig og vurdere skaden etter lesjonen.

Protokollen beskrevet her brukes med et halvautomatisk sebrafisk larver bildebehandlingssystem kombinert med en spinnende disk utstyrt med en UV-laser (utpekt heretter som VAST-systemet). Imidlertid er hovedpunktene i protokollen og de fleste påstandene om teknikken gyldige for ethvert system utstyrt med en laser som er i stand til celleablasjon, inkludert to-foton laserskanningsmikroskoper, spinneskivemikroskoper utstyrt med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskoper med en lasermodul for fotomanipulering. En av de viktigste forskjellene mellom VAST-systemet og konvensjonell prøvehåndtering vil være at for sistnevnte vil monteringslarver i lavsmeltende punkt agarose på glassdeksler / glassbunn Petri-retter i stedet for å laste dem i en 96-brønns tallerken være nødvendig.

Fordelene ved denne metoden åpner muligheter for innovativ forskning på cellulære og molekylære mekanismer under regenereringsprosessen. Videre åpner den høye datakvaliteten for kvantitative undersøkelser i en tverrfaglig sammenheng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble utført med godkjenning fra DET britiske hjemmekontoret og i henhold til regelverket, under prosjektlisens PP8160052. Prosjektet ble godkjent av University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. For eksperimentelle analyser, sebrafisk larver opp til 5-dagers gammel av begge kjønn ble brukt av følgende tilgjengelige transgene linjer: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), T (betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) og Tg(mnx1:gfp) (se Tilleggsfil 1 om genereringen av de transgene sebrafisklinjene). Et skjematisk skjema for protokollen ved hjelp av den automatiserte sebrafisk larvehåndteringsplattformen er vist i figur 1. All tilpasset programvare, skript og detaljerte eksperimentelle protokoller som brukes i dette arbeidet, er tilgjengelige på https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Prøvepreparering

  1. Ved 5 timers etterbefruktning sorterer du embryoene for riktig utviklingsstadium21. Kast bort døde egg og dårlig utviklede og overutviklede embryoer.
  2. Ved 3 dager etter befruktning (dpf), bedøv larver ved å legge til 2 ml 0,4% aminobenzoic-acid-etyl metyl-ester til 50 ml fiskeanlegg vann i en 90 mm Petri tallerken. Bruk dyr oppdratt med fenylthiourea (PTU) (se Materialfortegnelse) for å forhindre hudpigmentering hvis det er et problem, noe som ikke er tilfelle for ryggmargsskader på 3 dpf larver beskrevet i denne protokollen.
    MERK: Denne relativt høye bedøvelseskonsentrasjonen brukes til å forhindre larverbevegelser etter laserpåvirkningen.
  3. Screen embryoene for fluorescerende reporteruttrykk (Tilleggsfil 1).
    MERK: En fluorescerende reporter for ryggmargen (eller annen struktur av interesse) er ofte nødvendig for å vurdere effektiviteten av skaden. Bruken av tg(Xla.Tubb:DsRed) bidrar til å identifisere ryggmargen.
  4. Overfør de valgte larvene til en 96-brønnsplate for bruk i VAST-systemet (se Materialfortegnelse) med 300 μL fiskeanleggsvann per brønn. Bruk mediet som inneholder bedøvelsesmiddelet direkte fra 90 mm Petri-retten. Sørg for å ha bare en larve per brønn. Forbered en ekstra tom 96-brønnsplate for å samle de lesjonerte larver.
    MERK: Hvis du bruker et annet laserlesjonssystem, monterer du larvene i 1% Low-Melting Point (LMP) agarose gel i et passende observasjonskammer.

2. Mikroskop forberedelse

  1. Slå på alle systemkomponentene (VAST, mikroskop, laser, PC), inkludert laseren for ablasjon.
  2. Når maskinvaren er fullstendig initialisert, start mikroskopprogramvaren ImageJ/Fiji, et pythonintegrert utviklingsmiljø (IDE) og den automatiserte sebrafiskavbildningsprogramvaren (VAST-systemet) hvis du bruker denne plattformen (se Materialfortegnelser).
  3. Konfigurer VAST-programvaren ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Når VAST-programvaren starter, velger du Plate i det første vinduet og klikker på Ferdig-knappen (figur 2A). Et annet lite vindu vil dukke opp og spørre om kapillæren er tom og ren. Kontroller ved å se på bildet av kapillæren hvis det er noen luftbobler inni. Hvis ikke, klikk på Ja. Hvis det er noen bobler, klikker du på Nei og følger trinn 2.3.2-2.3.3 (figur 2B).
    2. I vinduet Large Particle (LP) Sampler klikker du på Prime for å fjerne luftbobler (figur 2C).
    3. Gå til hovedprogramvarevinduet (med kapillærbildet) og høyreklikk på bildet. Velg Spill inn tomt kapillærbilde på hurtigmenyen (figur 2B).
    4. Gå til Fil-menyen i LP Sampler-vinduet, og velg alternativet Åpne skript. Velg en fil som inneholder skriptet som tilsvarer eksperimentet som skal utføres.
    5. I hovedvinduet for VAST-programvaren går du til Fil og velger Åpne eksperiment. Velg eksperimentfilen som tilsvarer det planlagte eksperimentet.
      MERK: Kontroller at boksene Automatisk lossing og Bulkutgang til avfall IKKE er merket av.
  4. Konfigurer mikroskopprogramvaren for avbildning.
    1. Start mikroskopavbildningsprogramvaren (se Materialfortegnelse) for å initialisere maskinvaren. Dette kan ta noen minutter, avhengig av systemet.
    2. Gå til oppkjøpsinnstillingene og sett opp mikroskopet for avbildning av fluoroforen uttrykt i larver. Bruk et 10x NA 0,5 vanndippende mål for å sikre at brennvidden er langs den optiske aksen til å lesjon hele dybden av ryggmargen eller det målrettede vevet.
  5. Sett opp ImageJ/Fiji for laserskader.
    1. Gå til Fil-menyen , velg Nytt/skript for å åpne skriptvinduet.
    2. Gå til Fil-menyen i Nytt-vinduet, og velg Åpne for å laste inn laserlesjonsskriptet (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Sett opp Python IDE.
    1. Start Python IDE.
    2. Gå til Fil-menyen og velg Åpne fil for å laste inn skriptet for å administrere laseren (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Gå til Kjør-menyen , og velg Kjør uten feilsøking for å kjøre skriptet. Kontroller at en sekvens med meldinger i TERMINAL-panelet vises sammen med noe støy mens laserdemperen initialiseres (figur 2D).

3. Utføre laserlesjoner på VAST-systemet

  1. Midtstill kapillæren i forhold til mikroskopmålet ved å flytte scenen ved å klikke på pilknappene i hovedvinduet til VAST-programvaren (figur 2B).
  2. Fokuser på toppen av kapillæren ved å se gjennom okularene og bruke mikroskopets overførte lys.
    FORSIKTIG: Kapillæren er svært skjør og kan brekke hvis den berøres av målet. Beveg mikroskopknappen sakte når du fokuserer inn og ut.
  3. Plasser 96-brønnsplatene på plateholderen på LP Sampler i VAST-systemet. Plasser platen som inneholder larver på venstre holder og platen for oppsamling til høyre. Pass på at platene er riktig innrettet: A1-brønnen må være i for venstre hjørne av holderen.
  4. I VAST-programvaren, i LP Sampler-vinduet, klikker du på PlateMal-knappen og velger alle brønnene som inneholder larver. Klikk på OK-knappen for å validere og lukke vinduet (figur 2C).
  5. I LP Sampler-vinduet klikker du på Kjør plate-knappen for å begynne å laste inn en larve.
    MERK: Etter en tid skal larven være synlig i kapillæren i posisjon (forhåndsdefinert i eksperimentdefinisjonsfilen), slik at ryggmargen kan skades. VAST-brettlyset slås av etter noen få rotasjoner for å sette larven med sidesiden vendt mot mikroskopmålet.
  6. Gå til mikroskopprogramvaren og klikk på Live-knappen for å avbilde larven.
  7. Drei mikroskopets fokusknapp til ryggmargens sentrale kanal er synlig.
    MERK: Det kan være lettere å fokusere ved hjelp av overført lys først, og deretter foredle med fluorescens.
  8. Ta et øyeblikksbilde i fluorescens og lagre bildet i en dedikert mappe.
  9. Åpne bildet i ImageJ og juster kontrasten om nødvendig (ved hjelp av menyen Bilde/Juster/Lysstyrke/kontrast... i ImageJ).
  10. Klikk på linjeverktøyet Region of Interest (ROI) og tegn en kort linje (20 μm) sentrert på ryggmargen (figur 3A).
  11. Bytt mikroskopet til 100 % reflekterende speilposisjon.
  12. Last inn ImageJ-skriptet og klikk på Kjør-knappen . Bruk følgende parametere: Repetisjon - 2; Eksempel - 1; Bredde - 40-mikron; Demping - 89 (full lasereffekt) (figur 3C).
  13. Når laserbildesekvensen er ferdig, bytter du til fluorescensavbildning på bildebehandlingsprogramvaren og justerer fokuset om nødvendig.
    MERK: Et fokusskifte observeres ofte på grunn av haleforskyvning under lasereksponering.
  14. Ta et nytt øyeblikksbilde og lagre det.
  15. Åpne dette nye bildet i ImageJ og tegn en ny linje som skal være større enn selve ryggmargen (~ 80 μm), som starter under ventralsiden av ryggmargen i den øvre delen av notokordet og går mot dorsalsiden for å ende i mellomrommet mellom ryggmargen og huden (figur 3B).
  16. Bytt mikroskopet til 100 % reflekterende speilposisjon.
  17. Gå til ImageJ-skriptvinduet og klikk på Kjør-knappen . Bruk følgende parametere: Repetisjon - 2; Eksempel - 1; Bredde - 40 mikron; Demping - 89 (full lasereffekt).
  18. Når den (lengre) laserbildesekvensen er fullført, må du kontrollere transeksjonskvaliteten ved å avbilde fluorescens og fokusering. Forsikre deg om at ingen celler eller axoner forblir intakte på lesjonsstedet, som skal vises som et mørkt eller som et svakt og homogent fluorescerende område (figur 3D, bunnpanel).
  19. Samle de lesjonerte larver i den tomme 96-brønnsplaten (med samme brønnkoordinater som den opprinnelige brønnen) ved å gå til hovedvinduet for VAST-programvaren og klikke på Samle-knappen .
  20. Slå på VAST-systemlyset igjen ved å klikke på avmerkingsboksen Skufflys nederst til venstre i vinduet.
  21. Gjenta trinn 3.3-3.17 for hver nye larve som skal bli skadet.

4. Håndtering etter lesjon og ytterligere eksperimenter

  1. Ta ut larver fra 96-brønnsplaten så snart som mulig og overfør dem til en ren Petri-tallerken med fersk fiskanleggsvann for larvene for å gjenopprette post-lesjon. Sett Petri-retten i en inkubator ved 28 °C.
    MERK: Skaden fortsetter ofte å forplante seg den første timen etter lesjonen. Den faktiske omfanget av lesjonen bør derfor vurderes ved fluorescensavbildning etter en forsinkelse på ca. 1 time.

5. Feilsøking

  1. Hvis luftbobler er til stede i rørene og kapillæren til VAST-systemet, klikker du på Prime-knappen i LP Sampler-vinduet for å fjerne dem.
  2. Vurder de mislykkede lesjonene (som vurdert fra gjenværende fluorescens på lesjonsstedet, bortsett fra forventet gjenværende og homogen bakgrunn), noe som kan skyldes flere årsaker nevnt nedenfor.
    1. Lav lasereffekt: Når dette skjer, prøv med en høyere verdi.
      MERK: VAST-systemet er utstyrt med en fargelaser. Dette innebærer at konsentrasjonen av fargestoffløsningen som brukes til laserlysgenerering, kan endres med tiden, noe som fører til en reduksjon i laserkraften. Bytte med en ny løsning løser vanligvis problemet22.
    2. Dårlig kalibrering: Når dette skjer, må du kontrollere kalibreringen og kraften til lasersystemet i henhold til trinn 5.2.2.1-5.2.2.4. Hvis den ikke kalibreres riktig, vil ikke laseren bli dirigert til ønsket sted, noe som fører til mislykkede lesjoner eller uønsket skade i tilstøtende vev.
      1. Plasser et speilsklie på toppen av kapillærkammeret. Fokuser på den belagte siden (den skal møte målet). Bruk en tidligere standard i lysbildet til å fokusere på en enklere måte.
      2. Påfør et mønster av laserablasjon ved hjelp av et kalibreringsskript.
      3. Vurder kvaliteten på mønsteret. Flekkene eller linjene skal virke skarpe og ikke uskarpe.
      4. Bruk en rampe med økende kraft til å vurdere om laserstrømmen har endret seg sammenlignet med de forrige øktene.
    3. Larvalbevegelse under lesjoner: Larver reagerer annerledes på anestesi; Dermed kan laserlesjonen utløse bevegelser av halen under prosessen, og dermed forhindre en vellykket transeksjon. Når dette skjer, ta en ekstra gjentakelse av laserlesjonen trinn for å fullføre den samtidig unngå skade på omkringliggende vev.
    4. Dårlig fokus: Når dette skjer, fokuser på midten av den sentrale kanalen for å få de beste resultatene.
    5. ROI-tegning, -posisjon og -størrelse: Plasseringen og størrelsen på avkastningen er avgjørende for vellykkede transeksjoner. Avkastningen skal være større enn ryggmargen og sentrert i midten av ryggmargen. For å løse dette, begynn å trekke avkastningen fra den ventrale siden av ryggmargen og gå opp mot dorsalsiden for å oppnå vellykket transeksjon. Dette skyldes sannsynligvis halebevegelser utløst av sekvensen av laserskudd under ablasjonsprosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av ryggmargstranseksjon
Strukturelle og funksjonelle undersøkelser ble utført for å vurdere om protokollen tillater en fullstendig ryggmargstranseksjon.

For det første, for å bekrefte at tapet i fluorescens på lesjonsstedet skyldtes nevronal vevsskade og ikke fluorescens fotobleking fra laserbelysningen, ble det utført immunostaining ved hjelp av et antistoff mot acetylert tubulin (se Tabell over materialer og tilleggsfil 1). En fullstendig forstyrrelse av aksonene mellom kaudale og rostrale sider av lesjonen ble observert, noe som bekrefter fullstendig transeksjon av ryggmargen (figur 4B). En vellykket ryggmargstranseksjon bør ikke etterlate gjenværende nevronal projeksjon over lesjonsstedet (se figur 4C for et eksempel på en mislykket lesjon). Ved hjelp av denne teknikken ble suksessraten for laserlesjoner i ryggmargen anslått til å være 75% (fire ufullstendige transeksjoner hos 16 dyr).

Tap av funksjonalitet etter laserlesjon ble undersøkt ved hjelp av kalsiumavbildning. På intakt fisk genererer den spontane koordinerte nevronnettverksaktiviteten fluorescenstopper langs hele ryggmargen. En vellykket transeksjon ville avbryte forplantningen av denne aktiviteten mellom begge sider av lesjonen. For å kontrollere kvaliteten på ryggmargstranseksjonen ble laserlesjoner utført på tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larver ved 3 dpf. Etter samling i en ny multi-brønn plate ble larver mildt bedøvet. De ble montert på en glassdekslelip i lavsmeltende punkt agarose for å utføre fluorescens tidsforløp opptak på et konfokalt mikroskop fra 3 timer etter skade. Det ble observert tap av aktivitet på kaudal side av lesjonsstedet. Faktisk viser kvantifiseringen av fluorescens at pigger på grunn av fiskens spontane aktivitet bare var til stede på rostralsiden etter skade, men skjedde på en koordinert måte i tilsvarende rostral- og kaudale posisjoner i intakt fisk (figur 4D,E). Det lave restsignalet på kaudalsiden etter skade var sannsynligvis på grunn av aktiviteten til sensoriske nevroner (sannsynligvis Rohon-Beard sensoriske nevroner på kaudalsiden av ryggmargen23) som reaksjon på halebevegelsen indusert av muskelkontraksjon på rostralsiden.

Regenereringsprosesser indusert av laserlesjoner
Etter 24 timer etter skade (hpi) begynte såret å lukke seg, noe som førte til en delvis restaurering av ryggmargens opprinnelige struktur etter 48 timer (figur 5D). Ved hjelp av kalsiumavbildning ble en delvis funksjonell gjenkobling bekreftet (figur 5E,F) etter 48 hk. Beregningen av forholdet (kalt Connectivity Restoration Index av forfatterne) mellom amplituden til piggene i kaudalområdet og rostralområdet (figur 5G), viste en økning mellom 3, 24 og 48 hk, som forventet under regenerering av ryggmargen.

Laserlesjoner utløser en immunrespons
Makrofag (mpeg1:GFP + celler) rekruttering ble observert etter laser lesjoner ved hjelp av tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) larver laser lesjoner (Figur 5H, I). Dette er i samsvar med tidligere studier av forfatterne ved hjelp av manuelle lesjoner som demonstrerer makrofagenes essensielle rolle for vellykket regenerering av ryggmargen i sebrafisk larver6,24. Denne observasjonen indikerer at immunreaksjoner kan studeres etter laserskade og bekrefter at vevsskade oppstod.

Laserlesjoner og manuelle lesjoner utløser økt nevrogenese i ryggmargen
Tidligere studier har brukt manuelle lesjoner for å studere nevrogenesen som oppstår etter en ryggmargsskade6,15. Laserlesjoner kan være et verdifullt verktøy for å studere dette fenomenet. Et tidligere publisert eksperiment viste økt nevrogenese etter en manuell ryggmargsskade sammenlignet med uleselige kontroller15. Her ble tg(mnx1:gfp) fisk brukt som motoriske nevroner og ble fluorescerende merket. Anti-GFP antistofffarging ble brukt til å forbedre synligheten av GFP i larver. Dette ble kombinert med EdU-farging25 (se Tilleggsfil 1), som merker nygenererte nevroner. EdU ble lagt til umiddelbart etter en skade på 3 dpf, noe som betyr at celler merket med EdU ble generert etter skade. Derfor representerer celler som viser kolokalisert farging nye motoriske nevroner som er født etter ryggmargsskade. Antall colokaliserte celler på hver side av skadestedet, eller i et område som tilsvarer plasseringen og størrelsen på skadestedet i uleselagte kontroller (fanget i to 50 μm vinduer) ble talt, og forskjellen i gjennomsnittlig antall colokaliserte celler ble analysert ved hjelp av en enveis ANOVA26.

Denne protokollen ble brukt på manuelt og laserlesjonerte larver for å sammenligne effekten av hver lesjonsmetode på nevrogenese (figur 6). Det ble ikke observert noen forskjell i antall merkede celler mellom manuelle og laserskader. Unlesioned fisk viste færre dobbeltmerkede celler enn lesjonert fisk under begge lesjonsforholdene (figur 6D). Dette samsvarer med tidligere funn som viser økt nevrogenese i manuelt lesjonert fisk sammenlignet med unlesioned fish15.

Disse resultatene støtter kalsiumavbildning og acetylerte tubulinfargingsresultater, da laserskaden fremkaller en regenereringsrespons som kan sammenlignes med en manuell lesjon. Dette indikerer at laserlesjonen ikke bare bleker fluorescensen i cellene, men resulterer i en skade som utløser de samme cellulære responsene som en manuell lesjon gjør.

Laserlesjoner resulterer i mindre hud- og muskelskader enn manuelle lesjoner
Manuelle lesjoner resulterer ofte i store mengder muskel- og hudskader. I motsetning kan laserlesjoner målrettes mer spesifikt mot ryggmargen, noe som reduserer skaden på andre vev. For å illustrere dette ble Tg(beta-actin:utrophin-mCh) larver brukt til å utføre manuelle og laserskader. Denne linjen merker fluorescerende et F-aktinbindende protein, slik at visualisering av ryggmargsceller og muskelfibre. Larvene ble deretter levende montert og avbildet (figur 7A,B). Figur 7A viser skadene på ryggmargen. Mangelen på utrophin på skadestedet i både laser og manuell lesjonsforhold tyder på at begge lesjonsmetodene har skadet cellene i ryggmargen. Figur 7B viser muskelskaden. Det er en klar chevron-lignende struktur til myotomene i unlesioned tilstand, og bunter av aktinfibre er synlige. Det er en synlig forstyrrelse av myotopformen i den manuelle lesjonstilstanden, og færre aktinfibre er til stede. Dette viser betydelig muskelskade. Men i laserlesjonstilstanden opprettholdes vinkelstrukturen til myotomet. Det er noen skader på muskelfibre, men dette er inneholdt i en eller to myotomer sammenlignet med innen fire i manuell lesjonstilstand. I tillegg er det mindre hudskader i laserlesjonstilstanden sammenlignet med den manuelle lesjonstilstanden, som vist på bilder tatt på et stereomikroskop i figur 7C.

Til sammen viser disse resultatene at reproduserbare, halvautomatiske laserlesjoner har potensial til å være et kraftig verktøy for å studere nevral regenerering i sebrafisk.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for den halvautomatiske arbeidsflyten for laserskade. Tre dager etter befruktning (dpf), blir larver lastet inn i en 96-brønns plate og plassert på den automatiserte larverhåndteringsplattformen. Deretter lastes hver larve inn i en kapillær plassert under en 10x NA 0,5 linse på et oppreist mikroskop for avbildning og laserlesjon. Etter lesjoner blir larver losset til en ny 96-brønns plate for innsamling og videre eksperimenter. På toppen, overførte og fluorescens bilder av tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver før og etter laser lesjon (skala bar = 50 μm). Larver er orientert rostral venstre og dorsal opp (for alle figurer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oppstart av programvare for det halvautomatiske zebrafish larver bildesystemet og laserkontrollsystemet. (A) VAST programvare ved oppstart. (B) Hovedvinduet i VAST-programvaren viser den tomme kapillæren. (C) LP Sampler vindu med en tom plate mal. (D) Visningen av python IDE med Watch_for_ROIs_py3.py skript som kjører. Det oransje rektangelet peker på terminalfanen med meldinger som vises under initialiseringen av laserdemperen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på laserlesjonssekvens på tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf larver. (A) Det første trinnet i laserlesjonen ved hjelp av en 20 μm linje etter å ha valgt linje-ROI-verktøyet fra ImageJ-verktøylinjen. (B) Andre trinn med en 80 μm linje for fullstendig transeksjon av ryggmargen. (C) Visning av skriptet som brukes til å kontrollere laseren fra ImageJ. (D) Sekvensen av bilder under laserskader. Topp: før lesjon; Midten: umiddelbart etter det første trinnet; Bunn: umiddelbart etter det andre trinnet (skalastang = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Acetylert tubulinimmunisering (A-C) og kalsiumavbildning (D,E) indikerer at laserlesjon helt forstyrrer kontinuiteten i ryggvevet. (B) Fullstendig transeksjon av ryggraden som viser en fullstendig forstyrrelse av ryggmargsvevet langs både dorsal-ventral og medial-lateral akser. (C) Ufullstendig transeksjon. (skalastang = 50 μm). (D) Transektert ryggmarg på en tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf larve. Rektanglene viser ROIene som brukes til å kvantifisere fluorescensintensiteten i lesjonens rostrale (blå) og kaudale (oransje) sider. (E) Graf over fluorescensintensiteten endres over tid i ROIene for rostral- og kaudalanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Laserskade fremkaller en immunrespons og fører til vellykket anatomisk og funksjonell gjenoppretting. (A-D) Maksimal intensitetsprojeksjon fluorescensbilder av en tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf larve før (A) og på forskjellige tidspunkter etter laserlesjonen: etter 3 timer (B), etter 24 timer (C), og etter 48 timer (D). (E-G) Bruk av kalsiumavbildning for å vurdere funksjonsrestaurering. (E) Leioned tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) larve med analyse ROIer. (F) Graf over fluorescensintensiteten endres over tid i ROIene for rostral- og kaudalanalyse. (G) Kvantifisering av forholdet mellom kaudale og rostrale piggamplituder (Connectivity Restoration Index) ved 3, 24, 48 t etter lesjon (N = 3). (H-I) Karakterisering av immunresponsen etter lesjon. (H) Fluorescensbilder av unlesioned (venstre) og lesjonert (høyre) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp larve som viser akkumulering av makrofager (mpeg1 + celle, grønn) ved 6 hpi. (I) Kvantifisering av antall makrofager ved 6 timers postlesjon i skadede og intakte larver (N = 3) (skalastenger = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lesjonsindusert generering av motoriske nevroner kan sammenlignes mellom laser og manuell lesjon. (A-C) Bilder fra ApoTome-mikroskopet av tg(mnx1:gfp) 5 dpf larver med EdU-farging, i laserlesjon (A), manuell lesjon (B) og uleselagte (C) forhold. Pilspisser angir celler som er merket med dobbelt merket for begge merkene. Skalalinje = 100 μm. (A'-C') Høyere forstørrelse av dobbeltmerkede celler merket med hvite bokser. (D) Kvantifisering av celleantall for antall colokaliserte celler i hver larve. 50 μm vinduer ble plassert på hver side av skadestedet, og colokaliserte celler ble telt i alle Z-stack-bilder. Enveis ANOVA ble utført med Tukeys posthoc test27. Ingen signifikant forskjell mellom laser og manuelle lesjoner (p = 0,909). Signifikant færre mnx1:gfp+/EdU+-celler i uleselagte kontroller sammenlignet med laserlesjon (2,4 ganger forandring, p = 0,011) og manuell lesjon (2,3 ganger forandring, p = 0,018). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Laserlesjon induserer mindre muskel- og hudskader enn den manuelle lesjonen. (A-B) Single Z-stack bilder av tg (beta-actin:utrophin-mCherry) 3 dpf larver i unlesioned, manuell lesjon og laser lesjon forhold, tatt på konfokal mikroskop ved 20x forstørrelse. Hvite piler betegner skadestedet. Skalastang = 50 μm. (A) betegner Z-stabler der ryggmargen og hakkeordet er synlige. SC merker ryggmargen, og NC merker notokordet. (B) betegner Z-stabler der muskelfibrene er synlige. (C) Bilder ble tatt på stereomikroskopet til 3 dpf larver i de uleselagte, manuelle lesjonene og laserlesjonsforholdene. Larver ble festet til en plattform ved hjelp av wolframtrådpinner (synlig i laserlesjonsbilde). Den svarte boksen betegner lesjonsstedet. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: De eksperimentelle detaljene i protokollen. Genereringen av de transgene sebrafisklinjene, manuelle ryggmargsskader, acetylert-tubulinimmunohistokjemi, Hb9/EdU-farging, avbildning og bildebehandling og analyse er beskrevet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er et presserende behov for en dypere forståelse av prosessene som spilles under regenerering i sebrafisk. Denne dyremodellen gir mange fordeler for biomedisinsk forskning, spesielt for ryggmargsskader1. De fleste studiene involverer manuelle lesjoner som krever en godt trent operatør og induserer multivevsskader. En laserlesjonsprotokoll presenteres her, slik at kontroll over lesjonsegenskapene og redusert skade på det omkringliggende vevet. Videre er denne teknikken lett nok til å kunne brukes av relativt utrente eksperimenter.

Kritiske trinn i protokollen er kalibreringen av laseren og definisjonen av ROIer. I praksis er kalibreringen veldig stabil (selv i flere måneder), og når riktig størrelse og posisjon av avkastningen er bestemt, er bruken av denne teknikken grei. Selv om protokollen beskrev hvordan man utfører lesjonene på spesifikt utstyr, er de fleste fordelene med laserlesjoner tilgjengelige for forskjellige systemer, for eksempel et spinnende diskmikroskop.

Hovedbegrensningene i denne protokollen er behovet for å bruke en fluorescensreporter av ryggmargen og tiden som kreves for å utføre lesjonene (~ 5 min / fisk). Sistnevnte kompenseres av høy reproduserbarhet som krever færre dyr. Imidlertid er manuelle lesjoner fortsatt levedyktige for applikasjoner som legemiddeltesting, hvor mange lesjonerte dyr er nødvendig. Som vist her, er omfanget av lesjonsindusert nevrogenese sammenlignbar mellom laser og manuelle lesjoner.

Laserskade har imidlertid enorme potensielle applikasjoner, noen av dem relatert til de unike fordelene som tilbys. For eksempel tillater en roterende kapillær å utføre lesjoner i et stort utvalg av stillinger på en kontrollert måte. For eksempel kan den brukes til å indusere enkel nevrontoktomi i Mauthner-celler (data ikke vist), som også har blitt demonstrert i arbeidet til Bhatt et al.15. Dette ville ikke være mulig ved hjelp av manuelle lesjoner.

Resultatene viser også at skaden hovedsakelig er inneholdt i ryggmargen, med minimal skade på omkringliggende vev. Dette kan bety at cellulære responser sett etter en laserlesjon er mer sannsynlig å bli tilskrevet ryggmargen spesielt i stedet for å signalisere fra andre skadede vev. Det kan også bety at laserlesjonede larver er mer i stand til å motstå ytterligere preparater for eksperimenter. For eksempel innebærer disseksjon for elektrofysiologi å fjerne trunkhuden ved hjelp av tang28,29,30, noe som vil resultere i høyt mekanisk trykk plassert på det allerede delikate skadestedet og risikere at eventuelle axonale tilkoblinger brytes igjen. Integriteten til hud og muskelvev sett i laser-lesjonerte larver kan beskytte lesjonsstedet mot ytterligere skade og resultere i en mer nøyaktig representasjon av nivået av regenerering oppnådd.

Videre begrenser den forbedrede lokaliseringen av skade etter laserskade utvidelsen av koblingen mellom forskjellige regenereringsprosesser, noe som kan maskere mer subtile prosesser ved bruk av manuelle lesjoner. Tilnærmingen til eksperimentell skade i larvalsebrafisken som er beskrevet her, kan åpne en rekke nye undersøkelser i sammenheng med kvantitativ biologi, biologisk fysikk og beregningsbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av BBSRC (BB/S0001778/1). CR er finansiert av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi takker David Greenald (CRH, University of Edinburgh) og Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) for den slags gave av transgen fisk (Se Supplementary File). Vi takker Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) for den vennlige tilgangen til 3i spinning-disk confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Tags

Medisin utgave 177

Erratum

Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Kontrollerte halvautomatiske laserinduserte skader for å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter