Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.
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Articolo metodologico
Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Le larve di zebrafish possiedono un sistema nervoso centrale (SNC) completamente funzionale con un'elevata capacità rigenerativa solo pochi giorni dopo la fecondazione. Questo rende questo modello animale molto utile per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo standard per indurre tali lesioni è quello di transettare manualmente la parte dorsale del tronco. Tuttavia, questa tecnica richiede un ampio allenamento e danneggia i tessuti aggiuntivi. È stato sviluppato un protocollo per le lesioni indotte dal laser per aggirare queste limitazioni, consentendo un'elevata riproducibilità e completezza della transezione del midollo spinale su molti animali e tra diverse sessioni, anche per un operatore non addestrato. Inoltre, il danno tissutale è principalmente limitato al midollo spinale stesso, riducendo gli effetti confondenti derivanti dalla lesione di diversi tessuti, ad esempio pelle, muscoli e SNC. Inoltre, sono possibili emi-lesioni del midollo spinale. Una migliore conservazione dell'integrità dei tessuti dopo una lesione laser facilita ulteriori dissezioni necessarie per ulteriori analisi, come l'elettrofisiologia. Quindi, questo metodo offre un controllo preciso dell'entità della lesione che è irraggiungibile manualmente. Ciò consente nuovi paradigmi sperimentali in questo potente modello in futuro.
Introduzione
A differenza dei mammiferi, il pesce zebra (Danio rerio) può riparare il loro sistema nervoso centrale (SNC) dopo un infortunio1. L'uso di larve di zebrafish come modello per la rigenerazione del midollo spinale è relativamente recente. Si è dimostrato utile studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione2. Ciò è dovuto alla facilità di manipolazione, al breve ciclo sperimentale (nuove larve ogni settimana), alla trasparenza ottica dei tessuti e alle piccole dimensioni delle larve, ideali per la microscopia a fluorescenza in vivo .
Nel caso della rige....
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Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Ministero degli Interni del Regno Unito e secondo i suoi regolamenti, sotto la licenza di progetto PP8160052. Il progetto è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Edimburgo. Per le analisi sperimentali, sono state utilizzate larve di zebrafish fino a 5 giorni di entrambi i sessi delle seguenti linee transgeniche disponibili: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) e Tg (mnx1: gfp) (vedi File supplementare 1 relativo alla generazione delle linee transgen....
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Risultati
Validazione della transezione del midollo spinale
Sono state eseguite indagini strutturali e funzionali per valutare se il protocollo consente una completa traslazione del midollo spinale.
In primo luogo, per verificare che la perdita di fluorescenza nel sito della lesione fosse dovuta al danno del tessuto neuronale e non alla fotosbiancamento a fluorescenza dall'illuminazione laser, è stata eseguita l'immunocolorazione utilizzando un anticorpo contro la tubulina acetilata .......
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Discussione
C'è un urgente bisogno di una comprensione più profonda dei processi in gioco durante la rigenerazione nel pesce zebra. Questo modello animale offre molti vantaggi per la ricerca biomedica, in particolare per le lesioni del midollo spinale1. La maggior parte degli studi riguarda lesioni manuali che richiedono un operatore ben addestrato e inducono danni multi-tessuto. Qui viene presentato un protocollo di lesione laser, che consente il controllo delle caratteristiche della lesione e la riduzione d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal BBSRC (BB/S0001778/1). CR è finanziato dal Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Ringraziamo David Greenald (CRH, Università di Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Università di Edimburgo) per il gentile dono del pesce transgenico (Vedi file supplementare). Ringraziamo Daniel Soong (CRH, Università di Edimburgo) per il gentile accesso alla confocale a disco rotante 3i.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software | |||
| Software per microscopio Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Microsoft | |||
| Microscopio e accessori | |||
| ApoTome | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) lente a immersione | Carl Zeiss | ||
| doppia AxioCam 506 m telecamere CCD | Carl Zeiss Microscopio confocale a scansione laser Carl Zeiss | ||
| LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Modulo disco rotante CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Microscopio verticaleAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| Laser UV | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Piastra di Petri | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Kit di imaging Click-It EdU | Invitrogen | C10637 | |
| acido aminobenzoico-etil metil-estere (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Anticorpi | |||
| Donkey anti-pollo Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Asino anti-topo Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Topo anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Topo anticorpo acetilato anti-tubulina | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Stabilito da David Greenhald, Università di Edimburgo | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A Descritto | per la prima volta in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | Descritto per la prima volta in [Peri e Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP) | N/A | Stabilito da Katy Reid, Università di Edimburgo | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Istituito da David Greenhald, Università di Edimburgo |
Riferimenti
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
