ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
本方案描述了一种使用激光损伤系统结合用于幼体处理的自动微流体平台在斑马鱼幼体中诱导组织特异性和高度可重复损伤的方法。
Abstract
斑马鱼幼虫在受精后仅几天就具有功能齐全的中枢神经系统（CNS），具有很高的再生能力。这使得这个动物模型对于研究脊髓损伤和再生非常有用。诱导此类病变的标准方案是手动横切躯干的背侧部分。然而，这种技术需要广泛的训练并损害额外的组织。为激光诱导的病变开发了一种方案，以规避这些限制，允许许多动物和不同会话之间的脊髓切除具有高可重复性和完整性，即使对于未经培训的操作员也是如此。此外，组织损伤主要局限于脊髓本身，减少了损伤不同组织（例如皮肤，肌肉和中枢神经系统）的混杂效应。此外，脊髓的半病变是可能的。改善激光损伤后组织完整性的保留有助于进一步解剖其他分析所需的进一步解剖，例如电生理学。因此，这种方法可以精确控制手动无法实现的伤害程度。这允许将来在这个强大的模型中出现新的实验范式。
Introduction
与哺乳动物相比，斑马鱼（Danio rerio）可以在受伤后修复中枢神经系统（CNS）1。使用斑马鱼幼虫作为脊髓再生的模型是相对较新的。事实证明，研究修复背后的细胞和分子机制很有价值2。这是由于易于操作，实验周期短（每周有新的幼虫），组织的光学透明度和幼虫的小尺寸，非常适合 体内 荧光显微镜检查。
在脊髓再生的情况下，使用幼虫的另外两个优点是恢复速度，与成人几周相比，几天，以及使用手动技术诱导损伤的容易程度。这已成功用于许多研究3，4，5，包括最近的调查6，7。总体而言，这导致有意义的数据生产增加，实验方案的高适应性以及实验成本的降低。在受精后5天内使用幼虫也减少了动物研究中遵循3R原则的动物的使用8。
斑马鱼幼虫脊髓损伤后，会发生许多生物过程，包括炎症反应、细胞增殖、神经发生、存活或新生成细胞的迁移、功能轴突的重整以及神经过程回路和脊柱组织的全局重塑6，7，9，10.为了成功编排，这些过程涉及一系列细胞类型，细胞外基质成分和生化信号之间的精细调节相互作用11，12。解开脊髓等复杂组织这种重大重组的细节需要使用和开发精确和受控的实验方法。
用于研究斑马鱼脊髓再生的主要实验范例是使用手术手段通过切除，刺伤或冷冻损伤诱导组织损伤3，13。这些方法的缺点是需要对显微外科技能进行特定培训，这对于任何新操作员来说都是耗时的，并且可能会阻止它们在短期项目中使用。此外，它们通常会对周围组织造成损害，这可能会影响再生。
另一种方法是化学诱导细胞损伤14 或通过遗传操作15。后者允许高度针对性的伤害。然而，这种技术需要长时间的准备工作来产生新的转基因鱼，然后再进行任何实验，每次靶向独特的细胞类型时都要更新。
因此，需要一种方法，允许适合各种再生研究中的靶向但多功能的病变。解决方案是使用激光在感兴趣的组织中诱导局部损伤16，17，18，19，20。事实上，使用激光诱导的组织损伤为产生脊髓病变提供了一种具有许多优点的可靠方法。配备这种激光操作模块的显微镜允许指定将发生细胞消融的定制形状区域，并具有时间控制的额外好处。因此，可以调整病变的大小和位置以解决任何问题。
大多数激光病变系统缺少的特征是有可能以高度可重复的方式诱导一系列幼虫的损伤。本文描述了一种原始方案，使用紫外激光，基于专为自动幼虫处理而设计的微流体平台，在斑马鱼幼虫中诱导半自动精确和受控的病变21。此外，在这里介绍的系统中，幼虫入玻璃毛细管中，这允许动物围绕其尾部轴自由旋转。用户可以选择将幼虫的哪一侧呈现给激光，同时允许荧光成像精确地瞄准激光束并评估病变后的损伤。
这里描述的协议与半自动斑马鱼幼体成像系统结合使用，并结合配备UV激光的旋转盘（以下指定为VAST系统）。然而，该协议的要点和该技术的大多数权利要求对于任何配备能够进行细胞烧蚀的激光的系统都是有效的，包括双光子激光扫描显微镜，带有紫外激光的旋转盘显微镜（FRAP模块），或带有激光模块的视频显微镜用于光操作。VAST系统与传统样品处理之间的主要区别之一是，对于后者，需要将幼虫安装在玻璃盖玻片/玻璃底培养皿上的低熔点琼脂糖中，而不是将它们装载在96孔板中。
这种方法提供的好处为再生过程中细胞和分子机制的创新研究提供了机会。此外，高数据质量允许在多学科背景下进行定量调查。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物研究均在英国内政部的批准下进行，并根据其规定，根据项目许可证PP8160052进行。该项目得到了爱丁堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。对于实验分析，使用以下可用的转基因品系，使用5日龄以下的斑马鱼幼虫：Tg（Xla.Tubb：DsRed;mpeg1：GFP），Tg（Xla.Tubb：DsRed），Tg（betaactin：utrophin-mCherry），Tg（Xla.Tubb：GCaMP6s）和Tg（mnx1：gfp）（参见关于转基因斑马鱼系生成的 补充文件1 ）。使用自动斑马鱼幼虫处理平台的协议示意图如图 1所示。这项工作中使用的所有自定义软件，脚本和详细的实验协议都可以在 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 上找到。
1. 样品制备
- 在受精后5小时，对胚胎进行分类，以达到正确的发育阶段21。丢弃死卵和发育不良和过度发育的胚胎。
- 在受精后3天（dpf），通过在90毫米培养皿中将2mL0.4%氨基苯甲酸乙基甲酯加入50mL鱼类设施水中来麻醉幼虫。使用用苯硫脲（PTU）饲养的动物（见 材料表）以防止皮肤色素沉着，如果这是一个问题，则不是本方案中描述的3 dpf幼虫脊髓损伤的情况。
注意：这种相对较高的麻醉浓度用于防止幼虫在激光撞击后移动。 - 筛选胚胎的荧光报告基因表达（补充文件1）。
注意：通常需要脊髓（或其他感兴趣的结构）的荧光报告器来评估损伤的效率。使用tg（Xla.Tubb：DsRed）有助于识别脊髓。 - 将选定的幼虫转移到96孔板中，用于VAST系统（见 材料表），每孔含300μL鱼类设施水。直接使用含有90毫米培养皿中麻醉剂的培养基。确保每孔只有一个幼虫。准备一个额外的空96孔板来收集病变的幼虫。
注意：如果使用其他激光病变系统，请将幼虫安装在适当的观察室中，将幼虫安装在1%低熔点（LMP）琼脂糖凝胶中。
2. 显微镜制备
- 打开所有系统组件（VAST、显微镜、激光器、PC），包括用于烧蚀的激光器。
- 一旦硬件完全初始化，启动显微镜软件，ImageJ / Fiji，python集成开发环境（IDE）和自动斑马鱼成像（VAST系统）软件（如果使用此平台）（参见 材料表）。
- 请按照以下步骤设置 VAST 软件。
- 当 VAST 软件启动时，在第一个窗口中选择 Plate ，然后单击“ 完成 ”按钮（图 2A）。将弹出另一个小窗口，询问毛细管是否空且干净。通过查看毛细管的图像来验证内部是否有任何气泡。如果没有，请单击“ 是”。如果有任何气泡，请单击“ 否 ”，然后按照步骤2.3.2-2.3.3（图2B）操作。
- 在“大粒子（LP）采样器”窗口中，单击“ Prime ”以去除气泡（图2C）。
- 转到主软件窗口（带有毛细管图像），然后右键单击图像。在弹出菜单上选择“ 录制空毛细管图像 ”（图2B）。
- 在 “LP 采样器 ”窗口中，转到“ 文件 ”菜单，然后选择“ 打开脚本” 选项。选择包含与要执行的实验对应的脚本的文件。
- 在 VAST 软件主窗口中，转到 文件 ，然后选择 打开实验。选择与计划的实验对应的实验文件。
注意：确保未选中“自动卸载”和“批量输出到浪费”框。
- 设置用于成像的显微镜软件。
- 启动显微镜成像软件（见 材料表）以初始化硬件。这可能需要几分钟时间，具体取决于系统。
- 转到采集设置并设置显微镜以对幼虫中表达的荧光团进行成像。使用10x NA 0.5浸水物镜，以确保焦点体积沿光轴足够细长，以损伤脊髓或目标组织的整个深度。
- 设置 ImageJ/斐济用于激光病变。
- 转到“ 文件 ”菜单，选择“ 新建/脚本” 以打开脚本窗口。
- 在“ 新建 ”窗口中，转到“ 文件 ”菜单，然后选择“ 打开” 以加载激光病变脚本 （Manual_MP_Operation.ijm）。
- 设置 Python IDE。
- 启动 Python IDE。
- 转到“ 文件 ”菜单，然后选择 “打开文件” 以加载脚本以管理激光（Watch_for_ROIs_py3.py）。
- 转到“ 运行 ”菜单，然后选择“ 运行而不调试” 以运行脚本。检查以确保在激光衰减器初始化时终端面板中出现一系列消息以及一些噪音（图2D）。
3. 在 VAST 系统上执行激光病变
- 通过单击 VAST 软件主窗口上的箭头按钮移动载物台，使毛细管相对于显微镜物镜居中（图 2B）。
- 通过目镜观察并使用显微镜的透射光，聚焦在毛细管的顶部。
注意：毛细血管非常脆弱，如果被物镜触摸，可能会破裂。在进焦和调出时缓慢移动显微镜旋钮。 - 将 96 孔板放在 VAST 系统的 LP 采样器的板架上。将装有幼虫的板放在左侧支架上，将用于收集的板放在右侧。确保板的正确方向：A1 孔必须位于支架的左前角。
- 在 VAST 软件的 LP 取样器窗口中，单击“ 平板模板 ”按钮，然后选择所有包含幼虫的孔。单击 OK 按钮验证并关闭窗口（图 2C）。
- 在LP采样器窗口中，单击“ 运行板 ”按钮开始加载幼虫。
注意：一段时间后，幼虫应该在毛细血管中的位置可见（在实验定义文件中预定义），从而允许损伤脊髓。VAST托盘灯将在旋转几次后关闭，以将幼虫设置为横向朝向显微镜物镜。 - 转到显微镜软件，然后单击“ 实时 ”按钮对幼虫进行成像。
- 转动显微镜聚焦旋钮，直到脊髓中央管可见。
注意：首先使用透射光进行聚焦，然后使用荧光进行优化可以更容易。 - 在荧光中拍摄快照并将图像保存到专用文件夹中。
- 在 ImageJ 中打开图像并根据需要调整对比度（使用 ImageJ 中的“图像/调整/亮度/对比度...”菜单）。
- 单击 感兴趣区域（ROI） 线工具，画一条以脊髓为中心的短线（20μm）（图3A）。
- 将显微镜切换到100%反射镜位置。
- 加载 ImageJ 脚本，然后单击“ 运行 ”按钮。使用以下参数：重复 - 2;样品 - 1;宽度 - 40微米;衰减 - 89（全激光功率）（图3C）。
- 激光拍摄序列完成后，在成像软件上切换到荧光成像，并根据需要调整焦点。
注意：由于激光曝光期间的尾部位移，经常观察到焦点偏移。 - 拍摄新快照并保存。
- 在ImageJ中打开这个新图像，画一条应该大于脊髓本身（~80μm）的新线，从脊髓上部脊髓腹侧下方开始，向背侧延伸，在脊髓和皮肤之间的空间结束（图3B）。
- 将显微镜切换到100%反射镜位置。
- 转到 ImageJ 脚本窗口，然后单击“ 运行 ”按钮。使用以下参数：重复 - 2;样品 - 1;宽度 - 40微米;衰减 - 89（全激光功率）。
- （较长）激光拍摄序列完成后，通过成像荧光和聚焦来验证横切质量。确保病变部位没有细胞或轴突保持完整，应显示为深色或微弱且均匀的荧光区域（图3D，底图）。
- 将病变幼虫收集到空的96孔板中（具有与原始孔相同的孔坐标），方法是转到VAST主软件窗口并单击“ 收集 ”按钮。
- 通过单击窗口左下角的 托盘灯 复选框切换回 VAST 系统指示灯。
- 对每个受伤的新幼虫重复步骤3.3-3.17。
4. 病灶后处理和附加实验
- 尽快从96孔板中取出幼虫，并将它们转移到带有新鲜鱼类设施水的清洁培养皿中，以使幼虫在病变后恢复。将培养皿放入28°C的培养箱中。
注意：损伤通常在病变后的第一个小时内继续传播。因此，应在延迟约 1 小时后通过荧光成像评估病变的实际范围。
5. 故障排除
- 如果 VAST 系统的试管和毛细管中存在气泡，请单击 LP 采样器窗口中的“ 常用 ”按钮将其移除。
- 考虑不成功的病变（根据病变部位的剩余荧光评估，除了预期的残留和均质背景），这可能是由于下面提到的几个原因。
- 低激光功率：发生这种情况时，请尝试使用更高的值。
注：VAST 系统配备了染料激光器。这意味着用于激光生成的染料溶液的浓度会随时间而变化，从而导致激光功率的降低。用新的解决方案替换通常可以解决问题22。 - 校准不良：发生这种情况时，请按照步骤5.2.2.1-5.2.2.4验证激光系统的校准和功率。如果校准不正确，激光将无法定向到所需位置，从而导致相邻组织中不成功的病变或不希望的损伤。
- 将镜面载玻片放在毛细管室的顶部。将焦点放在涂层面（应面向物镜）。在幻灯片中使用上一个默认值可更轻松地获得焦点。
- 使用校准脚本应用激光烧蚀图案。
- 评估模式的质量。斑点或线条应显得清晰且不模糊。
- 使用功率增加的斜坡来评估激光功率与以前的会话相比是否发生了变化。
- 病变期间幼虫运动：幼虫对麻醉的反应不同;因此，激光病变可能在此过程中触发尾部的运动，从而阻止成功的横切。发生这种情况时，对激光病变步骤进行额外的迭代以完成它，同时仍然避免对周围组织的损害。
- 注意力不集中：当发生这种情况时，将注意力集中在中央运河的中间以获得最佳效果。
- ROI 绘图、位置和尺寸：ROI 的位置和大小对于成功进行横切至关重要。ROI应大于脊髓，并以脊髓中心为中心。为了解决这个问题，开始从脊髓的腹侧吸取ROI，然后向上朝背侧移动以获得成功的横断。这可能是由于烧蚀过程中激光射击序列触发的尾部运动。
- 低激光功率：发生这种情况时，请尝试使用更高的值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
脊髓横断的验证
进行结构和功能检查以评估方案是否允许完整的脊髓横断。
首先，为了验证病变部位的荧光损失是由于神经元组织损伤而不是激光照射的荧光光漂白引起的，使用针对乙酰化微管蛋白的抗体进行免疫染色（见 材料表 和 补充文件1）。观察到病变的尾侧和喙侧之间的轴突完全断裂，证实了脊髓的完全横断（图4B）。成功的脊髓横切术不应在病变部位留下任何剩余的神经元投射（不成功病变的示例见 图4C ）。使用这种技术，脊髓激光病变的成功率估计为75%（16只动物的四次不完全横断）。
使用钙成像检查激光病变后的功能丧失。在完整的鱼上，自发的协调神经元网络活动沿着整个脊髓产生荧光峰。成功的横切将中断该活性在病变两侧之间的传播。为了控制脊髓横断的质量，在3 dpf的tg（Xla.Tubb：GCaMP6s）幼虫上进行激光病变。在新的多孔板中收集后，对幼虫进行轻度麻醉。它们被安装在低熔点琼脂糖的玻璃盖玻片上，从受伤后3小时开始在共聚焦显微镜上进行荧光延时记录。观察到病变部位尾侧的活动丧失。事实上，荧光的量化表明，由于鱼的自发活动引起的尖峰仅在受伤后存在于喙侧，但在完整鱼的等效喙和尾部位置以协调的方式发生（图4D，E）。损伤后尾侧的低残余信号可能是由于感觉神经元（可能是脊髓尾侧的Rohon-Beard感觉神经元23）的活动对由喙侧肌肉收缩引起的尾部运动的反应。
激光病变诱导的再生过程
受伤后24小时（hpi）后，伤口开始闭合，导致48小时后脊髓初始结构的部分恢复（图5D）。使用钙成像，在48 hpi后确认部分功能重新连接（图5E，F）。尾部区域和喙部区域尖峰振幅之间的比率（作者命名为连接恢复指数）的计算（图5G）显示，在脊髓再生期间，预期在3，24和48 hpi之间增加。
激光病变触发免疫反应
使用tg（Xla.Tubb：DsRed;mpeg1：GFP）幼虫激光病变（图5H，I）在激光病变后观察到巨噬细胞（mpeg1：GFP +细胞）募集。这与作者先前使用手动病变的研究一致，这些研究证明了巨噬细胞对斑马鱼幼虫脊髓成功再生的重要作用6，24。这一观察结果表明，可以在激光损伤后研究免疫反应，并证实发生了组织损伤。
激光病变和手部病变触发脊髓神经发生增加
以前的研究已经使用手动病变来研究脊髓损伤后发生的神经发生6，15。激光病变可能是研究这种现象的宝贵工具。先前发表的一项实验显示，与未使用对照组相比，手动脊髓损伤后的神经发生增加15。在这里，tg（mnx1：gfp）鱼被用作运动神经元并被荧光标记。抗GFP抗体染色用于提高幼虫中GFP的能见度。这与EdU染色25 （参见 补充文件1）相结合，其标记新生成的神经元。在3 dpf下受伤后立即添加EdU，这意味着任何标有EdU的细胞都是在受伤后产生的。因此，显示共定位染色的细胞代表了脊髓损伤后出生的新运动神经元。计数损伤部位两侧或与损伤部位的位置和大小相对应的区域中的共定位细胞数量，除非对照（在两个50μm窗口中捕获），并使用单因素方差分析26分析共定位细胞平均数的差异。
该协议用于手动和激光病变幼虫，以比较每种病变方法对神经发生的影响（图6）。在手动和激光病变之间的标记细胞数量上没有观察到差异。除非在两种病变条件下，双标记鱼比病变鱼显示的双标记细胞少（图6D）。这与先前的发现一致，这些发现显示，与未被遮挡的鱼相比，手动损伤的鱼的神经发生增加15。
这些结果支持钙成像和乙酰化微管染色结果，因为激光损伤引起的再生反应与手动病变相当。这表明激光病变不仅仅是漂白细胞中的荧光，而是导致损伤，引发与手动病变相同的细胞反应。
激光病变导致的皮肤和肌肉损伤比手动病变少
手法病变通常会导致大量的肌肉和皮肤损伤。相比之下，激光病变可以更具体地针对脊髓，减少对其他组织的损害。为了说明这一点，使用Tg（β-肌动蛋白：utrophin-mCh）幼虫进行手动和激光病变。该线荧光标记F-肌动蛋白结合蛋白，允许脊髓细胞和肌肉纤维的可视化。然后将幼虫活体安装并成像（图7A，B）。 图7A 显示了脊髓的损伤。在激光和手动病变条件下，损伤部位缺乏促尿激素表明，两种病变方法都损伤了脊髓中的细胞。 图7B 显示了肌肉损伤。在除非的情况下，肌肌组有一个清晰的人字形结构，并且可见肌动蛋白纤维束。在手部病变条件下，肌肌节组织形状明显受损，并且存在较少的肌动蛋白纤维。这表明肌肉严重受损。然而，在激光病变条件下，肌节的V形结构得以维持。肌肉纤维有一些损伤，但这包含在一个或两个肌内，而在手动病变条件下则包含在四个肌内。此外，与手动病变相比，激光病变状况存在轻微的皮肤损伤，如图 7C中在体视显微镜上拍摄的图像所示。
总而言之，这些结果表明，可重复的半自动激光病变有可能成为研究斑马鱼神经再生的强大工具。
图1：半自动激光损伤工作流程示意图。 受精后三天（dpf），将幼虫装入96孔板中并放置在自动幼虫处理平台上。然后，将每个幼虫加载到毛细管中，置于正置显微镜上的10x NA 0.5透镜下进行成像和激光病变。病变后，将幼虫卸载到新的96孔板中进行收集和进一步实验。在顶部，激光病变前后tg（Xla.Tubb：DsRed）3 dpf幼虫的透射和荧光图像（比例尺= 50μm）。幼虫向左向喙，背向上（所有数字）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：半自动斑马鱼幼体成像系统和激光控制系统的软件启动。（B） VAST 软件的主窗口显示空毛细管。（C） 带有空白板模板的 LP 采样器窗口。（D） 运行Watch_for_ROIs_py3.py脚本的 python IDE 视图。橙色矩形指向终端选项卡，并在激光衰减器初始化期间显示消息。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：tg（Xla.Tubb：DsRed）3 dpf幼虫上的激光病变序列示例 （A）从ImageJ工具栏中选择线ROI工具后，使用20μm线进行激光损伤的第一步。（B）第二步用80μm管线进行脊髓的完整横断。（C）用于从ImageJ控制激光的脚本的视图。（D）激光病变期间的图像序列。顶部：病变前;中间：紧接第一步;底部：紧接第二步（比例尺= 50μm）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：乙酰化微管蛋白免疫染色（A-C）和钙成像（D，E）表明激光病变完全破坏了脊柱组织的连续性。（B）脊柱完全横断，显示脊髓组织沿背-腹侧和内侧轴完全断裂。（C）不完全的横断。（比例尺 = 50 μm）。（D）在tg（Xla.Tubb：GCaMP6s）3 dpf幼虫上截取脊髓。矩形显示用于量化病变的喙（蓝色）和尾部（橙色）侧荧光强度的ROI。（E）在喙和尾部分析ROI中荧光强度随时间变化的图表。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：激光损伤引发免疫反应并导致成功的解剖学和功能恢复。 （A-D） 在激光病变之前和之后的不同时间：3小时（B），24小时（C）后和48小时（D）之后的tg（Xla.Tubb：DsRed）3dpf幼虫的最大强度投影荧光图像。（电子-G）使用钙成像来评估功能恢复。（E）具有分析ROIs的病变tg（Xla.Tubb：GCaMP6s）幼虫。（F）在喙和尾部分析ROI中荧光强度随时间变化的图表。（G）在病灶后3，24，48小时（N = 3）量化尾部和喙尖峰振幅（连接性恢复指数）之间的比率。（H-I）表征病变后的免疫反应。（H）未除（左）和病变（右）tg（Xla.Tubb：DsRed;mpeg1：GFP）3 dfp幼虫的荧光图像，显示巨噬细胞（mpeg1 +细胞，绿色）在6小时时的积累。（I）在损伤后6小时定量受伤和完整幼虫中的巨噬细胞数量（N = 3）（比例尺= 50μm）。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：病变诱导的运动神经元生成在激光和手动病变之间具有可比性。（A-C）来自Tg（mnx1：gfp）5 dpf幼虫的ApoTome显微镜的图像，带有EdU染色，激光病变（A），手动病变（B）和除非（C）条件。箭头表示为两个标记标记双重标记的单元格。比例尺 = 100 μm. （A'-C'） 双标记细胞的放大倍率更高，用白色方框表示。（D）量化每个幼虫中共定位细胞数量的细胞计数。在损伤部位的两侧放置50μm窗口，并在所有Z-stack图像中计数共定位细胞。单因素方差分析是用Tukey的后跳检验27进行的。激光和手部病变之间无显著差异（p = 0.909）。与激光病变（2.4 倍变化，p = 0.011）和手动病变（2.3 倍变化，p = 0.018）相比，除非对照组的 mnx1：gfp+/EdU+ 细胞显著减少。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：激光病变比手动病变引起的肌肉和皮肤损伤更少。 （A-B）在非手动病变和激光病变条件下，在共聚焦显微镜下以20倍放大倍率拍摄tg（β-actin：utrophin-mCherry）3 dpf幼虫的单Z-堆栈图像。白色箭头表示受伤部位。比例尺 = 50 μm.（A）表示脊髓和尾部可见的Z轴堆叠。SC 标记脊髓，NC 标记标记标记。（B）表示可见肌肉纤维的Z层。（C）在除非，手动病变和激光病变条件下在3 dpf幼虫的体视显微镜上拍摄图像。使用钨丝销将幼虫固定在平台上（在激光病变图像中可见）。黑匣子表示病变部位。比例尺 = 50 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
补充文件1：实验方案的细节。描述了转基因斑马鱼品系的生成，手动脊髓损伤，乙酰化微管蛋白免疫组织化学，Hb9 / EdU染色，成像以及图像处理和分析。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
迫切需要更深入地了解斑马鱼在再生过程中起作用的过程。这种动物模型为生物医学研究提供了许多好处，特别是对于脊髓损伤1。大多数研究涉及手动病变，需要训练有素的操作员并诱发多组织损伤。这里提出了激光病变方案，允许控制病变特征并减少对周围组织的损害。此外，这种技术很容易被相对未经训练的实验者成功使用。
该协议中的关键步骤是激光器的校准和ROI的定义。在实践中，校准非常稳定（甚至长达数月），一旦确定了ROI的正确尺寸和位置，该技术的使用就很简单。虽然该协议描述了如何在特定设备上执行病变，但激光病变的大多数好处都可用于不同的系统，例如旋转盘显微镜。
该协议的主要局限性是需要使用脊髓的荧光报告程序以及执行病变所需的时间（〜5分钟/鱼）。后者通过高可重复性来补偿，需要更少的动物。然而，手动病变对于需要许多病变动物的药物测试等应用仍然可行。如图所示，病变诱导的神经发生程度在激光和手部病变之间相当。
然而，激光损伤具有巨大的潜在应用，其中一些与提供的独特益处有关。例如，旋转毛细管允许以受控方式在各种位置进行病变。例如，它可用于在Maothner细胞中诱导单神经元轴突切开术（数据未显示），正如Bhatt等人的工作15所证明的那样。使用手动病变是不可能的。
结果还表明，损伤主要包含在脊髓上，对周围组织的损伤最小。这可能意味着激光病变后看到的细胞反应更有可能归因于脊髓，而不是来自其他受损组织的信号。这也可能意味着激光病变的幼虫更能承受进一步的实验准备。例如，电生理学的解剖涉及使用镊子28，29，30去除躯干皮肤，这将导致在已经脆弱的损伤部位施加高机械压力，并有可能再次破坏任何轴突连接。在激光病变幼虫中看到的皮肤和肌肉组织的完整性可以保护病变部位免受进一步的损害，并导致更准确地表示所达到的再生水平。
此外，激光损伤后损伤的定位的改善限制了不同再生过程之间耦合的扩展，这可能掩盖了使用手动损伤时更微妙的过程。这里描述的幼虫斑马鱼实验损伤的方法可能会在定量生物学，生物物理学和计算生物学的背景下开辟一系列新的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了BBSRC（BB/S0001778/1）的支持。CR由Princess Royal TENOVUS苏格兰医学研究奖学金计划资助。我们感谢David Greenald（爱丁堡大学CRH）和Katy Reid（爱丁堡大学CDBS）对转基因鱼的善意礼物（见 补充文件）。我们感谢Daniel Soong（爱丁堡大学CRH）对3i旋转盘共聚焦的友好访问。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
Tags
医学，第177期，Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
