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Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.
Abstract
Les larves de poisson zèbre possèdent un système nerveux central (SNC) entièrement fonctionnel avec une capacité de régénération élevée seulement quelques jours après la fécondation. Cela rend ce modèle animal très utile pour étudier les lésions de la moelle épinière et la régénération. Le protocole standard pour induire de telles lésions consiste à transecter manuellement la partie dorsale du tronc. Cependant, cette technique nécessite un entraînement approfondi et endommage des tissus supplémentaires. Un protocole a été développé pour les lésions induites par laser afin de contourner ces limitations, permettant une reproductibilité et une exhaustivité élevées de la transsection de la moelle épinière sur de nombreux animaux et entre différentes séances, même pour un opérateur non formé. En outre, les lésions tissulaires se limitent principalement à la moelle épinière elle-même, ce qui réduit les effets de confusion liés à la blessure de différents tissus, par exemple la peau, les muscles et le SNC. De plus, des hémi-lésions de la moelle épinière sont possibles. L’amélioration de la préservation de l’intégrité des tissus après une blessure au laser facilite d’autres dissections nécessaires pour des analyses supplémentaires, telles que l’électrophysiologie. Par conséquent, cette méthode offre un contrôle précis de l’étendue de la blessure qui est irréalisable manuellement. Cela permet de nouveaux paradigmes expérimentaux dans ce modèle puissant à l’avenir.
Introduction
Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre (Danio rerio) peut réparer son système nerveux central (SNC) après une blessure1. L’utilisation des larves de poisson zèbre comme modèle de régénération de la moelle épinière est relativement récente. Il s’est avéré utile d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la réparation2. Cela est dû à la facilité de manipulation, au cycle expérimental court (nouvelles larves chaque semaine), à la transparence optique des tissus et à la petite taille des larves, idéale pour la microscopie à fluorescence in vivo .
Dans le cas de la régénération de la moelle épinière, deux avantages supplémentaires de l’utilisation de larves sont la rapidité de récupération, quelques jours par rapport à quelques semaines pour les adultes, et la facilité d’induire des blessures à l’aide de techniques manuelles. Cela a été utilisé avec succès dans de nombreuses études3,4,5, y compris des enquêtes récentes6,7. Dans l’ensemble, cela conduit à une production accrue de données significatives, à une grande adaptabilité des protocoles expérimentaux et à une diminution des coûts expérimentaux. L’utilisation de larves moins de 5 jours après la fécondation réduit également l’utilisation d’animaux suivant les principes des 3R dans la recherche animale8.
Après une lésion de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre, de nombreux processus biologiques se produisent, notamment une réponse inflammatoire, une prolifération cellulaire, une neurogenèse, la migration des cellules survivantes ou nouvellement générées, la reformation des axones fonctionnels et un remodelage global des circuits des processus neuronaux et des tissus de la colonne vertébrale6,7,9,10 . Pour être orchestrés avec succès, ces processus impliquent une interaction finement régulée entre une gamme de types de cellules, de composants de matrice extracellulaire et de signaux biochimiques11,12. Démêler les détails de cette réorganisation importante d’un tissu complexe tel que la moelle épinière nécessite l’utilisation et le développement d’approches expérimentales précises et contrôlées.
Le principal paradigme expérimental utilisé pour étudier la régénération de la moelle épinière chez le poisson-zèbre consiste à utiliser des moyens chirurgicaux pour induire des lésions tissulaires par résection, coup de couteau ou cryofreinture3,13. Ces approches ont l’inconvénient de nécessiter une formation spécifique aux compétences en microchirurgie, ce qui prend du temps pour tout nouvel opérateur et peut empêcher leur utilisation dans des projets à court terme. En outre, ils induisent généralement des dommages aux tissus environnants, ce qui peut influencer la régénération.
Une autre approche consiste à induire des dommages cellulaires chimiquement14 ou par des manipulations génétiques15. Ce dernier permet des dégâts très ciblés. Cependant, une telle technique nécessite un long travail préparatoire pour générer de nouveaux poissons transgéniques avant de faire toute expérience, renouvelée chaque fois qu’un type de cellule unique est ciblé.
Il y a donc besoin d’une méthode permettant des lésions ciblées mais polyvalentes adaptées à une variété d’études en régénération. Une solution consiste à utiliser un laser pour induire des dommages localisés dans le tissu d’intérêt16,17,18,19,20. En effet, l’utilisation de lésions tissulaires induites par le laser présente une approche robuste pour générer des lésions de la moelle épinière avec de nombreux avantages. Les microscopes équipés de tels modules de manipulation laser permettent de spécifier une zone de forme personnalisée où l’ablation cellulaire aura lieu, avec l’avantage supplémentaire du contrôle temporel. La taille et la position de la lésion peuvent ainsi être adaptées pour répondre à toutes les questions.
La caractéristique manquante de la plupart des systèmes de lésions laser est la possibilité d’induire des blessures de manière hautement reproductible pour une série de larves. Ici, un protocole original est décrit à l’aide d’un laser UV pour induire des lésions semi-automatisées précises et contrôlées chez les larves de poisson zèbre sur la base d’une plate-forme microfluidique conçue pour la manipulation automatisée des larves21. De plus, dans le système présenté ici, les larves sont insérées dans un capillaire en verre, ce qui permet une rotation libre de l’animal autour de son axe rostrocaudal. L’utilisateur peut choisir le côté de la larve à présenter au laser tout en permettant à l’imagerie par fluorescence de cibler précisément le faisceau laser et d’évaluer les dommages après la lésion.
Le protocole décrit ici est utilisé avec un système d’imagerie semi-automatisé des larves de poisson-zèbre combiné à un disque rotatif équipé d’un laser UV (désigné ci-après comme le système VAST). Cependant, les principaux points du protocole et la plupart des revendications de la technique sont valables pour tout système équipé d’un laser capable d’ablation cellulaire, y compris les microscopes à balayage laser à deux photons, les microscopes à disque rotatif équipés d’un laser UV (module FRAP) ou les vidéomicroscopes avec un module laser pour la manipulation de photos. L’une des principales différences entre le système VAST et la manipulation conventionnelle des échantillons sera que, pour ces derniers, le montage de larves dans l’agarose à faible point de fusion sur des couvercles en verre / boîtes de Petri à fond de verre au lieu de les charger dans une plaque de 96 puits sera nécessaire.
Les avantages offerts par cette méthode ouvrent des opportunités pour la recherche innovante sur les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours du processus de régénération. De plus, la haute qualité des données permet des enquêtes quantitatives dans un contexte multidisciplinaire.
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Protocol
Toutes les études sur les animaux ont été réalisées avec l’approbation du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et conformément à sa réglementation, sous la licence de projet PP8160052. Le projet a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Édimbourg. Pour les analyses expérimentales, des larves de poisson zèbre âgées de moins de 5 jours de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées parmi les lignées transgéniques disponibles suivantes : Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) et Tg(mnx1:gfp) (voir le dossier supplémentaire 1 concernant la génération des lignées transgéniques de poissons-zèbres). Un schéma du protocole utilisant la plate-forme automatisée de manipulation des larves de poisson zèbre est illustré à la figure 1. Tous les logiciels personnalisés, scripts et protocoles expérimentaux détaillés utilisés dans ce travail sont disponibles sur https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.
1. Préparation de l’échantillon
- À 5 h après la fécondation, trier les embryons pour le bon stade de développement21. Jetez les œufs morts et les embryons peu développés et surdéveloppés.
- 3 jours après la fécondation (dpf), anesthésier les larves en ajoutant 2 mL d’acide aminobenzoïque-éthyl-méthyl-ester à 50 mL d’eau de poisson dans une boîte de Petri de 90 mm. Utilisez des animaux élevés avec de la phénylthiourée (PTU) (voir tableau des matériaux) pour prévenir la pigmentation de la peau s’il s’agit d’un problème, ce qui n’est pas le cas pour les lésions de la moelle épinière sur 3 larves dpf décrites dans ce protocole.
REMARQUE: Cette concentration anesthésique relativement élevée est utilisée pour empêcher les mouvements des larves après l’impact du laser. - Dépister les embryons pour l’expression du rapporteur fluorescent (dossier supplémentaire 1).
REMARQUE: Un rapporteur fluorescent pour la moelle épinière (ou une autre structure d’intérêt) est souvent nécessaire pour évaluer l’efficacité de la blessure. L’utilisation de tg(Xla.Tubb:DsRed) aide à identifier la moelle épinière. - Transférer les larves sélectionnées dans une plaque de 96 puits pour les utiliser dans le système VAST (voir tableau des matériaux) avec 300 μL d’eau de poisson par puits. Utilisez directement le milieu contenant l’anesthésique de la boîte de Petri de 90 mm. Assurez-vous de n’avoir qu’une seule larve par puits. Préparez une assiette vide supplémentaire de 96 puits pour recueillir les larves sectionnées.
REMARQUE: Si vous utilisez un autre système de lésion laser, montez les larves dans un gel d’agarose à point de fusion bas (LMP) à 1% dans une chambre d’observation appropriée.
2. Préparation au microscope
- Allumez tous les composants du système (VAST, microscope, laser, PC), y compris le laser pour l’ablation.
- Une fois le matériel entièrement initialisé, lancez le logiciel de microscope, ImageJ/Fiji, un environnement de développement intégré (IDE) python et le logiciel d’imagerie automatisée du poisson-zèbre (système VAST) si vous utilisez cette plate-forme (voir la table des matériaux).
- Configurez le logiciel VAST en suivant les étapes ci-dessous.
- Lorsque le logiciel VAST se lance, choisissez Plate dans la première fenêtre et cliquez sur le bouton Terminé (Figure 2A). Une autre petite fenêtre apparaîtra demandant si le capillaire est vide et propre. Vérifiez en regardant l’image du capillaire s’il y a des bulles d’air à l’intérieur. Sinon, cliquez sur Oui. S’il y a des bulles, cliquez sur Non et suivez l’étape 2.3.2-2.3.3 (Figure 2B).
- Dans la fenêtre De l’échantillonneur de grandes particules (LP), cliquez sur Prime pour éliminer les bulles d’air (Figure 2C).
- Allez dans la fenêtre principale du logiciel (avec l’image capillaire) et faites un clic droit sur l’image. Sélectionnez Enregistrer l’image capillaire vide dans le menu contextuel (Figure 2B).
- Dans la fenêtre LP Sampler , accédez au menu Fichier et sélectionnez l’option Ouvrir le script . Choisissez un fichier contenant le script correspondant à l’expérience à effectuer.
- Dans la fenêtre principale du logiciel VAST, accédez à Fichier et choisissez Ouvrir l’expérience. Choisissez le fichier d’expérience correspondant à l’expérience planifiée.
REMARQUE: Assurez-vous que les cases Déchargement automatique et Sortie en vrac vers les déchets ne sont PAS cochées.
- Configurez le logiciel de microscope pour l’imagerie.
- Lancez le logiciel d’imagerie de microscope (voir Table des matériaux) pour initialiser le matériel. Cela peut prendre quelques minutes, selon le système.
- Allez dans les paramètres d’acquisition et configurez le microscope pour l’imagerie du fluorophore exprimé dans les larves. Utilisez un objectif de trempage d’eau 10x NA 0,5 pour vous assurer que le volume focal est suffisamment allongé le long de l’axe optique pour lésionr toute la profondeur de la moelle épinière ou du tissu ciblé.
- Configurez ImageJ/Fiji pour les lésions laser.
- Allez dans le menu Fichier , choisissez Nouveau/Script pour ouvrir la fenêtre de script.
- Dans la nouvelle fenêtre, allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir pour charger le script de lésion laser (Manual_MP_Operation.ijm).
- Configurez l’IDE Python.
- Lancez l’IDE Python.
- Allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir le fichier pour charger le script pour gérer le laser (Watch_for_ROIs_py3.py).
- Accédez au menu Exécuter et choisissez Exécuter sans débogage pour exécuter le script. Vérifiez qu’une séquence de messages dans le panneau TERMINAL apparaît avec du bruit pendant l’initialisation de l’atténuateur laser (Figure 2D).
3. Effectuer des lésions laser sur le système VAST
- Centrez le capillaire par rapport à l’objectif du microscope en déplaçant la scène en cliquant sur les boutons fléchés de la fenêtre principale du logiciel VAST (Figure 2B).
- Concentrez-vous sur le dessus du capillaire en regardant à travers les oculaires et en utilisant la lumière transmise par le microscope.
ATTENTION : Le capillaire est très fragile et peut se briser s’il est touché par l’objectif. Déplacez lentement le bouton du microscope lors de la mise au point vers l’intérieur et vers l’extérieur. - Placez les plaques de 96 puits sur le support de plaque de l’échantillonneur LP du système VAST. Placez la plaque contenant des larves sur le support gauche et la plaque de collecte sur la droite. Assurez-vous que les plaques sont correctement orientées : le puits A1 doit se trouver dans le coin avant-gauche du support.
- Dans le logiciel VAST, dans la fenêtre LP Sampler, cliquez sur le bouton Plate Template et sélectionnez tous les puits contenant des larves. Cliquez sur le bouton OK pour valider et fermer la fenêtre (Figure 2C).
- Dans la fenêtre LP Sampler, cliquez sur le bouton Run Plate pour commencer à charger une larve.
REMARQUE: Après un certain temps, la larve devrait être visible dans le capillaire à la position (prédéfinie dans le fichier de définition de l’expérience), ce qui permet de blesser la moelle épinière. La lumière du plateau VAST s’éteindra après quelques rotations pour régler la larve avec le côté latéral face à l’objectif du microscope. - Accédez au logiciel de microscope et cliquez sur le bouton Live pour imager la larve.
- Tournez le bouton de mise au point du microscope jusqu’à ce que le canal central de la moelle épinière soit visible.
REMARQUE: Il peut être plus facile de faire la mise au point en utilisant d’abord la lumière transmise, puis d’affiner avec la fluorescence. - Prenez un instantané en fluorescence et enregistrez l’image dans un dossier dédié.
- Ouvrez l’image dans ImageJ et ajustez le contraste si nécessaire (à l’aide du menu Image/Réglage/Luminosité/contraste... d’ImageJ).
- Cliquez sur l’outil de ligne Région d’intérêt (ROI) et tracez une courte ligne (20 μm) centrée sur la moelle épinière (Figure 3A).
- Basculez le microscope vers la position du miroir réfléchissant à 100 %.
- Chargez le script ImageJ et cliquez sur le bouton Exécuter . Utilisez les paramètres suivants : Répétition - 2 ; Échantillon - 1; Largeur - 40 microns; Atténuation - 89 (pleine puissance laser) (Figure 3C).
- Lorsque la séquence de prise de vue laser est terminée, passez à l’imagerie par fluorescence sur le logiciel d’imagerie et ajustez la mise au point si nécessaire.
REMARQUE: Un changement de mise au point est souvent observé en raison du déplacement de la queue pendant l’exposition au laser. - Prenez un nouvel instantané et enregistrez-le.
- Ouvrez cette nouvelle image dans ImageJ et tracez une nouvelle ligne qui devrait être plus grande que la moelle épinière elle-même (~80 μm), en commençant sous la face ventrale de la moelle épinière dans la partie supérieure de la notochorde et en allant vers la face dorsale pour se terminer dans l’espace entre la moelle épinière et la peau (Figure 3B).
- Basculez le microscope vers la position du miroir réfléchissant à 100 %.
- Allez dans la fenêtre de script ImageJ et cliquez sur le bouton Exécuter . Utilisez les paramètres suivants : Répétition - 2 ; Échantillon - 1; Largeur - 40 microns; Atténuation - 89 (puissance laser complète).
- Une fois la séquence de prise de vue laser (plus longue) terminée, vérifiez la qualité de la transsection en imageant la fluorescence et la mise au point. S’assurer qu’aucune cellule ou axone ne reste intact dans le site de la lésion, qui devrait apparaître comme une zone fluorescente sombre ou comme une zone fluorescente faible et homogène (Figure 3D, panneau inférieur).
- Rassemblez les larves lésionnées dans la plaque vide de 96 puits (avec les mêmes coordonnées que celles du puits d’origine) en accédant à la fenêtre principale du logiciel VAST et en cliquant sur le bouton Collecter .
- Rallumez le voyant système VAST en cliquant sur la case à cocher Tray Light en bas à gauche de la fenêtre.
- Répétez les étapes 3.3 à 3.17 pour chaque nouvelle larve à blesser.
4. Manipulation post-lésion et expériences supplémentaires
- Retirez les larves de la plaque de 96 puits dès que possible et transférez-les dans une boîte de Petri propre avec de l’eau fraîche pour que les larves puissent récupérer après la lésion. Mettez la boîte de Petri dans un incubateur à 28 °C.
REMARQUE: Les dommages continuent souvent à se propager dans la première heure après la lésion. L’étendue réelle de la lésion doit donc être évaluée par imagerie par fluorescence après un délai d’environ 1 h.
5. Dépannage
- Si des bulles d’air sont présentes dans les tubes et les capillaires du système VAST, cliquez sur le bouton Prime de la fenêtre LP Sampler pour les retirer.
- Considérez les lésions infructueuses (telles qu’évaluées à partir de la fluorescence restante dans le site de la lésion, à l’exception du fond résiduel et homogène attendu), qui peuvent être dues à plusieurs raisons mentionnées ci-dessous.
- Faible puissance laser: Lorsque cela se produit, essayez avec une valeur plus élevée.
REMARQUE: Le système VAST est équipé d’un laser à colorant. Cela implique que la concentration de la solution de colorant utilisée pour la génération de lumière laser peut changer avec le temps, entraînant une diminution de la puissance du laser. Remplacer par une nouvelle solution résout généralement le problème22. - Mauvais étalonnage: Lorsque cela se produit, vérifiez l’étalonnage et la puissance du système laser conformément à l’étape 5.2.2.1-5.2.2.4. S’il n’est pas étalonné correctement, le laser ne sera pas dirigé vers l’emplacement souhaité, entraînant ainsi des lésions infructueuses ou des dommages indésirables dans les tissus adjacents.
- Placez une glissière miroir sur le dessus de la chambre capillaire. Concentrez-vous sur le côté enduit (il doit faire face à l’objectif). Utilisez une valeur par défaut précédente dans la diapositive pour effectuer la mise au point plus facilement.
- Appliquez un modèle d’ablation au laser à l’aide d’un script d’étalonnage.
- Évaluez la qualité du modèle. Les taches ou les lignes doivent apparaître nettes et non floues.
- Utilisez une rampe avec une puissance croissante pour évaluer si la puissance du laser a changé par rapport aux sessions précédentes.
- Mouvement larvaire pendant les lésions: Les larves réagissent différemment à l’anesthésie; ainsi, la lésion laser peut déclencher des mouvements de la queue pendant le processus, empêchant ainsi une transsection réussie. Lorsque cela se produit, prenez une itération supplémentaire des étapes de la lésion laser pour la compléter tout en évitant d’endommager les tissus environnants.
- Mauvaise mise au point: Lorsque cela se produit, concentrez-vous sur le milieu du canal central pour obtenir les meilleurs résultats.
- Dessin, position et taille du retour sur investissement : La position et la taille du retour sur investissement sont essentielles à la réussite des transections. Le retour sur investissement doit être plus grand que la moelle épinière et centré sur le centre de la moelle épinière. Pour résoudre ce problème, commencez à tirer le retour sur investissement du côté ventral de la moelle épinière et montez vers la face dorsale pour obtenir une transsection réussie. Cela est probablement dû aux mouvements de la queue déclenchés par la séquence de tirs laser pendant la procédure d’ablation.
- Faible puissance laser: Lorsque cela se produit, essayez avec une valeur plus élevée.
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Representative Results
Validation de la transsection de la moelle épinière
Des investigations structurelles et fonctionnelles ont été effectuées pour évaluer si le protocole permet une transsection complète de la moelle épinière.
Tout d’abord, pour vérifier que la perte de fluorescence au site de la lésion était due à des lésions tissulaires neuronales et non à un photoblanchiment de fluorescence provenant de l’éclairage laser, une immunocoloration à l’aide d’un anticorps contre la tubuline acétylée (voir tableau des matériaux et dossier supplémentaire 1) a été effectuée. Une perturbation complète des axones entre les côtés caudal et rostral de la lésion a été observée, confirmant la transsection complète de la moelle épinière (Figure 4B). Une transsection réussie de la moelle épinière ne doit pas laisser de projection neuronale restante à travers le site de la lésion (voir la figure 4C pour un exemple de lésion infructueuse). En utilisant cette technique, le taux de réussite des lésions au laser de la moelle épinière a été estimé à 75% (quatre transsections incomplètes chez 16 animaux).
La perte de fonctionnalité après une lésion laser a été étudiée à l’aide de l’imagerie calcique. Sur les poissons intacts, l’activité spontanée coordonnée du réseau neuronal génère des pics de fluorescence le long de toute la moelle épinière. Une transsection réussie interromprait la propagation de cette activité entre les deux côtés de la lésion. Pour contrôler la qualité de la transsection de la moelle épinière, des lésions laser ont été réalisées sur des larves tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) à 3 dpf. Après la collecte dans une nouvelle plaque multi-puits, les larves ont été légèrement anesthésiées. Ils ont été montés sur un couvercle en verre dans de l’agarose à faible point de fusion pour effectuer des enregistrements time-lapse de fluorescence sur un microscope confocal à partir de 3 heures après la blessure. Une perte d’activité du côté caudal du site de la lésion a été observée. En effet, la quantification de la fluorescence montre que les pics dus à l’activité spontanée du poisson n’étaient présents du côté rostral qu’après une blessure mais se produisaient de manière coordonnée dans les positions rostrale et caudale équivalente chez les poissons intacts (Figure 4D,E). Le faible signal résiduel du côté caudal après une blessure était probablement dû à l’activité des neurones sensoriels (probablement des neurones sensoriels rohon-barbe du côté caudal de la moelle épinière23) en réaction au mouvement de la queue induit par la contraction musculaire du côté rostral.
Processus de régénération induits par des lésions laser
Après 24 heures après la blessure (HPI), la plaie a commencé à se refermer, entraînant une restauration partielle de la structure initiale de la moelle épinière après 48 h (Figure 5D). À l’aide de l’imagerie calcique, une reconnexion fonctionnelle partielle a été confirmée (Figure 5E,F) après 48 hpi. Le calcul du rapport (nommé indice de restauration de la connectivité par les auteurs) entre l’amplitude des pics dans la région caudale et la zone rostrale (figure 5G), a montré une augmentation entre 3, 24 et 48 hpi, comme prévu lors de la régénération de la moelle épinière.
Les lésions laser déclenchent une réponse immunitaire
Le recrutement de macrophages (mpeg1:GFP + cellules) a été observé après des lésions laser à l’aide de lésions laser de larves tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) (Figure 5H,I). Ceci est cohérent avec les études précédentes des auteurs utilisant des lésions manuelles démontrant le rôle essentiel des macrophages pour une régénération réussie de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre6,24. Cette observation indique que les réactions immunitaires peuvent être étudiées après une blessure au laser et corrobore que des lésions tissulaires se sont produites.
Les lésions laser et les lésions manuelles déclenchent une neurogenèse accrue dans la moelle épinière
Des études antérieures ont utilisé des lésions manuelles pour étudier la neurogenèse qui se produit à la suite d’une lésion de la moelle épinière6,15. Les lésions laser pourraient être un outil précieux pour étudier ce phénomène. Une expérience publiée précédemment a montré une augmentation de la neurogenèse à la suite d’une lésion manuelle de la moelle épinière par rapport aux témoins non répartis15. Ici, les poissons tg(mnx1:gfp) ont été utilisés comme motoneurones et ont été marqués par fluorescence. La coloration des anticorps anti-GFP a été utilisée pour améliorer la visibilité de la GFP chez les larves. Cela a été combiné avec la coloration EdU25 (voir le fichier supplémentaire 1), qui étiquette les neurones nouvellement générés. L’EdU a été ajoutée immédiatement après une blessure à 3 dpf, ce qui signifie que toutes les cellules marquées avec EdU ont été générées après la blessure. Par conséquent, les cellules qui présentent une coloration colocalisée représentent de nouveaux motoneurones nés après une lésion de la moelle épinière. Le nombre de cellules colocalisées de chaque côté du site de la blessure ou dans une zone correspondant à l’emplacement et à la taille du site de la blessure chez les témoins non répartis (capturés dans deux fenêtres de 50 μm) a été compté, et la différence dans le nombre moyen de cellules colocalisées a été analysée à l’aide d’une ANOVA26 unidirectionnelle.
Ce protocole a été utilisé sur des larves sectionnées manuellement et au laser pour comparer les effets de chaque méthode de lésion sur la neurogenèse (Figure 6). Aucune différence n’a été observée dans le nombre de cellules marquées entre les lésions manuelles et laser. Les poissons non sectionnés présentaient moins de cellules à double marquage que les poissons lésionnés dans les deux conditions de lésion (figure 6D). Ceci est cohérent avec les résultats précédents montrant une augmentation de la neurogenèse chez les poissons sectionnés manuellement par rapport aux poissons non sectionnés15.
Ces résultats soutiennent les résultats de l’imagerie calcique et de la coloration à la tubuline acétylée, car la lésion au laser provoque une réponse de régénération comparable à une lésion manuelle. Cela indique que la lésion laser ne blanchit pas simplement la fluorescence dans les cellules, mais entraîne une blessure qui déclenche les mêmes réponses cellulaires qu’une lésion manuelle.
Les lésions au laser entraînent moins de dommages cutanés et musculaires que les lésions manuelles
Les lésions manuelles entraînent souvent de grandes quantités de dommages musculaires et cutanés. En revanche, les lésions au laser peuvent être ciblées plus spécifiquement sur la moelle épinière, réduisant ainsi les dommages causés à d’autres tissus. Pour illustrer cela, des larves de Tg(bêta-actine:utrophine-mCh) ont été utilisées pour effectuer des lésions manuelles et laser. Cette ligne marque par fluorescence une protéine de liaison à la F-actine, permettant la visualisation des cellules de la moelle épinière et des fibres musculaires. Les larves ont ensuite été montées vivantes et imagées (Figure 7A,B). La figure 7A montre les dommages à la moelle épinière. Le manque d’utrophine dans le site de la blessure dans les conditions de lésion laser et manuelle suggère que les deux méthodes de lésion ont endommagé les cellules de la moelle épinière. La figure 7B montre les dommages musculaires. Il y a une structure claire en forme de chevron aux myotomes dans l’état non ionné, et des faisceaux de fibres d’actine sont visibles. Il y a une perturbation visible de la forme du myotome dans l’état de lésion manuelle, et moins de fibres d’actine sont présentes. Cela démontre des dommages musculaires importants. Cependant, dans l’état de lésion laser, la structure en chevrons du myotome est maintenue. Il y a quelques dommages aux fibres musculaires, mais cela est contenu dans un ou deux myotomes par rapport à moins de quatre dans l’état de lésion manuelle. En outre, il y a des lésions cutanées mineures dans l’état de la lésion laser par rapport à l’état de la lésion manuelle, comme le montrent les images prises au stéréomicroscope à la figure 7C.
Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que les lésions laser semi-automatisées reproductibles ont le potentiel d’être un outil puissant pour étudier la régénération neuronale chez le poisson-zèbre.
Figure 1 : Schéma du flux de travail semi-automatique des blessures au laser. Trois jours après la fécondation (dpf), les larves sont chargées dans une plaque de 96 puits et placées sur la plate-forme automatisée de manipulation des larves. Ensuite, chaque larve est chargée dans un capillaire placé sous une lentille 10x NA 0,5 sur un microscope vertical pour l’imagerie et la lésion laser. Après les lésions, les larves sont déchargées dans une nouvelle plaque de 96 puits pour la collecte et d’autres expériences. Sur le dessus, images transmises et en fluorescence de tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 larves de dpf avant et après la lésion laser (barre d’échelle = 50 μm). Les larves sont orientées rostrale gauche et dorsale vers le haut (pour toutes les figures). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Démarrage du logiciel pour le système semi-automatisé d’imagerie des larves de poisson-zèbre et le système de contrôle laser. (A) Logiciel VAST au démarrage. (B) La fenêtre principale du logiciel VAST affiche le capillaire vide. (C) Fenêtre LP Sampler avec un gabarit de plaque vierge. (D) Vue de l’IDE python avec le script Watch_for_ROIs_py3.py en cours d’exécution. Le rectangle orange indique l’onglet du terminal avec les messages affichés lors de l’initialisation de l’atténuateur laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemple de séquence de lésion laser sur des larves tg(Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf. (A) Première étape de la lésion laser à l’aide d’une ligne de 20 μm après avoir sélectionné l’outil ROI de ligne dans la barre d’outils ImageJ. (B) Deuxième étape avec une ligne de 80 μm pour une transsection complète de la moelle épinière. (C) Vue du script utilisé pour contrôler le laser à partir d’ImageJ. (D) La séquence des images pendant les lésions laser. Haut: avant la lésion; Milieu: immédiatement après la première étape; En bas : immédiatement après la deuxième étape (barre d’échelle = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’immunocoloration de la tubuline acétylée (A-C) et l’imagerie calcique (D,E) indiquent que la lésion au laser perturbe entièrement la continuité du tissu rachidien. (A) Moelle épinière intacte. (B) Transsection complète de la colonne vertébrale montrant une perturbation complète du tissu de la moelle épinière le long des axes dorsal-ventral et médial-latéral. (C) Transsection incomplète. (barre d’échelle = 50 μm). (D) Moelle épinière transectée sur une larve tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf. Les rectangles montrent les ROI utilisés pour quantifier l’intensité de fluorescence dans les côtés rostral (bleu) et caudal (orange) de la lésion. (E) Graphique des changements d’intensité de fluorescence au fil du temps dans les rois d’analyse rostrale et caudale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: La lésion laser provoque une réponse immunitaire et conduit à une récupération anatomique et fonctionnelle réussie. (A-D) Les images de fluorescence de projection d’intensité maximale d’une larve tg(Xla.Tubb:DsRed) 3dpf avant (A) et à différents moments après la lésion laser: après 3 h (B), après 24 h (C) et après 48 h (D). (E-G) L’utilisation de l’imagerie calcique pour évaluer la restauration de la fonction. (E) Larve de tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) avec analyse ROIs. (F) Graphique des changements d’intensité de fluorescence au fil du temps dans les RO D’analyse rostrale et caudale. (G) Quantification du rapport entre les amplitudes des pics caudales et rostrales (indice de restauration de la connectivité) à 3, 24, 48 h après la lésion (N = 3). (H-I) Caractérisation de la réponse immunitaire après lésion. (H) Images de fluorescence de larves 3 dfp non dites (à gauche) et lésions (à droite) tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) montrant l’accumulation de macrophages (cellule mpeg1+, vert) à 6 hpi. (I) Quantification du nombre de macrophages à 6 h après la lésion chez les larves blessées et intactes (N = 3) (barres d’échelle = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : La génération de motoneurones induite par la lésion est comparable entre la lésion laser et la lésion manuelle. (A-C) Images du microscope ApoTome de larves tg(mnx1:gfp) 5 dpf avec coloration EdU, dans des conditions de lésion laser (A), de lésion manuelle (B) et non étiolée (C). Les pointes de flèche désignent des cellules à double étiquette pour les deux marqueurs. Barre d’échelle = 100 μm. (A'-C') Grossissement plus élevé des cellules à double marquage désigné par des boîtes blanches. (D) Quantification du nombre de cellules pour le nombre de cellules colocalisées dans chaque larve. Des fenêtres de 50 μm ont été placées de chaque côté du site de la blessure, et les cellules colocalisées ont été comptées dans toutes les images de la pile Z. L’ANOVA unidirectionnelle a été réalisée avec le test posthoc27 de Tukey. Aucune différence significative entre les lésions laser et manuelles (p = 0,909). Significativement moins de cellules mnx1:gfp+/EdU+ dans les contrôles non étirés par rapport à la lésion laser (changement de 2,4 fois, p = 0,011) et à la lésion manuelle (changement de 2,3 fois, p = 0,018). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : La lésion laser induit moins de lésions musculaires et cutanées que la lésion manuelle. (A-B) Images en pile Z uniques de larves tg(bêta-actine:utrophine-mCherry) 3 dpf dans les conditions de lésion manuelle non réparties et de lésion laser, prises au microscope confocal à un grossissement 20x. Des flèches blanches indiquent le site de la blessure. Barre d’échelle = 50 μm. (A) désigne les piles Z où la moelle épinière et la notochorde sont visibles. SC étiquette la moelle épinière et NC étiquette la notochorde. (B) désigne des piles Z où les fibres musculaires sont visibles. (C) Des images ont été prises au stéréomicroscope de 3 larves de dpf dans les conditions de lésion non répartie, manuelle et de lésion laser. Les larves ont été épinglées sur une plate-forme à l’aide de broches en fil de tungstène (visibles sur l’image de la lésion laser). La boîte noire indique le site de la lésion. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Dossier supplémentaire 1 : Les détails expérimentaux du protocole. La génération des lignées transgéniques de poisson-zèbre, les lésions manuelles de la moelle épinière, l’immunohistochimie de la tubuline acétylée, la coloration Hb9 / EdU, l’imagerie et le traitement et l’analyse d’images sont décrits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Il est urgent de mieux comprendre les processus en jeu lors de la régénération chez le poisson-zèbre. Ce modèle animal offre de nombreux avantages pour la recherche biomédicale, en particulier pour les lésions de la moelle épinière1. La plupart des études portent sur des lésions manuelles qui nécessitent un opérateur bien formé et induisent des lésions multi-tissulaires. Un protocole de lésion laser est présenté ici, permettant de contrôler les caractéristiques de la lésion et de réduire les dommages aux tissus environnants. De plus, cette technique est assez facile pour être utilisée avec succès par des expérimentateurs relativement peu formés.
Les étapes critiques du protocole sont l’étalonnage du laser et la définition des ROI. En pratique, l’étalonnage est très stable (même pendant des mois), et une fois que la bonne taille et la bonne position du ROI ont été déterminées, l’utilisation de cette technique est simple. Bien que le protocole décrive comment effectuer les lésions sur un équipement spécifique, la plupart des avantages des lésions laser sont disponibles pour différents systèmes, tels qu’un microscope à disque rotatif.
Les principales limites de ce protocole sont la nécessité d’utiliser un rapporteur de fluorescence de la moelle épinière et le temps nécessaire pour effectuer les lésions (~5 min/poisson). Ce dernier est compensé par une reproductibilité élevée nécessitant moins d’animaux. Cependant, les lésions manuelles sont toujours viables pour des applications telles que les tests de dépistage de drogues, où de nombreux animaux lésionnés sont nécessaires. Comme indiqué ici, l’étendue de la neurogenèse induite par les lésions est comparable entre les lésions laser et manuelles.
Cependant, les blessures au laser ont d’énormes applications potentielles, certaines d’entre elles étant liées aux avantages uniques offerts. Par exemple, un capillaire rotatif permet d’effectuer des lésions dans une grande variété de positions de manière contrôlée. Par exemple, il pourrait être utilisé pour induire une axotomie à neurone unique dans les cellules de Mauthner (données non montrées), comme cela a également été démontré dans les travaux de Bhatt et al.15. Cela ne serait pas possible avec des lésions manuelles.
Les résultats démontrent également que les dommages sont principalement contenus dans la moelle épinière, avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Cela pourrait signifier que les réponses cellulaires observées à la suite d’une lésion au laser sont plus susceptibles d’être attribuées spécifiquement à la moelle épinière plutôt qu’à la signalisation d’autres tissus endommagés. Cela pourrait également signifier que les larves lésionnées au laser sont plus capables de résister à d’autres préparations pour des expériences. Par exemple, la dissection pour l’électrophysiologie consiste à enlever la peau du tronc à l’aide d’une pince28,29,30, ce qui entraînerait une pression mécanique élevée exercée sur le site de la blessure déjà délicate et risquerait de briser à nouveau les connexions axonales. L’intégrité de la peau et du tissu musculaire observée chez les larves sectionnées au laser pourrait protéger le site de la lésion contre d’autres dommages et entraîner une représentation plus précise du niveau de régénération atteint.
De plus, l’amélioration de la localisation des dommages après une lésion au laser limite l’extension du couplage entre différents processus de régénération, ce qui peut masquer des processus plus subtils lors de l’utilisation de lésions manuelles. L’approche de la lésion expérimentale chez les larves de poisson-zèbre décrite ici peut ouvrir une gamme de nouvelles recherches dans le contexte de la biologie quantitative, de la physique biologique et de la biologie computationnelle.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le BBSRC (BB/S0001778/1). CR est financé par le Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Nous remercions David Greenald (CRH, Université d’Édimbourg) et Katy Reid (CDBS, Université d’Édimbourg) pour l’aimable don de poisson transgénique (voir dossier supplémentaire). Nous remercions Daniel Soong (CRH, Université d’Édimbourg) pour l’aimable accès au disque rotatif confocal 3i.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
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Médecine numéro 177Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
