Summary
Präklinische Modelle zielen darauf ab, das Wissen über die Krebsbiologie zu erweitern und die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen. Diese Arbeit beschreibt die Erzeugung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) mit Tumorgewebefragmenten. Die zPDXs wurden mit einer Chemotherapie behandelt, deren therapeutischer Effekt anhand der Zellapoptose des transplantierten Gewebes beurteilt wurde.
Abstract
Krebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen, und die Inzidenz vieler Krebsarten nimmt weiter zu. In Bezug auf Screening, Prävention und Behandlung wurden große Fortschritte erzielt. Präklinische Modelle, die das Chemosensitivitätsprofil von Krebspatienten vorhersagen, fehlen jedoch noch. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vivo patientenabgeleitetes Xenograft-Modell entwickelt und validiert. Das Modell basierte auf Zebrafischembryonen (Danio rerio) 2 Tage nach der Befruchtung, die als Empfänger von Xenotransplantatfragmenten von Tumorgewebe verwendet wurden, die aus einer chirurgischen Probe einer Patientin entnommen wurden.
Es ist auch erwähnenswert, dass bioptische Proben nicht verdaut oder disaggregiert wurden, um die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was für die Analyse des Tumorverhaltens und des Ansprechens auf die Therapie von entscheidender Bedeutung ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) aus der chirurgischen Resektion eines primären soliden Tumors. Nach dem Screening durch einen Anatomopathen wird die Probe mit einer Skalpellklinge präpariert. Nekrotisches Gewebe, Gefäße oder Fettgewebe werden entfernt und dann in 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm große Stücke geschnitten.
Die Stücke werden dann fluoreszenzmarkiert und in den perivitellinen Raum von Zebrafischembryonen xenotransplantiert. Eine große Anzahl von Embryonen kann kostengünstig verarbeitet werden, was Hochdurchsatz-In-vivo-Analysen der Chemosensitivität von zPDXs gegenüber mehreren Krebsmedikamenten ermöglicht. Konfokale Bilder werden routinemäßig aufgenommen, um die durch die Chemotherapie induzierten apoptotischen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen und zu quantifizieren. Das Xenotransplantat-Verfahren hat einen erheblichen Zeitvorteil, da es an einem einzigen Tag abgeschlossen werden kann, was ein angemessenes Zeitfenster für die Durchführung eines therapeutischen Screenings für koklinische Studien bietet.
Introduction
Eines der Probleme der klinischen Krebsforschung besteht darin, dass Krebs nicht eine einzelne Krankheit ist, sondern eine Vielzahl verschiedener Krankheiten, die sich im Laufe der Zeit entwickeln können und je nach den Eigenschaften des Tumors selbst und des Patienten spezifische Behandlungen erfordern1. Folglich besteht die Herausforderung darin, sich in Richtung einer patientenorientierten Krebsforschung zu bewegen, um neue personalisierte Strategien für die frühe Vorhersage von Krebsbehandlungsergebnissen zu identifizieren2. Dies ist besonders relevant für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), da es mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 11 % als schwer zu behandelnder Krebs gilt3.
Die späte Diagnose, das schnelle Fortschreiten und das Fehlen wirksamer Therapien sind nach wie vor die drängendsten klinischen Probleme der PDAC. Die größte Herausforderung besteht daher darin, den Patienten zu modellieren und Biomarker zu identifizieren, die in der Klinik angewendet werden können, um die wirksamste Therapie im Einklang mit der personalisierten Medizin auszuwählen 4,5,6. Im Laufe der Zeit wurden neue Ansätze zur Modellierung von Krebserkrankungen vorgeschlagen: Patienten-abgeleitete Organoide (PDOs) und von Maus-Patienten abgeleitete Xenotransplantate (mPDXs) stammen aus einer Quelle menschlichen Tumorgewebes. Sie wurden verwendet, um die Krankheit zu reproduzieren, um das Ansprechen und die Resistenz gegen die Therapie sowie das Wiederauftreten der Krankheit zu untersuchen 7,8,9.
In ähnlicher Weise hat das Interesse an zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Modellen (zPDX) zugenommen, dank ihrer einzigartigen und vielversprechenden Eigenschaften10, die ein schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die Krebsforschung darstellen11,12. zPDX-Modelle benötigen nur eine kleine Tumorstichprobengröße, was ein Hochdurchsatz-Screening der Chemotherapie möglich macht13. Die gebräuchlichste Technik, die für zPDX-Modelle verwendet wird, basiert auf einem vollständigen Probenverdau und der Implantation der primären Zellpopulationen, die den Tumor teilweise reproduziert, aber die Nachteile einer fehlenden Tumormikroumgebung und einer Wechselwirkung zwischen bösartigen und gesunden Zellen hat14.
Diese Arbeit zeigt, wie zPDXs als präklinisches Modell verwendet werden können, um das Chemosensitivitätsprofil von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs zu identifizieren. Die wertvolle Strategie erleichtert den Xenotransplantat-Prozess, da keine Zellexpansion erforderlich ist, was eine Beschleunigung des Chemotherapie-Screenings ermöglicht. Die Stärke des Modells besteht darin, dass alle Komponenten der Mikroumgebung so erhalten bleiben, wie sie im Krebsgewebe des Patienten sind, denn das Verhalten des Tumors hängt bekanntlich von ihrem Zusammenspiel ab15,16. Dies ist gegenüber alternativen Methoden in der Literatur sehr günstig, da es möglich ist, die Tumorheterogenität zu erhalten und patientenspezifisch zur Verbesserung der Vorhersagbarkeit des Behandlungsergebnisses und des Rezidivs beizutragen, so dass das zPDX-Modell in koklinischen Studien eingesetzt werden kann. Dieses Manuskript beschreibt die Schritte, die zur Erstellung des zPDX-Modells erforderlich sind, beginnend mit einer Tumorresektion des Patienten und deren Behandlung, um das Ansprechen auf die Chemotherapie zu analysieren.
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Protocol
Das italienische Gesundheitsministerium genehmigte alle beschriebenen Tierversuche in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU über die Verwendung und Pflege von Tieren. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie unter der Registrierungsnummer 70213. Von allen beteiligten Probanden wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Vor dem Start sollten alle Lösungen und die Ausrüstung vorbereitet werden (Abschnitt 1) und die Fische gekreuzt werden (Abschnitt 2).
1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten
HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Lösungen und Medien, die vorbereitet werden müssen.
- Unterstützung von Agarose-Gel
- Wiegen Sie das Agarosepulver in einem mikrowellengeeigneten Kolben ab und lösen Sie es in einem bestimmten Volumen E3-Zebrafischmedium auf, um ein 1%iges Gel herzustellen. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
Anmerkungen: Überkochen Sie die Lösung nicht. - Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Petrischale und warten Sie, bis das Gel vollständig erstarrt ist.
- Machen Sie kleine Agarosezylinder (~5 mm hoch) mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit abgeschnittener Spitze. Nach der Zubereitung in einer in Alufolie gewickelten Petrischale bei 4 °C lagern.
- Wiegen Sie das Agarosepulver in einem mikrowellengeeigneten Kolben ab und lösen Sie es in einem bestimmten Volumen E3-Zebrafischmedium auf, um ein 1%iges Gel herzustellen. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
- Mikronadeln aus Glas
- Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Abzieher, um feine Nadeln zu erhalten (Einstellungen: HEAT 990, PULL 550).
HINWEIS: Aus einer Kapillare können zwei feine Nadeln mit einem Spitzendurchmesser von 10 μm gewonnen werden.
- Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Abzieher, um feine Nadeln zu erhalten (Einstellungen: HEAT 990, PULL 550).
2. Fischkreuzung und Eiersammlung
- Übertragen Sie erwachsene Fische 3 Tage vor der Gewebeimplantation in Aufzuchtbecken, wie von Avdesh et al.17 beschrieben.
- HINWEIS: Ein Verhältnis von 1:1 oder 2:3 von Männern zu Frauen wird empfohlen. Die Fischdichte sollte maximal fünf Fische pro Liter Wasser betragen. Halten Sie Männchen und Weibchen über Nacht mit einer Barriere getrennt.
- Entfernen Sie am nächsten Tag die Barriere und lassen Sie die Fische sich paaren.
- Entfernen Sie die Fische aus den Zuchtbecken und bringen Sie sie in ihre Haltungsbecken zurück.
- Gießen Sie das Wasser aus dem Aufzuchtbecken durch ein feinmaschiges Netz. Übertragen Sie die befruchteten Eier in eine Petrischale mit E3-Zebrafischmedium.
- Überprüfen Sie die Petrischale mit einem Stereomikroskop und entsorgen Sie die trüben Eier. Bewahren Sie die befruchteten Eier in frischem E3-Zebrafischmedium bei 28 °C auf.
3. Probensammlung
Anmerkungen: Autoklavenzange und Skalpellgriff.
- Sofortige Bearbeitung
- Die chirurgische Probe des Tumors wird in 10 ml Tumormedium bei 4 °C (Tumorprobe mit einem Durchmesser von 5 mm bis 10 mm) entnommen. Übertragen Sie die Probe bei 4 °C von der gewünschten Stelle zur sofortigen Verarbeitung.
- Lagerung über Nacht (optional)
- Sammeln Sie die chirurgische Tumorprobe in 10 ml Tumormedium und lagern Sie die Probe über Nacht bei 4 °C.
- Lagerung bei -80 °C (optional, am wenigsten empfohlen)
- Lagern Sie die Probe bei -80 °C in einem kryogenen Fläschchen mit Tumormedium, das mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) angereichert ist.
4. Probenverarbeitung
Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.
- Waschen Sie das gesamte Tumorgewebe mit 5 ml frischem Tumormedium und pipettieren Sie 10x mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf und ab. Saugen Sie das Waschmedium ab und entsorgen Sie es. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
Anmerkungen: Vermeiden Sie eine Aspiration des Tumorgewebes, da es an der Pasteurpipette aus Kunststoff haften bleiben könnte. - Die Probe wird in eine Petrischale überführt und in 1-2 ml frisches Tumormedium getaucht. Schneiden Sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge in kleine Stücke (1-2 mm3) und legen Sie sie in ein steriles 5-ml-Kunststoffröhrchen mit Tumormedium.
- Stellen Sie den McIlwain-Taschenhäcksler auf eine Dicke von 100 μm ein. Legen Sie die Probenfragmente auf den runden Plastiktisch des Häckslers und hacken Sie sie. Drehen Sie den Tisch um 90° und wiederholen Sie das Hacken.
- Zentrifugieren Sie die Fragmente bei 300 × g für 3 Minuten. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.
- Inkubieren Sie die Fragmente mit einem fluoreszierenden Zelltracker, CM-DiI (Endkonzentration von 10 μg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung [DPBS]), Deep Red (Endkonzentration von 1 μl/ml in DPBS) oder CellTrace (Endkonzentration von 5 μM in DPBS) für 30 Minuten und legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C warmes Wasserbad.
- Resuspendieren Sie die Fragmente, indem Sie alle 10 Minuten vorsichtig auf und ab pipettieren.
HINWEIS: Im Falle von CellTrace fügen Sie am Ende der Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Medium hinzu, das mindestens 1 % Protein enthält. - Bei 300 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x mit 1 ml DPBS, um nicht eingearbeiteten Farbstoff zu entfernen.
- Suspendieren Sie die Fragmente in 5 ml DPBS in einer 60-mm-Petrischale.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht austrocknet.
5. Etablierung von zPDX
Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.
- Betäuben Sie die Embryonen 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) mit 0,16 mg/ml Tricain in E3-Zebrafischmedium.
- Legen Sie drei Agarosezylinder (Schritt 1.1.3) in eine Petrischale und legen Sie einen Zebrafischembryo auf einen Zylinder, wobei Sie eine Seite freilegen. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, um den Embryo in einem dünnen Film zu halten.
- Übertragen Sie das gefärbte Gewebestück mit einer sterilen Pinzette aus der Petrischale auf den 1%igen Agaroseträger, auf dem der Embryo liegt. Nehmen Sie das Gewebe auf, legen Sie es auf das Embryonalgelb und schieben Sie es dann mit der wärmegezogenen Glasmikronadel in den perivitellinen Raum (Schritt 1.2.1).
- Geben Sie vorsichtig einige Tropfen E3 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) in den Embryo, um ihn wieder in die Flüssigkeit zu bringen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4 für alle Embryonen, entfernen Sie schließlich die Agarosestützen aus der Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen bei 35 °C.
- Kontrollieren Sie die Embryonen 2 h nach der Implantation mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die richtigen Xenotransplantate (positive Färbung). Verwerfen Sie die Embryonen mit Tumorfragmenten, die sich nicht vollständig im perivitellinen Raum befinden, sowie die toten Embryonen. Verteilen Sie die Embryonen nach dem Zufallsprinzip auf sechs Multi-Well-Platten (maximal n = 20 Embryonen/Well), die gemäß dem Versuchsplan gleichmäßig in Gruppen aufgeteilt werden (z. B. Kontrolle und FOLFOXIRI).
6. Behandlung
- Verdünnen Sie das Arzneimittel (z. B. 5-Fluorouracil, Oxaliplatin, Irinotecan) in E3 1% Pen-Streptokokken und mischen Sie es gründlich, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Wie von Usai et al.12 vorgeschlagen, verwenden Sie eine fünffache Verdünnung des Arzneimittels im Fischwasser in Bezug auf die äquivalente Plasmakonzentration (EPC).
- Mischen Sie die Drogen, um den Cocktail zuzubereiten (z. B. FOLFOXIRI).
- Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie den Medikamentencocktail 2 Stunden nach der Implantation hinzu.
- Behandeln Sie die Embryonen 3 Tage lang. Erneuern Sie den Drogencocktail jeden Tag.
7. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung
Anmerkungen: Bevor Sie beginnen, stellen Sie Aceton auf -20 °C ein und bereiten Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen vor.
- Tag 1:
- Fixieren Sie die Larven mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd in Glasfläschchen bei 4 °C über Nacht.
- Tag 2:
- Waschen Sie die Larven 3 x 5 min mit 1 ml PBS unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
- In 1 ml 100%igem Methanol bei -20 °C über Nacht lagern (oder zur Langzeitlagerung).
- Rehydrieren Sie 3 x 10 min mit 1 ml PTw (0,1 % Tween in PBS) unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
- Permeabilisieren Sie mit 1 ml 150 mM Tris-HCl bei pH 8,8 für 5 min bei RT, gefolgt von einer Erhitzung für 15 min bei 70 °C.
- 2 x 10 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.
- 2 x 5 min mit 1 ml dH2O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.
- Mit 1 ml eiskaltem Aceton für 20 min bei -20 °C permeabilieren.
- 2 x 5 min mit 1 ml dH2O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.
- 2 x 5 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.
- Inkubieren Sie die Larven in 1 ml Blockierpuffer für 3 h bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).
- Platzieren Sie die Larven in Vertiefungsplatten, die nach Gruppen wie folgt unterteilt sind: 10 Larven in 50 μl Volumen/Vertiefung in einer 96-Well-Platte oder 20 Larven in 100 μl Volumen/Vertiefung in einer 48-Well-Platte.
- Verwerfen Sie den Blockierungspuffer, inkubieren Sie die Larven mit einer primären Antikörperlösung (z. B. Kaninchen-Anti-Human-Caspase-3, 1:250), die in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C im Dunkeln verdünnt ist, und schaukeln Sie vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumes.
- Tag 3:
- Waschen Sie die Larven nacheinander 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS (10% Ziegenserum, 1% Triton X-100 in PBS) und dann mit 2 x 10 min mit 1 mL PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) und 2 x 1 h mit 1 mL PBS-TS. Rühren Sie bei jedem Waschgang die Platten mit den Larven vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min).
- Inkubation der Larven mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Goat anti-Rabbit IgG [H+L] cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) und 100 μg/ml Hoechst 33258 verdünnt in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumina der sekundären Antikörperlösung.
- Tag 4:
- Waschen Sie 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS und 2 x 1 h mit 1 mL PTw, unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min).
- Erzeugen Sie mit dem Zahnschmelz eine kreisförmige Schicht (Dicke von ~0,5-1 mm) auf Objektträgern. Lassen Sie den Zahnschmelz austrocknen und legen Sie die Larven in die Mitte der kreisförmigen Schicht, wobei die Seite des Xenotransplantats freigelegt wird.
- Trocknen Sie die überschüssige Lösung und montieren Sie das Glasdeckglas mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Eindeckmedium.
8. Bildgebung
- Nehmen Sie Bilder unter konfokaler Mikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv auf. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Auflösung von 1024 x 512 Pixeln mit einem Z-Abstand von 5 μm.
9. Analyse der Apoptose durch ImageJ
- Laden Sie (Fiji Is Just) ImageJ-Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) und öffnen Sie das Z-Stack-Dateiimage (klicken Sie auf Datei | Offen). Wählen Sie im Popup-Fenster Stack-Ansicht/Hyperstack aus und klicken Sie auf OK.
- Überlagern Sie die verschiedenen Kanäle, indem Sie Bild | Farbe | Komposit erstellen.
- Ziehen Sie den Z-Balken am unteren Rand des Bildes, um durch das Z-Stapelbild zu blättern und den Xenotransplantatbereich zu identifizieren (Zellen, die Fluoreszenzzell-Tracker-positiv sind. Siehe Schritt 4.5) im perivitellinen Raum des Zebrafisches.
- Wählen Sie das Punktwerkzeug aus, und zählen Sie die Anzahl der apoptotischen menschlichen Zellen (positiver bis fluoreszierender Zelltracker und gespaltene Caspase-3), wie im ergänzenden Video S1 gezeigt.
- Doppelklicken Sie auf das Symbol des Punktwerkzeugs , ändern Sie den Zähler und zählen Sie die Gesamtzahl der menschlichen Zellkerne (Kerne von CM-DiI-positiven Zellen).
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Ansatz zur Etablierung von zPDXs aus dem primären humanen Pankreas-Adenokarzinom. Eine Tumorprobe wurde entnommen, zerkleinert und mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben. Die zPDXs wurden dann erfolgreich durch Implantation eines Tumorstücks in den perivitellinen Raum von 2 dpf-Zebrafischembryonen etabliert, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben. Wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben, wurden die zPDXs weiter gescreent, um die Chemotherapie-Sensitivitätsprofile von patienteneigenen Krebszellen zu identifizieren. So wurde beispielsweise die Chemotherapie-Kombination FOLFOXIRI (5-Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin und Irinotecan) getestet, da sie als Erstlinien-Chemotherapie bei fortgeschrittenem duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse und bei metastasierendem Dickdarmkrebs eingesetzt wird. Whole-Mount-Bilder der zPDXs wurden als Z-Stacks auf dem konfokalen Mikroskop aufgenommen, und die Apoptose-Induktion wurde wie in den Protokollabschnitten 8 und 9 beschrieben analysiert. Wie in Abbildung 1A,B dargestellt, führte die kombinierte Therapie im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer Zunahme der Zellapoptose. In der hier berichteten Fallstudie wurde für die mit FOLFOXIRI behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ein statistisch signifikanter Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen in implantierten Xenotransplantaten identifiziert (Abbildung 1C).
| Abbildung 1: zPDXs aus humanem duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse 3 Tage nach der Behandlung mit FOLFOXIRI. Die Zellmembranen wurden mit CM-DiI (rot) gefärbt und das Gewebe wurde in den perivitellinen Raum von 2 dpf AB Wildtyp-Zebrafischen xenotransplantiert. Die Larven wurden 3 Tage lang einer FOLFOXIRI-Kombination (0,216 mg/ml 5-Fluorouracil, 0,013 mg/ml Folinsäure, 0,006 mg/ml Oxaliplatin, 0,011 mg/ml Irinotecan) oder nicht exponiert (CTRL), fixiert und mit gespaltenem Caspase-3-Antikörper (cyan) immungefärbt und mit Hoechst gegengefärbt (blaue Kerne). Die Larven wurden mit Aqua Poly-Mount in Glasobjektträger montiert. (A1-3) Repräsentatives Beispiel einer Kontrolllarve (keine Chemotherapie ausgesetzt). Es wurden keine gespaltenen Caspase-3-positiven Zellen beobachtet. (B1-3) Repräsentatives Beispiel einer xenotransplantierten Larve 3 Tage nach der Behandlung mit FOLFOXIRI, die eine konsistente Aktivierung der gespaltenen Caspase-3 zeigt. Die Bilder der gesamten Montierung wurden mit einem konfokalen Nikon A1-Mikroskop mit einer Digitalkamera aufgenommen. Die gestrichelten Linien zeigen die Xenotransplantatbereiche. (C) Quantifizierung von gespaltenen Caspase-3- und CM-DiI-Doppel-positiven Zellen in xenotransplantierten Larven, die mit FOLFOXIRI im Vergleich zu CTRL behandelt wurden, aufgetragen als Mittelwert ± REM (n ≥ 12); p < 0,001, Mann-Whitney-U-Test. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: zPDX = von Zebrafischpatienten abgeleitetes Xenotransplantat; dpf = Tage nach der Befruchtung; FOLFOXIRI = 5-Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin und Irinotecan; STRG = Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. |
| Lösung/Medium | Komposition, Kommentare | Zweck | ||
| Tumormedium (1x) | Dem RPMI-1640-Medium wird Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 100 U/ml) und Amphotericin (Endkonzentration 2,50 μg/ml) zugesetzt. | |||
| E3 Zebrafisch mittel (1x) | Das 60x E3 Embryomedium (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) wird in deionisiertem Wasser auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 1x verdünnt. | |||
| E3 1% Pen-Streptokokken | Fügen Sie 1 ml Penicillin-Streptomycin zu 99 ml E3-Zebrafischmedium hinzu. Mischen durch Umkehrung. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C | |||
| Ptw | 0,1 % Tween in PBS | Whole-Mount-Immunfärbung | ||
| Puffer blockieren | 10 % Ziegenserum, 1 % DMSO, 1 % BSA, 0,8 % Triton X-100 in PTw | Whole-Mount-Immunfärbung | ||
| Inkubationspuffer | 1 % Ziegenserum, 1 % DMSO, 1 % BSA, 0,8 % Triton X-100 in PTw | Whole-Mount-Immunfärbung | ||
| PBS-TS | 10% Ziegenserum, 1% Triton X-100 in PBS | Whole-Mount-Immunfärbung | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 in PBS | Whole-Mount-Immunfärbung | ||
Tabelle 1: Lösungen und Medien, die im Protokoll verwendet werden.
Ergänzende Abbildung S1: Die PDAC-Tumorprobe wurde DiO-gefärbt (grün) und in den perivitellinen Raum von 2 dpf-Zebrafischembryonen xenotransplantiert. Nach einer 3-tägigen Inkubationszeit wurden den zPDXs 2 μg/ml Propidiumiodid (PI; rot) injiziert und anschließend einer konfokalen 3D-Bildgebung unterzogen. Die Zellviabilität wurde überprüft, indem PI-positive Zellen aus der Gesamtzahl der humanen Zellen (DiO-positiv) gemessen wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: PDAC = duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse; dpf = Tage nach der Befruchtung; zPDX = von Zebrafisch-Patienten abgeleitetes Xenotransplantat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video S1: Beispiel für die apoptotische Zählung menschlicher Zellen unter Verwendung des Mehrpunktwerkzeugs von ImageJ. Das Video zeigt einen Z-Stack eines zPDX 3 Tage nach der Implantation, der nach gespaltener Caspase-3 und Hoechst 33258 Immunfärbung aufgenommen wurde. Abkürzungen: zPDX = von Zebrafischpatienten abgeleitetes Xenotransplantat. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
In-vivo-Modelle in der Krebsforschung bieten unschätzbare Werkzeuge, um die Krebsbiologie zu verstehen und das Ansprechen auf die Krebsbehandlung vorherzusagen. Aktuell stehen verschiedene In-vivo-Modelle zur Verfügung, zum Beispiel gentechnisch veränderte Tiere (transgene und Knockout-Mäuse) oder patienteneigene Xenotransplantate aus menschlichen Primärzellen. Trotz vieler optimaler Funktionen hat jede von ihnen verschiedene Einschränkungen. Insbesondere fehlt den oben genannten Modellen eine zuverlässige Möglichkeit, die Mikroumgebung des Tumorgewebes des Patienten nachzuahmen.
Es wurde vermutet, dass die Tumormikroumgebung viele wichtige Rollen beim Ansprechen auf Medikamente spielen könnte18. Um ein geeignetes Tiermodell zu finden, das die Mikroumgebung des Tumorgewebes aufrechterhält, wurde daher ein alternatives PDX-Modell entwickelt, bei dem Stücke von Tumorgewebe verwendet werden, die in 2 dpf Zebrafischembryonen xenotransplantiert wurden. Das Protokoll beschreibt, wie Xenotransplantate in einer großen Anzahl von Embryonen durchgeführt werden können, was das Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten sowohl als Einzelwirkstoffe als auch in Kombinationen ermöglicht.
Der Kernpunkt dieses innovativen Ansatzes ist, dass er sowohl Zell-Zell-Interaktionen als auch die Tumormikroumgebung im Vergleich zu den üblicherweise durchgeführten zPDXs mit Einzelzellsuspensionen bewahrt. Der PDAC aus einer chirurgischen Probe wird sofort in frisches und kaltes Tumormedium gegeben und der Tumor in kleine Fragmente zerkleinert. Das Gesamtverfahren, das zur Generierung des zPDX-Modells verwendet wird, basiert auf der direkten Implantation eines Fragments aus dem Tumor eines Patienten in den perivitellinen Raum eines 2-dpf-Zebrafischembryos.
Das vorgeschlagene Modell könnte als Alternative zum PDX-Modell dienen, das auf dem Aufschluss der patienteneigenen Tumorgewebeprobe basiert, gefolgt von einer direkten Injektion in den Dottersack oder in den perivitellinen Raum. Wie die Arbeit von Fior et al. zeigt, ist es möglich, ein zAvatar-Modell aus der enzymatischen Dissektion von operativ resezierten Pankreaskarzinomen zu etablieren. Die Implantationsrate lag zwischen 44 % und 64 %, was auf die typische geringe Zellularität der Tumor-Pankreasprobe und das ungünstige dichte desmoplastische Stroma zurückzuführenist 19.
Die Zellsuspension reproduzierte den ursprünglichen Tumor jedoch nur teilweise14. Umgekehrt ähnelt der mPDX, der durch die direkte Transplantation von Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse konstruiert wird, dem ursprünglichen Tumor am besten, was Ärzten helfen kann, das Tumorverhalten besser zu verstehen und das individuelle Ansprechen vor der Behandlung zu bewerten20. Tatsächlich erhält das kleine, transplantierte Fragment die Mikroumgebung des Tumors aufrecht und bewahrt die Wechselwirkung zwischen bösartigen und gesunden Zellen, ähnlich wie beim ursprünglichen Tumor21. Die Chemosensitivität bzw. Chemoresistenz wird somit besser reproduziert, mit einem direkten Einfluss der zPDX-Technologie auf den Bereich der translationalen Onkologie14. Der zPDX-Ansatz ermöglicht es jedem Patienten, seinen eigenen Tumor in einem lebenden System entwickeln zu lassen. Dies stellt somit eine gute Alternative zur Verwendung von mPDX dar, bei der das Tumorgewebe intakt orthotransplantiert oder in Zellen disaggregiert wird, die dann in Mausempfängermodelle xenotransplantiert werden13.
Dieses Protokoll wurde in Zusammenarbeit mit Pathologen entwickelt, die für die Auswahl der am besten geeigneten Tumorstücke für die Transplantation verantwortlich sind. Biologische Gewebeproben wurden immer aus der chirurgischen Probe und nie aus einer Biopsie entnommen, da letztere in der Regel durch einen Mangel an Gewebe gekennzeichnet ist und daher nur für diagnostische Zwecke bestimmt ist. Das Kriterium für die Gewebeentnahme ist in der Regel nicht marginal versus core, sondern ein Tumorbereich, der frei von Blutungen und Nekrosen ist. Aus diesem Grund wurde zur unmittelbaren Qualitätskontrolle des Materials immer ein histologischer Kryostatschnitt auf einer Hälfte der Probe durchgeführt. Die vorliegende Studie könnte durch die Fähigkeit der primären Tumorzellen, sich in den perivitellinen Raum von Zebrafischembryonen einzunisten, eingeschränkt werden. 3 Tage nach der Transplantation wurde jedoch eine Transplantationsrate von 80 % lebensfähigem Gewebe beobachtet, sowohl nach Lagerung bei 4 °C (12/15 Fälle) als auch nach dem Auftauen von -80 °C (10/12 Fälle), was darauf hindeutet, dass der Tumor mit einer Zellviabilität von 74 % ± 2 % effektiv kryokonserviert werden kann (ergänzende Abbildung S1). Trotzdem variiert die Erfolgsrate der Gewebetransplantation zwischen verschiedenen PDAC-Patiententumoren. Folglich kann die schnelle Verarbeitung des Gewebes kurz nach der chirurgischen Resektion sowie die Verhinderung des Einfrierens die Effizienz steigern.
Im Protokoll werden auch einige technische Hilfsmittel für erfolgreiche Xenotransplantate vorgeschlagen. Zum Beispiel standardisierte der Einsatz des Häckslers die Abmessungen der xenotransplantierten Stücke. Um zu überprüfen, ob die Stücke des Tumorgewebes nach dem Zerkleinern gleich groß sind, besteht eine mögliche Lösung darin, den Durchmesser der Fragmente vor der Xenotransplantation mit einem Kalibrierglas zu messen.
Die Verwendung der 1%igen Agarose-Zylinderstütze ist sowohl für die einseitige Ablage der Embryonen als auch für die einfache Implantation eines Tumorstücks sowie für die Verhinderung eines Bruchs der Mikronadel unerlässlich. Da Tumore eine hohe Variabilität aufweisen, besteht eine weitere Einschränkung der Methode darin, dass die intratumorale Heterogenität in einem Fragment im Vergleich zu einer zellulären Suspension weniger repräsentiert ist. Tatsächlich könnten kleine Gewebestücke in Form von gutartigen Zellpopulationen und Tumorsubklonen auseinanderlaufen. Um diese Kritik zu überwinden, sollte eine hohe Anzahl injizierter Embryonen verwendet werden, um die Tumorheterogenität zu rekapitulieren und die Variabilität in der Analyse zu reduzieren. Gemäß der statistischen Analyse benötigt jede Gruppe einen Stichprobenumfang von mehr als 15 unter Berücksichtigung einer Effektstärke von d = 2 und einer Trennschärfe von 80 % und 95 % statistischer Signifikanz. Diese Zahl ist angemessen, da ein erfahrener Bediener etwa 40 Embryonen pro Stunde verarbeiten kann.
Neben der Methodik, die zur Generierung des zPDX-Modells verwendet wurde, konnte hier auch gezeigt werden, dass eine FOLFOXIRI-Kombination die Apoptose von patienteneigenen Zellen im zPDX-Modell induziert. Wie bei FOLOFOXIRI ist es möglich, die zPDX-Chemosensitivität gegenüber anderen Chemotherapieschemata zu testen, wie z. B. die von Usai et al.11 erfolgreich getesteten.
Darüber hinaus wird die Technik der Whole-Mount-Immunfärbung und Bildgebung vorgestellt, um die Quantifizierung des interessierenden Merkmals zu ermöglichen. Um einige Probleme zu überwinden und zu einer erfolgreichen Whole-Mount-Immunfärbung zu führen, wird eine 5%ige DMSO-Lösung empfohlen, um das Gewebe zu permeabilisieren. In Bezug auf die konfokale Bildgebung könnten die Auflösungsbeschränkungen des konfokalen Mikroskops die Erfassung der tieferen Stapel der xenotransplantierten Larven beeinträchtigen. In der Studie werden jedoch die apoptotischen Zellen aus der Gesamtzahl der Patientenzellen herausgezählt. Eine dreidimensionale Rekonstruktion von der Basis bis zur Spitze der implantierten Tumormasse mit einer Schrittweite von 5 μm ermöglicht die Identifizierung aller menschlichen Zellkerne unter Berücksichtigung der Wahrscheinlichkeit, dass sich derselbe Zellkern innerhalb der vorherigen oder nächsten Z-Ebene ausbreitet. Folglich kann der ImageJ-Mehrpunkt-Werkzeugzähler verwendet werden, um die doppelte Zählung derselben Zelle zu kontrollieren und zu verhindern und Doppelzählungen in denselben Z-Stapeln (apoptotisch aus der Gesamtzahl der menschlichen Zellen) durchzuführen und die Apoptose auf Einzelzellebene leicht zu verfolgen.
Trotz seiner Einschränkungen hat das zPDX-Modell mehrere Vorteile im Vergleich zu In-vivo-Modellen : den extrem schnellen Lebenszyklus von Zebrafischen, der in der Lage ist, eine große Anzahl von Tieren in kurzer Zeit zu erhalten; die optische Klarheit in den Entwicklungsstadien; und vor allem die extrem geringen ethischen Auswirkungen im Zeitfenster22 von 0-120 h nach der Düngung. Heute ist eine koklinische Studie mit zPDXs kostengünstiger als eine mit mausbasierten PDXs, da immundefiziente Wirtsstämme hohe Wartungskosten sowie komplexe bildgebende Verfahren zur Überwachung des Tumorwachstums erfordern23. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass all diese Faktoren das Potenzial des zPDX-Modells für den Einsatz in koklinischen Studien zur Vorhersage der Chemotherapie-Sensitivitätsprofile von Krebspatienten und für die Verwendung durch Forscher, die an neuartigen Modellen für das Wirkstoffscreening interessiert sind, unterstreichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Fondazione Pisa gefördert (Projekt 114/16). Die Autoren danken Raffaele Gaeta von der Abteilung für Histopathologie der Azienda Ospedaliera Pisana für die Auswahl der Patientenproben und die Unterstützung bei der Pathologie. Wir danken auch Alessia Galante für die technische Unterstützung bei den Experimenten. Dieser Artikel basiert auf der Arbeit von COST Action TRANSPAN, CA21116, unterstützt von COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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