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Cancer Research

Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.

Abstract

Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde et l’incidence de nombreux types de cancer continue d’augmenter. Beaucoup de progrès ont été réalisés en termes de dépistage, de prévention et de traitement; Cependant, les modèles précliniques qui prédisent le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer font encore défaut. Pour combler cette lacune, un modèle de xénogreffe in vivo dérivé de patients a été développé et validé. Le modèle était basé sur des embryons de poisson zèbre (Danio rerio) 2 jours après la fécondation, qui ont été utilisés comme receveurs de fragments de xénogreffe de tissu tumoral prélevés sur l’échantillon chirurgical d’un patient.

Il convient également de noter que les échantillons bioptiques n’ont pas été digérés ou désagrégés, afin de maintenir le microenvironnement tumoral, ce qui est crucial en termes d’analyse du comportement tumoral et de la réponse au traitement. Le protocole détaille une méthode pour établir des xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre à partir de la résection chirurgicale primaire de tumeur solide. Après criblage par un anatomopathologiste, le spécimen est disséqué à l’aide d’une lame de scalpel. Les tissus nécrotiques, les vaisseaux ou les tissus adipeux sont enlevés, puis coupés en morceaux de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

Les morceaux sont ensuite marqués par fluorescence et xénotransplantés dans l’espace périvitellin des embryons de poisson zèbre. Un grand nombre d’embryons peuvent être traités à faible coût, ce qui permet des analyses in vivo à haut débit de la chimiosensibilité des zPDX à plusieurs médicaments anticancéreux. Des images confocales sont systématiquement acquises pour détecter et quantifier les niveaux apoptotiques induits par le traitement de chimiothérapie par rapport au groupe témoin. La procédure de xénogreffe présente un avantage de temps significatif, car elle peut être achevée en une seule journée, offrant une fenêtre de temps raisonnable pour effectuer un dépistage thérapeutique pour les essais cocliniques.

Introduction

L’un des problèmes de la recherche clinique sur le cancer est que le cancer n’est pas une maladie unique, mais une variété de maladies différentes qui peuvent évoluer au fil du temps, nécessitant des traitements spécifiques en fonction des caractéristiques de la tumeur elle-même et du patient1. Par conséquent, le défi consiste à s’orienter vers une recherche sur le cancer axée sur le patient, afin d’identifier de nouvelles stratégies personnalisées pour la prédiction précoce des résultats du traitement du cancer2. Ceci est particulièrement pertinent pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), car il est considéré comme un cancer difficile à traiter, avec un taux de survie à 5 ans de 11%3.

Le diagnostic tardif, la progression rapide et le manque de thérapies efficaces demeurent les problèmes cliniques les plus urgents de l’ACPE. Le principal défi est donc de modéliser le patient et d’identifier les biomarqueurs qui peuvent être appliqués en clinique pour sélectionner la thérapie la plus efficace en ligne avec la médecine personnalisée 4,5,6. Au fil du temps, de nouvelles approches ont été proposées pour modéliser les maladies cancéreuses : les organoïdes dérivés de patients (AOP) et les xénogreffes dérivées de souris (mPDX) provenaient d’une source de tissu tumoral humain. Ils ont été utilisés pour reproduire la maladie afin d’étudier la réponse et la résistance au traitement, ainsi que la récurrence de la maladie 7,8,9.

De même, l’intérêt pour les modèles de xénogreffe dérivée de patients (zPDX) à base de poisson zèbre a augmenté, grâce à leurs caractéristiques uniques et prometteuses10, représentant un outil rapide et peu coûteux pour la recherche sur le cancer11,12. Les modèles zPDX ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon tumoral, ce qui rend possible le dépistage à haut débit de la chimiothérapie13. La technique la plus couramment utilisée pour les modèles zPDX est basée sur la digestion complète de l’échantillon et l’implantation des populations cellulaires primaires, ce qui reproduit partiellement la tumeur, mais présente les inconvénients d’un manque de microenvironnement tumoral et de diaphonie entre cellules malignes et saines14.

Ce travail montre comment les zPDX peuvent être utilisés comme modèle préclinique pour identifier le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer du pancréas. La stratégie précieuse facilite le processus de xénogreffe, car il n’y a pas besoin d’expansion cellulaire, ce qui permet d’accélérer le dépistage de la chimiothérapie. La force du modèle est que tous les composants du microenvironnement sont maintenus tels quels dans le tissu cancéreux du patient, car, comme on le sait, le comportement de la tumeur dépend de leur interaction15,16. Ceci est très favorable aux méthodes alternatives dans la littérature, car il est possible de préserver l’hétérogénéité tumorale et de contribuer à améliorer la prévisibilité du résultat du traitement et de la rechute d’une manière spécifique au patient, permettant ainsi au modèle zPDX d’être utilisé dans les essais cocliniques. Ce manuscrit décrit les étapes impliquées dans la fabrication du modèle zPDX, en commençant par un morceau de résection tumorale du patient et en le traitant pour analyser la réponse à la chimiothérapie.

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Protocol

Le ministère italien de la Santé publique a approuvé toutes les expérimentations animales décrites, conformément à la directive 2010/63/UE sur l’utilisation et les soins des animaux. Le comité d’éthique local a approuvé l’étude, sous le numéro d’enregistrement 70213. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets concernés. Avant de commencer, toutes les solutions et l’équipement doivent être préparés (section 1) et les poissons doivent être croisés (section 2).

1. Préparation des solutions et des équipements

REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les solutions et les supports à préparer.

  1. Support de gel d’agarose
    1. Peser la poudre d’agarose dans une fiole micro-ondable et la dissoudre dans un volume donné de milieu de poisson zèbre E3 pour obtenir un gel à 1%. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
      REMARQUE: Ne pas trop faire bouillir la solution.
    2. Versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri et attendez que le gel se soit complètement solidifié.
    3. Fabriquer de petites bouteilles d’agarose (~5 mm de haut) à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique dont l’embout est coupé. Une fois préparé, conserver dans une boîte de Petri à 4 °C enveloppée dans du papier d’aluminium.
  2. Micro-aiguilles en verre
    1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté avec un extracteur pour obtenir de fines aiguilles (réglages: HEAT 990, PULL 550).
      NOTE: A partir d’un capillaire, il est possible d’obtenir deux fines aiguilles d’un diamètre de pointe de 10 μm.

2. Croisement des poissons et collecte des œufs

  1. Transférer les poissons adultes dans des bassins de reproduction 3 jours avant l’implantation tissulaire, comme décrit par Avdesh et al.17.
  2. REMARQUE : Un ratio de 1:1 ou 2:3 hommes/femmes est recommandé. La densité de poisson devrait être de cinq poissons maximum par litre d’eau. Gardez les mâles et les femelles séparés par une barrière pendant la nuit.
  3. Le lendemain, enlevez la barrière et laissez les poissons s’accoupler.
  4. Retirez les poissons des bassins d’élevage et ramenez-les dans leurs bassins d’hébergement.
  5. Versez l’eau du bassin d’élevage à travers un filet à mailles fines. Transférer les œufs fécondés dans une boîte de Petri avec milieu de poisson zèbre E3.
  6. Vérifiez la boîte de Petri avec un stéréomicroscope et jetez les œufs troubles. Conserver les œufs fécondés dans un milieu de poisson zèbre E3 frais à 28 °C.

3. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Pinces autoclaves et poignée de scalpel.

  1. Traitement immédiat
    1. Prélever l’échantillon chirurgical de tumeur dans 10 mL de milieu tumoral à 4 °C (échantillon tumoral allant de 5 mm à 10 mm de diamètre). Transférer l’échantillon à 4 °C de l’emplacement souhaité pour un traitement immédiat.
  2. Stockage pendant la nuit (facultatif)
    1. Prélever l’échantillon de tumeur chirurgicale dans 10 mL de milieu tumoral et conserver l’échantillon pendant la nuit à 4 °C.
  3. Stockage à -80 °C (facultatif, le moins recommandé)
    1. Conserver l’échantillon à -80 °C dans un flacon cryogénique en milieu tumoral supplémenté en diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 %.

4. Traitement des échantillons

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

  1. Laver tout le tissu tumoral avec 5 ml de milieu tumoral frais, en pipetant de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Aspirer et jeter le produit de lavage. Répétez cette étape 3x.
    REMARQUE: Évitez l’aspiration du tissu tumoral car il pourrait rester attaché à la pipette Pasteur en plastique.
  2. Transférer l’échantillon dans une boîte de Petri et l’immerger dans 1-2 mL de milieu tumoral frais. Couper l’échantillon tumoral en petits morceaux (1-2 mm3) à l’aide d’une lame de scalpel et les placer dans un tube en plastique stérile de 5 ml avec milieu tumoral.
  3. Réglez le hacheur à papier tissu McIlwain sur une épaisseur de 100 μm. Placez les fragments d’échantillon sur la table circulaire en plastique du hachoir et hachez-les. Faites pivoter la table de 90° et répétez le hachage.
  4. Centrifuger les fragments à 300 × g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et jetez-le.
  5. Incuber les fragments avec un traqueur cellulaire fluorescent, CM-DiI (concentration finale de 10 μg/mL dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentration finale de 1 μL/mL dans DPBS) ou CellTrace (concentration finale de 5 μM dans DPBS) pendant 30 min, en plaçant le tube dans un bain-marie à 37 °C.
  6. Remettez les fragments en suspension en les pipiquant doucement de haut en bas toutes les 10 minutes.
    REMARQUE: Dans le cas de CellTrace, ajouter un milieu contenant au moins 1% de protéines à la fin de l’incubation, selon les instructions du fabricant.
  7. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape 3x avec 1 mL de DPBS pour éliminer le colorant non incorporé.
  8. Suspendre les fragments dans 5 mL de DPBS dans une boîte de Petri de 60 mm.
    REMARQUE: Assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas.

5. Mise en place de zPDX

REMARQUE: Effectuez les étapes sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire stérile.

  1. Anesthésier les embryons 2 jours après la fécondation (dpf) avec 0,16 mg/mL de tricaïne dans un milieu de poisson zèbre E3.
  2. Mettez trois cylindres d’agarose (étape 1.1.3) dans une boîte de Petri et déposez un embryon de poisson zèbre sur un cylindre, en exposant un côté. Retirez l’excès de solution pour garder l’embryon dans un film mince.
  3. Transférer le morceau de tissu coloré avec une pince stérile de la boîte de Petri au support d’agarose à 1% où se trouve l’embryon. Ramassez le tissu, placez-le sur le jaune d’embryon, puis poussez-le dans l’espace périvitellin à l’aide de la micro-aiguille en verre tiré thermiquement (étape 1.2.1).
  4. Ajouter doucement quelques gouttes de pénicilline-streptomycine E3 1% (Pen-Strep) à l’embryon pour le ramener dans le liquide.
  5. Répétez les étapes 5.2-5.4 pour tous les embryons, et enfin, retirez les supports d’agarose de la boîte de Petri et incuber les embryons à 35 °C.
  6. Vérifiez les embryons pour les xénogreffes correctes (coloration positive) 2 h après l’implantation à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Jetez les embryons avec des fragments tumoraux qui ne sont pas complètement à l’intérieur de l’espace périvitellin, ainsi que les embryons morts. Répartir au hasard les embryons dans six plaques multipuits (maximum n = 20 embryons/puits), également divisées en groupes selon le plan expérimental (p. ex., témoin et FOLFOXIRI).

6. Traitement

  1. Diluer le médicament (p. ex. 5-fluorouracile, oxaliplatine, irinotécan) dans E3 1% Pen-Strep, en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Comme proposé par Usai et coll.12, utiliser une dilution quintuple du médicament dans l’eau du poisson, par rapport à la concentration plasmatique équivalente (CPE).
  2. Mélanger les médicaments pour préparer le cocktail (par ex. FOLFOXIRI).
  3. Retirer le média de chaque puits et ajouter le cocktail de médicaments 2 h après l’implantation.
  4. Traiter les embryons pendant 3 jours. Renouvelez le cocktail de médicaments tous les jours.

7. Coloration immunofluorescente à montage entier

REMARQUE : Avant de commencer, placer l’acétone à -20 °C et préparer les solutions indiquées dans le tableau 1.

  1. Jour 1 :
    1. Fixer les larves avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans des flacons en verre à 4 °C pendant la nuit.
  2. Jour 2 :
    1. Laver les larves 3 x 5 min avec 1 mL de PBS, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 rpm).
    2. Conserver dans 1 mL de méthanol à 100 % à -20 °C pendant la nuit (ou pour un entreposage à long terme).
    3. Réhydrater 3 x 10 min avec 1 mL de PTw (0,1 % d’interpolation dans PBS), en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    4. Perméabiliser avec 1 mL de Tris-HCl 150 mM à pH 8,8 pendant 5 min à TA, puis chauffer pendant 15 min à 70 °C.
    5. Laver 2 x 10 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    6. Laver 2 x 5 min avec 1 mL dedH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    7. Perméabiliser avec 1 mL d’acétone glacée pendant 20 min à -20 °C.
    8. Laver 2 x 5 min avec 1 mL dedH2O, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    9. Laver 2 x 5 min avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    10. Incuber les larves dans 1 mL de tampon bloquant pendant 3 h à 4 °C, en agitant doucement sur une bascule de plate-forme de laboratoire (400 tr/min).
    11. Placer les larves dans des plaques de puits divisées par groupe comme suit : 10 larves dans 50 μL de volume/puits dans une plaque de 96 puits ou 20 larves dans 100 μL de volume/puits dans une plaque de 48 puits.
    12. Jeter le tampon de blocage, incuber les larves avec une solution d’anticorps primaires (p. ex. caspase-3 clivée anti-humain de lapin, 1:250) diluée dans un tampon d’incubation pendant une nuit à 4 °C dans l’obscurité, et balancer doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés.
  3. Jour 3 :
    1. Laver les larves séquentiellement 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS (10% de sérum de chèvre, 1% de Triton X-100 dans PBS) puis, avec 2 x 10 min avec 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 dans PBS) et 2 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS. À chaque lavage, agiter délicatement les plaques contenant les larves sur une plaque vibrante (400 tr/min).
    2. Incuber les larves avec des anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent (p. ex. anticorps secondaire adsorbé croisé IgG [H+L] anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 647, 1:500) et 100 μg/mL Hoechst 33258 dilué dans un tampon d’incubation dans l’obscurité pendant une nuit à 4 °C, en agitant doucement sur une plaque agitatrice (400 tr/min). Voir l’étape 7.2.11 pour les volumes recommandés de solution d’anticorps secondaires.
  4. Jour 4 :
    1. Laver 3 x 1 h avec 1 mL de PBS-TS et 2 x 1 h avec 1 mL de PTw, en agitant doucement sur une plaque vibrante (400 tr/min).
    2. Créez une couche circulaire avec l’émail (épaisseur de ~0,5-1 mm) sur des lames de microscope. Laissez l’émail sécher et placez les larves au centre de la couche circulaire, exposant le côté de la xénogreffe.
    3. Sécher l’excès de solution et monter la lamelle de couverture en verre avec un support de montage soluble dans l’eau et non fluorescent.

8. Imagerie

  1. Capturez des images sous microscopie confocale avec un objectif 40x. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants : une résolution de 1024 x 512 pixels avec un espacement Z de 5 μm.

9. Analyse de l’apoptose par ImageJ

  1. Chargez le logiciel ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) et ouvrez l’image du fichier Z-stack (cliquez sur Fichier | Ouvert). Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Affichage de la pile/Hyperstack et cliquez sur OK.
  2. Superposez les différents canaux en sélectionnant Image | Couleur | Faire composite.
  3. Faites glisser la barre Z au bas de l’image pour parcourir l’image Z-stack et identifier la zone de xénogreffe (cellules qui sont fluorescentes tracker positives. Voir étape 4.5) dans l’espace périvitelline du poisson zèbre.
  4. Sélectionnez Point Tool et comptez le nombre de cellules humaines apoptotiques (positif au tracker cellulaire fluorescent et à la caspase clivée-3), comme indiqué dans la vidéo supplémentaire S1.
  5. Double-cliquez sur l’icône Point Tool , changez le compteur et comptez le nombre total de noyaux de cellules humaines (noyaux de cellules CM-DiI positives).

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Representative Results

Ce protocole décrit l’approche expérimentale pour établir des zPDX à partir d’adénocarcinome pancréatique humain primaire. Un échantillon de tumeur a été recueilli, haché et coloré à l’aide d’un colorant fluorescent, comme décrit dans la section 4 du protocole. Les zPDX ont ensuite été établis avec succès par implantation d’un morceau de tumeur dans l’espace périvitelline de 2 embryons de poisson-zèbre dpf, comme décrit dans la section 5 du protocole. Comme décrit dans la section 6 du protocole, les zPDX ont été examinés plus avant pour identifier les profils de sensibilité à la chimiothérapie des cellules cancéreuses dérivées du patient. Par exemple, l’association de chimiothérapie FOLFOXIRI (5-fluorouracile, acide folinique, oxaliplatine et irinotécan) a été testée, car elle est utilisée comme chimiothérapie de première intention pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique avancé et le cancer colorectal métastatique. Des images entières des zPDX ont été acquises sous forme de piles Z au microscope confocal, et l’induction de l’apoptose a été analysée comme décrit dans les sections 8 et 9 du protocole. Comme le montre la figure 1A, B, la thérapie combinée a entraîné une augmentation de l’apoptose cellulaire par rapport au groupe témoin. Dans l’étude de cas rapportée ici, une augmentation statistiquement significative de la fraction de cellules apoptotiques dans les xénogreffes implantées a été identifiée pour le groupe traité par FOLFOXIRI par rapport au groupe témoin (Figure 1C).

Figure 1

Figure 1 : zPDX de l’adénocarcinome canalaire pancréatique humain 3 jours après le traitement par FOLFOXIRI. Les membranes cellulaires ont été colorées avec CM-DiI (rouge) et le tissu a été xénogreffé dans l’espace périvitellin de 2 dpf AB poisson zèbre de type sauvage. Les larves ont été exposées à une combinaison FOLFOXIRI (0,216 mg/mL de 5-fluorouracile, 0,013 mg/mL d’acide folinique, 0,006 mg/mL d’oxaliplatine, 0,011 mg/mL d’irinotécan) ou non exposées (CTRL) pendant 3 jours, fixées et immunocolorées avec un anticorps clivé de caspase-3 (cyan) et contre-colorées par Hoechst (noyaux bleus). Les larves ont été montées avec Aqua Poly-Mount dans des lames de microscope en verre. (A1-3) Exemple représentatif d’une larve témoin (non exposée à la chimiothérapie). Aucune cellule clivée caspase-3-positive n’a été observée. (B1-3) Exemple représentatif d’une larve xénogreffée 3 jours après le traitement par FOLFOXIRI, montrant une activation constante de la caspase-3 clivée. Les images à monture entière ont été capturées sur un microscope confocal Nikon A1 avec un appareil photo numérique. Les lignes pointillées montrent les zones de xénogreffe. (C) Quantification des cellules doubles positives de caspase-3 clivé et de CM-DiI chez les larves xénogreffées traitées par FOLFOXIRI par rapport au CTRL, tracées en moyenne ± MEB (n ≥ 12); p < 0,001, test U de Mann-Whitney. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : zPDX = xénogreffe dérivée du poisson zèbre; DPF = jours après la fécondation; FOLFOXIRI = 5-fluorouracile, acide folinique, oxaliplatine et irinotécan; CTRL = contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Solution/support Composition, commentaires But
Milieu tumoral (1x) Au milieu RPMI-1640, ajouter de la pénicilline-streptomycine (concentration finale de 100 U/mL) et de l’amphotéricine (concentration finale de 2,50 μg/mL).
E3 poisson zèbre moyen (1x) Diluer le milieu embryonnaire E3 60x (NaCl 3 M, KCl0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) dans de l’eau désionisée jusqu’à une concentration finale de travail de 1x.
E3 1% Pen-streptocoque Ajouter 1 mL de pénicilline-streptomycine à 99 mL de milieu de poisson zèbre E3. Mélanger par inversion. Conserver la solution à 4 °C
Ptw 0,1 % préadolescent dans PBS Immunomarquage à montage entier
Blocage du tampon 10% sérum de chèvre, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 dans PTw Immunomarquage à montage entier
Tampon d’incubation 1% sérum de chèvre, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 dans PTw Immunomarquage à montage entier
PBS-TS 10% sérum de chèvre, 1% Triton X-100 dans PBS Immunomarquage à montage entier
PBS-T 1% Triton X-100 dans PBS Immunomarquage à montage entier

Tableau 1 : Solutions et supports utilisés dans le protocole.

Figure supplémentaire S1 : L’échantillon tumoral de PDAC a été coloré DiO (vert) et xénogreffé dans l’espace périvitellin de 2 embryons de poisson zèbre dpf.Après un temps d’incubation de 3 jours, les zPDX ont été injectés avec 2 μg/mL d’iodure de propidium (PI; rouge), puis soumis à une imagerie confocale 3D. La viabilité cellulaire a été vérifiée en mesurant les cellules PI-positives sur le nombre total de cellules humaines (DiO positif). Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : PDAC = adénocarcinome canalaire pancréatique; DPF = jours après la fécondation; zPDX = xénogreffe dérivée de patients de poisson zèbre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire S1 : Exemple de comptage apoptotique de cellules humaines, à l’aide de l’outil multipoint d’ImageJ. La vidéo est une pile Z d’un zPDX 3 jours après l’implantation, acquis après immunomarquage de la caspase-3 clivée et du Hoechst 33258. Abréviations : zPDX = xénogreffe dérivée de patients de poisson zèbre. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Les modèles in vivo dans la recherche sur le cancer fournissent des outils inestimables pour comprendre la biologie du cancer et prédire la réponse au traitement du cancer. Actuellement, différents modèles in vivo sont disponibles, par exemple, des animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockout) ou des xénogreffes dérivées de patients à partir de cellules primaires humaines. Malgré de nombreuses caractéristiques optimales, chacune a des limites différentes. En particulier, les modèles susmentionnés manquent d’un moyen fiable d’imiter le microenvironnement du tissu tumoral du patient.

Il a été suggéré que le microenvironnement tumoral peut jouer de nombreux rôles importants dans la réponse aux médicaments18. Par conséquent, pour trouver un modèle animal approprié qui maintient le microenvironnement du tissu tumoral, un modèle PDX alternatif a été développé, en utilisant des morceaux de xénogreffe de tissu tumoral dans 2 embryons de poisson zèbre dpf. Le protocole décrit comment effectuer des xénogreffes dans un grand nombre d’embryons, permettant le criblage à haut débit de médicaments, à la fois en agents uniques et en combinaison.

Le point clé de cette approche innovante est qu’elle préserve à la fois les interactions cellule-cellule et le microenvironnement tumoral, par rapport aux zPDX couramment pratiqués avec des suspensions unicellulaires. Le PDAC d’un échantillon chirurgical est immédiatement placé dans un milieu tumoral frais et froid, et la tumeur est coupée en petits fragments. La procédure globale utilisée pour générer le modèle zPDX est basée sur l’implantation directe d’un fragment de la tumeur d’un patient dans l’espace périvitellin d’un embryon de poisson-zèbre 2 dpf.

Le modèle proposé pourrait servir d’alternative au modèle PDX basé sur la digestion de l’échantillon de tissu tumoral dérivé du patient, suivie d’une injection directe dans le sac vitellin ou dans l’espace périvitelline. Comme en témoignent les travaux de Fior et al., il est possible d’établir un modèle zAvatar à partir de la dissection enzymatique de cancers pancréatobilaires réséqués chirurgicalement. Le taux d’implantation variait entre 44% et 64%, en raison de la faible cellularité typique de l’échantillon pancréatique tumoral et du stroma desmoplastique densedéfavorable 19.

Cependant, la suspension cellulaire n’a que partiellement reproduit la tumeurd’origine 14. Inversement, le mPDX, construit en transplantant directement du tissu tumoral dans des souris immunodéficientes, ressemble le mieux à la tumeur d’origine, ce qui peut mieux aider les cliniciens à comprendre le comportement tumoral et à évaluer les réponses individuelles avant le traitement20. En fait, le petit fragment greffé maintient le microenvironnement tumoral et préserve la diaphonie entre les cellules malignes et saines, semblable à la tumeuroriginale 21. La chimiosensibilité ou chimiorésistance est ainsi mieux reproduite, avec un impact direct de la technologie zPDX dans le domaine de l’oncologie translationnelle14. L’approche zPDX permet à chaque patient d’avoir sa propre tumeur développée dans un système vivant. Ainsi, cela représente une bonne alternative à l’utilisation de mPDX, où le tissu tumoral est orthogreffé intact ou désagrégé en cellules, qui sont ensuite xénogreffées dans des modèles de sourisreceveuses 13.

Ce protocole a été développé en collaboration avec des pathologistes chargés de sélectionner les pièces tumorales les plus appropriées pour la transplantation. Les échantillons de tissus biologiques ont toujours été prélevés sur l’échantillon chirurgical et jamais sur une biopsie, car cette dernière est généralement caractérisée par une rareté de tissu et est donc destinée uniquement à des fins diagnostiques. Le critère d’échantillonnage tissulaire n’est généralement pas marginal par rapport au noyau, mais plutôt une zone tumorale dépourvue d’hémorragie et de nécrose. Pour cette raison, une coupe histologique cryostatique a toujours été réalisée sur la moitié de l’échantillon pour un contrôle de qualité immédiat du matériau. La présente étude pourrait être limitée par la capacité des cellules tumorales primaires à se greffer dans l’espace périvitellin des embryons de poisson zèbre. Cependant, un taux de greffe de 80% de tissu viable a été observé 3 jours après la transplantation, à la fois après stockage à 4 °C (12/15 cas) et décongelé à partir de -80 °C (10/12 cas), suggérant que la tumeur peut être efficacement cryoconservée, avec une viabilité cellulaire de 74% ± 2% (Figure supplémentaire S1). Malgré cela, le taux de réussite de la greffe de tissu varie entre les différentes tumeurs des patients PDAC; Par conséquent, le traitement rapide du tissu peu de temps après la résection chirurgicale, ainsi que la prévention du gel, peuvent améliorer l’efficacité.

Certains expédients techniques sont également suggérés dans le protocole pour les xénogreffes réussies. Par exemple, l’utilisation du hachoir a normalisé les dimensions des pièces xénogreffées. Pour vérifier que les morceaux de tissus tumoraux sont de dimension égale après le hachage, une solution potentielle consiste à utiliser un verre d’étalonnage pour mesurer le diamètre des fragments avant la xénotransplantation.

L’utilisation du support de cylindre d’agarose à 1% est essentielle à la fois pour la pose des embryons d’un côté et l’implantation simple d’un morceau de tumeur, ainsi que pour éviter de casser la micro-aiguille. Parce que les tumeurs présentent une grande variabilité, une autre limitation de la méthode est que l’hétérogénéité intratumorale est moins représentée dans un fragment par rapport à une suspension cellulaire. En fait, de petits morceaux de tissu pourraient diverger en termes de populations cellulaires bénignes et de sous-clones tumoraux. Pour surmonter cette critique, un nombre élevé d’embryons injectés devrait être utilisé pour récapituler l’hétérogénéité tumorale et réduire la variabilité de l’analyse. Selon l’analyse statistique, chaque groupe nécessite une taille d’échantillon supérieure à 15, compte tenu d’une taille d’effet de d = 2, et d’une puissance de signification statistique de 80% et 95%. Ce nombre est raisonnable, car un opérateur expert peut traiter environ 40 embryons par heure.

En plus de la méthodologie utilisée pour générer le modèle zPDX, il a également été démontré ici qu’une combinaison FOLFOXIRI induit l’apoptose des cellules dérivées du patient dans le modèle zPDX. Comme avec FOLFOXIRI, il est possible de tester la chimiosensibilité zPDX à d’autres schémas de chimiothérapie, tels que ceux testés avec succès par Usai et al.11.

En outre, la technique d’immunomarquage et d’imagerie à montage entier est présentée pour fournir la quantification de la caractéristique d’intérêt. Pour surmonter certains problèmes et conduire à une immunomarquage réussie à montage entier, une solution de DMSO à 5% est recommandée pour perméabiliser les tissus. En ce qui concerne l’imagerie confocale, les limitations de résolution du microscope confocal pourraient nuire à l’acquisition des piles plus profondes des larves xénogreffées. Cependant, dans l’étude, les cellules apoptotiques sont comptées sur le nombre total de cellules du patient. Une reconstruction tridimensionnelle de la base au sommet de la masse tumorale implantée, avec une taille de pas de 5 μm, permet d’identifier tous les noyaux humains, compte tenu de la probabilité que le même noyau puisse se propager dans le plan Z précédent ou suivant. Par conséquent, le compteur d’outils multipoints ImageJ peut être utilisé pour contrôler et empêcher le comptage de la même cellule deux fois et pour effectuer un double comptage dans les mêmes piles Z (apoptotique sur le total des cellules humaines) et peut facilement tracer l’apoptose au niveau de la cellule unique.

Malgré ses limites, le modèle zPDX présente plusieurs avantages par rapport aux modèles in vivo : le cycle de vie extrêmement rapide du poisson zèbre, capable d’obtenir un grand nombre d’animaux en peu de temps ; la clarté optique dans les étapes de développement; et, surtout, l’impact éthique extrêmement faible dans la fenêtre temporelle 0-120 h après la fécondation22. Aujourd’hui, un essai coclinique utilisant des zPDX est moins cher que celui mené avec des PDX à base de souris, car les souches hôtes immunodéficientes nécessitent un coût d’entretien élevé ainsi que des méthodes d’imagerie complexes pour surveiller la croissance tumorale23. En conclusion, tous ces facteurs mettent en évidence le potentiel du modèle zPDX pour une utilisation dans les essais cocliniques pour prédire les profils de sensibilité à la chimiothérapie des patients atteints de cancer et pour une utilisation par les chercheurs intéressés par de nouveaux modèles de dépistage de médicaments.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la Fondazione Pisa (projet 114/16). Les auteurs tiennent à remercier Raffaele Gaeta de l’unité d’histopathologie de l’Azienda Ospedaliera Pisana pour la sélection des échantillons de patients et le soutien en pathologie. Nous remercions également Alessia Galante pour le soutien technique dans les expériences. Cet article est basé sur les travaux de COST Action TRANSPAN, CA21116, soutenus par COST (Coopération européenne en science et technologie).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

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References

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Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité
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Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

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