Summary
Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.
Abstract
O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e a incidência de muitos tipos de câncer continua aumentando. Muito se avançou em termos de rastreio, prevenção e tratamento; no entanto, ainda faltam modelos pré-clínicos que predizem o perfil quimiossensível de pacientes com câncer. Para preencher essa lacuna, um modelo de xenoenxerto derivado do paciente in vivo foi desenvolvido e validado. O modelo foi baseado em embriões de zebrafish (Danio rerio) aos 2 dias pós-fecundação, os quais foram utilizados como receptores de fragmentos de xenoenxerto de tecido tumoral retirados da peça cirúrgica de uma paciente.
Vale ressaltar também que as amostras bióticas não foram digeridas ou desagregadas, a fim de manter o microambiente tumoral, o que é crucial para analisar o comportamento tumoral e a resposta à terapia. O protocolo detalha um método para estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) baseados em peixe-zebra a partir da ressecção cirúrgica de tumor sólido primário. Após triagem por um anatomopatologista, o espécime é dissecado com lâmina de bisturi. Tecido necrótico, vasos ou tecido adiposo são removidos e, em seguida, picados em pedaços de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
As peças são então marcadas fluorescentemente e xenotransplantadas para o espaço perivitelino de embriões de peixe-zebra. Um grande número de embriões pode ser processado a baixo custo, permitindo análises in vivo de alto rendimento da quimiossensibilidade de zPDXs a múltiplas drogas anticâncer. Imagens confocais são rotineiramente adquiridas para detectar e quantificar os níveis apoptóticos induzidos pelo tratamento quimioterápico em comparação com o grupo controle. O procedimento de xenoenxerto tem uma vantagem de tempo significativa, uma vez que pode ser concluído em um único dia, proporcionando uma janela de tempo razoável para realizar uma triagem terapêutica para ensaios co-clínicos.
Introduction
Um dos problemas da pesquisa clínica do câncer é que o câncer não é uma doença única, mas uma variedade de doenças diferentes que podem evoluir ao longo do tempo, exigindo tratamentos específicos dependendo das características do próprio tumor e do paciente1. Consequentemente, o desafio é avançar em direção à pesquisa do câncer orientada ao paciente, a fim de identificar novas estratégias personalizadas para a predição precoce dos resultados do tratamento do câncer2. Isso é particularmente relevante para o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), por ser considerado um câncer de difícil tratamento, com sobrevida em 5 anos de 11%3.
O diagnóstico tardio, a rápida progressão e a falta de terapias eficazes continuam sendo os problemas clínicos mais prementes da ADP. O principal desafio é, portanto, modelar o paciente e identificar biomarcadores que possam ser aplicados na clínica para selecionar a terapia mais eficaz de acordo com a medicina personalizada 4,5,6. Ao longo do tempo, novas abordagens têm sido propostas para modelar doenças oncológicas: organoides derivados do paciente (PDOs) e xenoenxertos derivados do paciente de camundongo (mPDXs) originados de uma fonte de tecido tumoral humano. Eles têm sido usados para reproduzir a doença para estudar a resposta e a resistência à terapia, bem como a recorrência da doença 7,8,9.
Da mesma forma, o interesse em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (zPDX) baseado em peixe-zebra tem aumentado, graças às suas características únicas epromissoras10, representando uma ferramenta rápida e de baixo custo para a pesquisa docâncer11,12. Os modelos zPDX requerem apenas um pequeno tamanho de amostra tumoral, o que torna viável o rastreamento de quimioterapiaem alto rendimento13. A técnica mais comumente utilizada para modelos zPDX baseia-se na digestão completa da amostra e implantação das populações celulares primárias, que reproduz parcialmente o tumor, mas tem como desvantagens a falta de microambiente tumoral e crosstalk entre células malignas esaudáveis14.
Este trabalho mostra como zPDXs podem ser usados como um modelo pré-clínico para identificar o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer de pâncreas. A valiosa estratégia facilita o processo de xenoenxerto, uma vez que não há necessidade de expansão celular, permitindo a aceleração da triagem quimioterápica. A força do modelo é que todos os componentes do microambiente são mantidos como estão no tecido do paciente com câncer, pois, como se sabe, o comportamento do tumor depende de sua interação15,16. Isso é altamente favorável em relação aos métodos alternativos na literatura, pois é possível preservar a heterogeneidade tumoral e contribuir para melhorar a previsibilidade do resultado do tratamento e a recidiva de forma paciente-específica, permitindo que o modelo zPDX seja utilizado em ensaios coclínicos. Este artigo descreve as etapas envolvidas na confecção do modelo zPDX, começando com um pedaço de ressecção tumoral do paciente e tratando-o para analisar a resposta à quimioterapia.
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Protocol
O Ministério da Saúde Pública italiano aprovou todas as experiências com animais descritas, em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE relativa à utilização e aos cuidados a prestar aos animais. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local, sob o registro número 70213. Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos envolvidos. Antes de começar, todas as soluções e equipamentos devem ser preparados (secção 1) e os peixes devem ser cruzados (secção 2).
1. Preparação de soluções e equipamentos
NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter as soluções e os meios a serem preparados.
- Suporte em gel de agarose
- Pesar o pó de agarose num balão micro-ondulável e dissolvê-lo num determinado volume de meio de zebrafish E3 para fazer um gel a 1%. Aqueça no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.
NOTA: Não sobreferva a solução. - Despeje a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até que o gel se solidifique completamente.
- Faça pequenos cilindros de agarose (~5 mm de altura) usando uma pipeta plástica Pasteur com a ponta cortada. Depois de preparado, armazenar em uma placa de Petri a 4 °C envolto em papel alumínio.
- Pesar o pó de agarose num balão micro-ondulável e dissolvê-lo num determinado volume de meio de zebrafish E3 para fazer um gel a 1%. Aqueça no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.
- Microagulhas de vidro
- Puxe os capilares de vidro borossilicato com um extrator para obter agulhas finas (configurações: HEAT 990, PULL 550).
OBS: A partir de um capilar, é possível obter duas agulhas finas com diâmetro de ponta de 10 μm.
- Puxe os capilares de vidro borossilicato com um extrator para obter agulhas finas (configurações: HEAT 990, PULL 550).
2. Cruzamento de peixes e coleta de ovos
- Transferir peixes adultos para tanques de reprodução 3 dias antes da implantação do tecido, conforme descrito por Avdesh et al.17.
- NOTA: Recomenda-se uma proporção de 1:1 ou 2:3 machos para fêmeas. A densidade de peixes deve ser de, no máximo, cinco peixes por litro de água. Mantenha machos e fêmeas separados com uma barreira durante a noite.
- No dia seguinte, remova a barreira e deixe o peixe acasalar.
- Retire os peixes dos tanques de reprodução e devolva-os aos tanques de alojamento.
- Despeje a água do tanque de reprodução através de uma rede de malha fina. Transfira os ovos fertilizados para uma placa de Petri com meio de zebrafish E3.
- Verifique a placa de Petri com um estereomicroscópio e descarte os ovos turvos. Manter os ovos fertilizados em meio fresco de zebrafish E3 a 28 °C.
3. Coleta de espécimes
OBS: Pinça de autoclave e cabo de bisturi.
- Processamento imediato
- Coletar a peça cirúrgica do tumor em 10 mL de meio tumoral a 4 °C (espécime tumoral variando de 5 mm a 10 mm de diâmetro). Transfira a amostra a 4 °C do local desejado para processamento imediato.
- Armazenamento durante a noite (opcional)
- Coletar o espécime cirúrgico do tumor em 10 mL de meio tumoral e armazenar a amostra durante a noite a 4 °C.
- Armazenamento a -80 °C (opcional, menos recomendado)
- Conservar a amostra a -80 °C num frasco para injetáveis criogénico com meio tumoral suplementado com 5% de dimetilsulfóxido (DMSO).
4. Processamento da amostra
NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.
- Lavar todo o tecido tumoral com 5 mL de meio tumoral fresco, pipetando para cima e para baixo 10x usando uma pipeta plástica de Pasteur. Aspirar e descartar o meio de lavagem. Repita esta etapa 3x.
NOTA: Evitar a aspiração do tecido tumoral, pois este poderia permanecer aderido à pipeta plástica de Pasteur. - Transfira a amostra em uma placa de Petri e mergulhe-a em 1-2 mL de meio tumoral fresco. Cortar a amostra tumoral em pequenos pedaços (1-2 mm3) com uma lâmina de bisturi e colocá-los em um tubo plástico estéril de 5 mL com meio tumoral.
- Ajuste o cortador de tecido McIlwain para 100 μm de espessura. Coloque os fragmentos do espécime na mesa circular de plástico do picador e pique-os. Gire a mesa em 90° e repita o corte.
- Centrifugar os fragmentos a 300 × g por 3 min. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e descartá-lo.
- Incubar os fragmentos com um rastreador de células fluorescentes, CM-DiI (concentração final de 10 μg/mL no soro fisiológico tamponada com fosfato de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentração final de 1 μL/mL em DPBS) ou CellTrace (concentração final de 5 μM em DPBS) por 30 min, colocando o tubo em banho-maria a 37 °C.
- Ressuspenda os fragmentos pipetando suavemente para cima e para baixo a cada 10 min.
NOTA: No caso de CellTrace, adicionar meio contendo pelo menos 1% de proteína no final da incubação, de acordo com as instruções do fabricante. - Centrifugar a 300 x g por 3 min e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa 3x com 1 mL de DPBS para remover o corante não incorporado.
- Suspender os fragmentos em 5 mL de DPBS em placa de Petri de 60 mm.
NOTA: Certifique-se de que o tecido não seca.
5. Criação do zPDX
NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.
- Anestesiar os embriões 2 dias pós-fertilização (dpf) com 0,16 mg/mL de tricaína em meio de zebrafish E3.
- Colocar três cilindros de agarose (passo 1.1.3) numa placa de Petri e colocar um embrião de peixe-zebra num cilindro, expondo um dos lados. Retire o excesso de solução para manter o embrião em apenas uma película fina.
- Transfira o pedaço de tecido corado com pinça estéril da placa de Petri para o suporte de agarose a 1% onde o embrião está deitado. Pegar no tecido, colocá-lo em cima da gema do embrião e, em seguida, empurrá-lo para o espaço perivitelino usando a microagulha de vidro puxada pelo calor (passo 1.2.1).
- Adicione suavemente algumas gotas de E3 1% penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) ao embrião para trazê-lo de volta ao líquido.
- Repetir os passos 5.2-5.4 para todos os embriões e, finalmente, remover os suportes de agarose da placa de Petri e incubar os embriões a 35 °C.
- Verificar os embriões quanto aos xenoenxertos corretos (coloração positiva) 2 h após a implantação utilizando um estereomicroscópio fluorescente. Descarte os embriões com fragmentos tumorais que não estejam completamente dentro do espaço perivitelino, assim como os embriões mortos. Distribuir aleatoriamente os embriões em seis placas multipoços (máximo n = 20 embriões/poço), igualmente divididos em grupos de acordo com o plano experimental (e.g., controle e FOLFOXIRI).
6. Tratamento
- Diluir o medicamento (por exemplo, 5-fluorouracila, oxaliplatina, irinotecano) em E3 1% Pen-Strep, misturando completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Conforme proposto por Usai et al.12, utilizar uma diluição de cinco vezes do fármaco na água do peixe, com relação à concentração plasmática equivalente (CPE).
- Misture os medicamentos para preparar o coquetel (por exemplo, FOLFOXIRI).
- Retire o meio de cada poço e adicione o coquetel de drogas 2 h após o implante.
- Tratar os embriões por 3 dias. Renove o coquetel de drogas todos os dias.
7. Coloração imunofluorescente de montagem total
NOTA: Antes de começar, colocar acetona a -20 °C e preparar as soluções indicadas no quadro 1.
- Dia 1:
- Fixar as larvas com 1 ml de paraformaldeído a 4% em frascos para injetáveis de vidro a 4 °C durante a noite.
- Dia 2:
- Lavar as larvas 3 x 5 min com 1 mL de PBS, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Conservar em 1 ml de metanol a 100% a -20 °C durante a noite (ou para armazenamento a longo prazo).
- Reidratar 3 x 10 min com 1 mL de PTw (0,1% de interpolação em PBS), agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Permeabilizar com 1 mL de Tris-HCl 150 mM pH 8,8 por 5 min em TR, seguido de aquecimento por 15 min a 70 °C.
- Lavar 2 x 10 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH2O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Permeabilizar com 1 mL de acetona gelada por 20 min a -20 °C.
- Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH2O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Lavar 2 x 5 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Incubar as larvas em 1 mL de tampão de bloqueio por 3 h a 4 °C, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
- Coloque as larvas em placas de poço divididas por grupo da seguinte forma: 10 larvas em 50 μL de volume/poço em uma placa de 96 poços ou 20 larvas em 100 μL de volume/poço em uma placa de 48 poços.
- Descarte o tampão de bloqueio, incube as larvas com solução primária de anticorpos (por exemplo, caspase-3 clivada anti-humana de coelho, 1:250) diluída em tampão de incubação durante a noite a 4 °C no escuro e balançar suavemente em uma placa agitadora (400 rpm). Consulte a etapa 7.2.11 para obter os volumes recomendados.
- Dia 3:
- Lavar as larvas sequencialmente 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS (10% de soro de cabra, 1% Triton X-100 em PBS) e, em seguida, com 2 x 10 min com 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 em PBS) e 2 x 1 h com 1 mL de PBS-TS. Em cada lavagem, agite suavemente as placas contendo as larvas em uma placa agitadora (400 rpm).
- Incubar as larvas com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente (por exemplo, Anticorpo Secundário Associado Cruzado IgG [H+L] de Cabra anti-Coelho, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluído em tampão de incubação no escuro durante a noite a 4 °C, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm). Ver passo 7.2.11 para volumes recomendados de solução de anticorpos secundários.
- Dia 4:
- Lavar 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS e 2 x 1 h com 1 mL de PTw, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm).
- Crie uma camada circular com o esmalte (espessura de ~0,5-1 mm) em lâminas de microscópio. Deixe o esmalte secar e coloque as larvas no centro da camada circular, expondo o lado do xenoenxerto.
- Seque o excesso de solução e monte a lamínula de vidro com um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente.
8. Exames por imagem
- Captura de imagens em microscopia confocal com objetiva de 40x. Use os seguintes parâmetros de aquisição: resolução de 1024 x 512 pixels com espaçamento Z de 5 μm.
9. Análise da apoptose pelo ImageJ
- Carregue o software ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e abra a imagem do arquivo Z-stack (clique em Arquivo | Aberto). Na janela pop-up, selecione Visualização de pilha/Hyperstack e clique em OK.
- Sobreponha os diferentes canais selecionando Imagem | Cor | Faça Composto.
- Arraste a barra Z na parte inferior da imagem para navegar pela imagem da pilha Z e identificar a área de xenoenxerto (células que são positivas para rastreador de células fluorescentes. Ver passo 4.5) no espaço perivitelina do peixe-zebra.
- Selecione Point Tool e conte o número de células humanas apoptóticas (positivo para fluorescente cell tracker e clived caspase-3), conforme mostrado no Vídeo Suplementar S1.
- Clique duas vezes no ícone da ferramenta Ponto , altere o contador e conte o número total de núcleos de células humanas (núcleos de células positivas para CM-DiI).
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Representative Results
Este protocolo descreve a abordagem experimental para o estabelecimento de zPDXs a partir de adenocarcinoma pancreático humano primário. Uma amostra tumoral foi coletada, picada e corada com corante fluorescente, conforme descrito na seção 4 do protocolo. zPDXs foram então estabelecidos com sucesso pela implantação de um pedaço de tumor no espaço perivitelino de 2 embriões de peixe-zebra dpf, conforme descrito na seção 5 do protocolo. Conforme descrito na seção 6 do protocolo, os zPDXs foram rastreados para identificar os perfis de sensibilidade à quimioterapia de células cancerosas derivadas do paciente. Por exemplo, a combinação quimioterápica FOLFOXIRI (5-fluorouracila, ácido folínico, oxaliplatina e irinotecano) foi testada, uma vez que é usada como quimioterapia de primeira linha para adenocarcinoma ductal de pâncreas avançado e em câncer colorretal metastático. Imagens completas dos zPDXs foram adquiridas como pilhas Z no microscópio confocal, e a indução de apoptose foi analisada conforme descrito nas seções 8 e 9 do protocolo. Como mostrado na Figura 1A,B, a terapia combinada levou a um aumento da apoptose celular em comparação com o grupo controle. No estudo de caso aqui relatado, identificou-se aumento estatisticamente significante da fração de células apoptóticas nos xenoenxertos implantados para o grupo tratado com FOLFOXIRI em relação ao grupo controle (Figura 1C).
| Figura 1: zPDXs de adenocarcinoma ductal pancreático humano 3 dias após o tratamento com FOLFOXIRI. As membranas celulares foram coradas com CM-DiI (vermelho) e o tecido foi xenoenxertado no espaço perivitelino de zebrafish selvagem 2 dpf AB. Larvas foram expostas a uma combinação de FOLFOXIRI (0,216 mg/mL 5-fluorouracil, 0,013 mg/mL ácido folínico, 0,006 mg/mL oxaliplatina, 0,011 mg/mL irinotecano) ou não expostas (CTRL) por 3 dias, fixadas e imunomarcadas com anticorpo clivado-3 caspase-3 (ciano) e contracoradas por Hoechst (núcleos azuis). As larvas foram montadas com Aqua Poly-Mount em lâminas de microscópio de vidro. (A1-3) Exemplo representativo de larva controle (não exposta à quimioterapia). Não foram observadas células clivadas positivas para caspase-3. (B1-3) Exemplo representativo de uma larva xenoenxertada 3 dias após o tratamento com FOLFOXIRI, mostrando ativação consistente da caspase-3 clivada. As imagens foram capturadas em microscópio confocal Nikon A1 com câmera digital. As linhas tracejadas mostram as áreas de xenoenxerto. (C) Quantificação de células duplamente positivas clivadas de caspase-3 e CM-DiI em larvas xenoenxertadas tratadas com FOLFOXIRI em comparação com CTRL, plotadas como média ± MEV (n ≥ 12); p < 0,001, teste U de Mann-Whitney. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: zPDX = xenoenxerto derivado do paciente com peixe-zebra; dpf = dias pós-fertilização; FOLFOXIRI = 5-fluorouracila, ácido folínico, oxaliplatina e irinotecano; CTRL = controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. |
| Solução/meio | Composição, comentários | Propósito | ||
| Meio tumoral (1x) | Ao meio RPMI-1640, adicionar penicilina-estreptomicina (concentração final 100 U/mL) e anfotericina (concentração final 2,50 μg/mL). | |||
| E3 zebrafish médio (1x) | Diluir o meio embrionário 60x E3 (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) em água deionizada até uma concentração final de trabalho de 1x. | |||
| E3 1% Pen-Strep | Adicionar 1 mL de penicilina-estreptomicina a 99 mL de meio de zebrafish E3. Mistura por inversão. Conservar a solução a 4 °C | |||
| Ptw | 0,1% de interpolação no PBS | Imunomarcação de montagem total | ||
| Buffer de bloqueio | 10% soro caprino, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 em PTw | Imunomarcação de montagem total | ||
| Tampão de incubação | 1% soro caprino, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 em PTw | Imunomarcação de montagem total | ||
| PBS-TS | 10% de soro de cabra, 1% Triton X-100 em PBS | Imunomarcação de montagem total | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 em PBS | Imunomarcação de montagem total | ||
Tabela 1: Soluções e meios utilizados no protocolo.
Figura Suplementar S1: A amostra tumoral do PDAC foi corada com DiO (verde) e xenoenxertada no espaço perivitelino de 2 embriões de zebrafish dpf. Após um tempo de incubação de 3 dias, zPDXs foram injetados com 2 μg/mL de iodeto de propídio (PI; vermelho) e, em seguida, submetidos a imagens confocais 3D. A viabilidade celular foi verificada medindo-se células PI-positivas do número total de células humanas (DiO positivo). Barra de escala = 100 μm. Abreviações: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático; dpf = dias pós-fertilização; zPDX = xenoenxerto derivado do paciente com peixe-zebra. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar S1: Exemplo de contagem de células humanas apoptóticas, usando a ferramenta multiponto do ImageJ. O vídeo é uma pilha Z de um zPDX 3 dias após o implante, adquirido após clivação da caspase-3 e imunomarcação Hoechst 33258. Abreviações: zPDX = xenoenxerto derivado do paciente com peixe-zebra. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Modelos in vivo na pesquisa do câncer fornecem ferramentas inestimáveis para entender a biologia do câncer e prever a resposta ao tratamento do câncer. Atualmente, diferentes modelos in vivo estão disponíveis, por exemplo, animais geneticamente modificados (camundongos transgênicos e knockout) ou xenoenxertos derivados de pacientes a partir de células primárias humanas. Apesar de muitas características ideais, cada um tem várias limitações. Em particular, os modelos acima mencionados carecem de uma maneira confiável de mimetizar o microambiente do tecido tumoral do paciente.
Tem sido sugerido que o microambiente tumoral pode desempenhar muitos papéis importantes na resposta adrogas18. Portanto, para encontrar um modelo animal adequado que mantenha o microambiente do tecido tumoral, um modelo alternativo de PDX foi desenvolvido, utilizando pedaços de tecido tumoral xenoenxertados em embriões de peixe-zebra 2 dff. O protocolo descreve como realizar xenoenxertos em um grande número de embriões, permitindo a triagem de drogas em alto rendimento, tanto como agentes isolados quanto em combinações.
O ponto chave dessa abordagem inovadora é que ela preserva tanto as interações célula-célula quanto o microambiente tumoral, em comparação com os zPDXs comumente realizados com suspensões de célula única. O ADP de uma peça cirúrgica é imediatamente colocado em meios tumorais frescos e frios, e o tumor é picado em pequenos fragmentos. O procedimento geral usado para gerar o modelo zPDX é baseado na implantação direta de um fragmento do tumor de um paciente no espaço perivitelino de um embrião de peixe-zebra de 2 dpf.
O modelo proposto poderia servir como uma alternativa ao modelo PDX baseado na digestão da amostra de tecido tumoral derivada do paciente, seguida de injeção direta no saco vitelínico ou no espaço perivitelino. Como evidenciado pelo trabalho de Fior et al., é possível estabelecer um modelo zAvatar a partir da dissecção enzimática de cânceres de pâncreas ressecados cirurgicamente. A taxa de implante variou entre 44% e 64%, devido à típica baixa celularidade da amostra pancreática tumoral e ao estroma desmoplásico densodesfavorável19.
Entretanto, a suspensão celular reproduziu apenas parcialmente o tumororiginal14. Por outro lado, a mPDX, construída pelo transplante direto de tecido tumoral em camundongos imunodeficientes, se assemelha melhor ao tumor original, o que pode ajudar melhor os clínicos a entender o comportamento do tumor e avaliar as respostas individuais antes do tratamento20. De fato, o pequeno fragmento enxertado mantém o microambiente tumoral e preserva o crosstalk entre células malignas e sadias, semelhante ao tumororiginal21. A quimiossensibilidade ou quimiorresistência é, assim, melhor reproduzida, com impacto direto da tecnologia zPDX no campo da oncologia translacional14. A abordagem zPDX permite que cada paciente tenha seu próprio tumor desenvolvido em um sistema vivo. Assim, isso representa uma boa alternativa ao uso da mPDX, onde o tecido tumoral é ortoenxertado intacto ou desagregado em células, que são então xenoenxertadas em modelos receptores decamundongos13.
Este protocolo foi desenvolvido em colaboração com patologistas que são responsáveis por selecionar as peças tumorais mais adequadas para transplante. Amostras de tecido biológico sempre foram retiradas da peça cirúrgica e nunca de uma biópsia, pois esta é geralmente caracterizada por escassez de tecido e, portanto, é destinada apenas para fins diagnósticos. O critério para amostragem de tecido geralmente não é marginal versus core, mas sim uma área tumoral desprovida de hemorragia e necrose. Por esse motivo, um corte histológico criostato foi sempre realizado em metade da amostra para controle imediato de qualidade do material. O presente estudo pode ser limitado pela capacidade das células tumorais primárias de enxertar no espaço perivitelino de embriões de zebrafish. Entretanto, observou-se taxa de enxertia de 80% de tecido viável 3 dias após o transplante, tanto após armazenamento a 4 °C (12/15 casos) quanto descongelado a -80 °C (10/12 casos), sugerindo que o tumor pode ser efetivamente criopreservado, com viabilidade celular de 74% ± 2% (Figura Suplementar S1). Apesar disso, a taxa de sucesso do enxerto tecidual varia entre os diferentes tumores de pacientes com ADP; Consequentemente, o rápido processamento do tecido logo após a ressecção cirúrgica, além de prevenir o congelamento, pode aumentar a eficiência.
Alguns expedientes técnicos também são sugeridos no protocolo para o sucesso dos xenoenxertos. Por exemplo, o uso do helicóptero padronizou as dimensões das peças xenoenxertadas. Para verificar se os pedaços de tecido tumoral são iguais em dimensão após o corte, uma solução potencial é usar um vidro de calibração para medir o diâmetro dos fragmentos antes do xenotransplante.
O uso do suporte do cilindro de agarose a 1% é essencial tanto para colocar os embriões de um lado quanto para simplesmente implantar um pedaço de tumor, bem como para evitar a quebra da microagulha. Como os tumores exibem uma alta variabilidade, outra limitação do método é que a heterogeneidade intratumoral é menos representada em um fragmento do que em uma suspensão celular. De fato, pequenos pedaços de tecido podem divergir em termos de populações de células benignas e subclones tumorais. Para superar essa crítica, um número elevado de embriões injetados deve ser usado para recapitular a heterogeneidade tumoral e reduzir a variabilidade na análise. De acordo com a análise estatística, cada grupo requer um tamanho amostral maior que 15, considerando um tamanho de efeito de d = 2, e um poder de 80% e 95% de significância estatística. Esse número é razoável, já que um operador especializado pode processar cerca de 40 embriões por hora.
Além da metodologia utilizada para gerar o modelo zPDX, também foi evidenciado aqui que uma combinação de FOLFOXIRI induz apoptose de células derivadas do paciente no modelo zPDX. Assim como no FOLFOXIRI, é possível testar a quimiossensibilidade do zPDX a outros esquemas quimioterápicos, como os testados com sucesso por Usai et al.11.
Além disso, a técnica de imunomarcação e imagem de montagem total é apresentada para fornecer a quantificação da característica de interesse. Para superar alguns problemas e levar ao sucesso da imunomarcação de montagem total, uma solução de DMSO a 5% é recomendada para permeabilizar os tecidos. Em relação à imagem confocal, as limitações de resolução do microscópio confocal poderiam prejudicar a aquisição das pilhas mais profundas das larvas xenoenxertadas. No entanto, no estudo, as células apoptóticas são contadas a partir do número total de células do paciente. Uma reconstrução tridimensional da base ao topo da massa tumoral implantada, com tamanho de passo de 5 μm, permite a identificação de todos os núcleos humanos, considerando a probabilidade de que um mesmo núcleo possa se espalhar dentro do plano Z anterior ou seguinte. Consequentemente, o contador de ferramentas multiponto ImageJ pode ser usado para controlar e impedir a contagem da mesma célula duas vezes e para executar a contagem dupla nas mesmas pilhas Z (apoptóticas do total de células humanas) e pode facilmente rastrear a apoptose no nível de célula única.
Apesar de suas limitações, o modelo zPDX apresenta diversas vantagens em relação aos modelos in vivo : o ciclo de vida extremamente rápido do peixe-zebra, sendo capaz de obter grande número de animais em um curto espaço de tempo; a clareza óptica nas etapas de desenvolvimento; e, sobretudo, o baixíssimo impacto ético na janela de tempo de 0-120 h pós-fertilização22. Atualmente, um ensaio co-clínico usando zPDXs é mais barato do que aquele conduzido com PDXs baseadas em camundongos, uma vez que cepas de hospedeiros imunodeficientes requerem alto custo de manutenção, bem como métodos de imagem complexos para monitorar o crescimento tumoral23. Em conclusão, todos esses fatores destacam o potencial do modelo zPDX para uso em ensaios co-clínicos para predizer os perfis de sensibilidade à quimioterapia de pacientes com câncer e para uso por pesquisadores interessados em novos modelos para rastreamento de drogas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fondazione Pisa (projeto 114/16). Os autores agradecem a Raffaele Gaeta, da Unidade de Histopatologia da Azienda Ospedaliera Pisana, pela seleção da amostra e apoio anatomopatológico. Agradecemos também a Alessia Galante pelo suporte técnico nos experimentos. Este artigo baseia-se no trabalho da COST Action TRANSPAN, CA21116, apoiado pela COST (Cooperação Europeia em Ciência e Tecnologia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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