Summary
Her beskriver vi en protokol, der kombinerer adeno-associeret virusinjektion med kranial vinduesimplantation til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus.
Abstract
Da hjernefunktioner er under kontinuerlig påvirkning af de signaler, der stammer fra perifert væv, er det afgørende at belyse, hvordan gliaceller i hjernen registrerer forskellige biologiske forhold i periferien og transmitterer signalerne til neuroner. Microglia, immunceller i hjernen, er involveret i synaptisk udvikling og plasticitet. Derfor bør mikroglia's bidrag til neurale kredsløbskonstruktioner som reaktion på kroppens indre tilstand testes kritisk ved intravital billeddannelse af forholdet mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet.
Her beskriver vi en teknik til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus. Adeno-associeret virus, der koder for R-CaMP, en genkodet calciumindikator for rødt fluorescensprotein, blev injiceret i lag 2/3 af den primære visuelle cortex i CX3CR1-EGFP transgene mus, der udtrykker EGFP i mikroglia. Efter viral injektion blev et kranievindue installeret på hjerneoverfladen i det injicerede område. In vivo to-foton-billeddannelse i vågne mus 4 uger efter operationen viste, at neural aktivitet og mikroglial dynamik kunne registreres samtidigt ved sub-sekund temporal opløsning. Denne teknik kan afdække koordineringen mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet, hvor førstnævnte reagerer på perifere immunologiske tilstande, og sidstnævnte koder for de indre hjernetilstande.
Introduction
Der er voksende tegn på, at kroppens indre tilstand konstant påvirker hjernefunktionerne hos dyr 1,2,3,4,5. For at få en dybere forståelse af hjernens funktioner er det derfor afgørende at belyse, hvordan gliaceller i hjernen overvåger biologiske forhold i periferien og videregiver informationen til neuroner.
Microglia, immunceller i hjernen, er involveret i synaptisk udvikling og plasticitet, som skulpturerer karakteristika for neurale kredsløb i hjernen 6,7,8,9. For eksempel viste pionerarbejdet af Wake et al., at mikrogliale processer kommer i kontakt med synapser på en neuronal aktivitetsafhængig måde i musens neocortex, og at kunstig iskæmi inducerer synapsetab efter langvarig kontakt med microglia10. Tremblay et al. fandt, at ændring af visuel oplevelse ændrer modaliteten af mikroglial interaktion med synapser. I den kritiske periode, hvor dendritisk rygsøjleomsætning i den primære visuelle cortex (V1) øges ved kikkertmangel, reducerer mørk tilpasning motiliteten af mikrogliale processer og øger både deres kontaktfrekvens med synaptiske kløfter og antallet af cellulære indeslutninger i mikroglia11. Disse resultater tyder på, at mikrogliale processer registrerer neural aktivitet og deres omgivende miljø for at ombygge neurale kredsløb. Desuden rapporterede en nylig undersøgelse, at mikroglial overvågning adskiller sig mellem vågne og bedøvede tilstande, hvilket tyder på vigtigheden af eksperimenter med vågne mus til undersøgelse af neuron-mikroglia-kommunikation under fysiologiske forhold12.
In vivo to-foton calciumbilleddannelse er et kraftfuldt værktøj til registrering af calciumdynamik, der afspejler igangværende neuronal fyring, i hundredvis af neuroner samtidigt i et levende dyr13,14,15. Calciumbilleddannelse i neuroner kræver generelt en tidsmæssig opløsning på mere end et par Hz for at spore hurtige neuronale reaktioner16,17. I modsætning hertil har tidligere undersøgelser, der sporer mikroglial dynamik, samplet mikrogliale strukturer ved en relativt lav tidsopløsning på mindre end 0.1 Hz18,19,20. En nylig undersøgelse anvendte samtidig to-foton-billeddannelse til at forstå neuron-mikroglia-kommunikation21. Det er dog stadig uklart, hvordan dynamiske mikrogliale processer reagerer på den omgivende neurale aktivitet ved en tidsmæssig opløsning på mere end et par Hz hos vågne mus. For at løse dette problem beskriver vi en samtidig in vivo to-foton-billeddannelsesmetode til neural aktivitet og mikroglial dynamik med en tidsmæssig opløsning højere end 1 Hz i vågne mus. Denne metode giver os mulighed for at opnå stabil billeddannelse hos vågne mus ved en højere billedhastighed (maksimalt 30 Hz med pixelrammestørrelsen på 512 x 512 pixels) og giver en mere gunstig måde at undersøge overvågningsadfærden hos microglia eller deres interaktion med neuronal aktivitet hos vågne mus.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af Animal Ethics Committee og Genetic Recombinant Experiment Safety Committee of Graduate School of Medicine og Det Medicinske Fakultet, University of Tokyo og udført i henhold til deres retningslinjer.
1. Forberedelse
- Steriliser alle instrumenter og apparater, der er nødvendige til operationen ved hjælp af autoklave eller 70% ethanol.
- Forberedelse af glaspipetter.
- En 75 μL kalibreret kapillær fastgøres fast til holderen af mikropipetteaftrækkeren. Indstil aftrækkeren til programmet med de anbefalede parametre som P (tryk) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.
- Efter afslutningen af programmet (normalt 4,5 til 5 s) er kapillæret opdelt i to glaspipetter med aftagende haler. Bryd derefter den distale del af halerne med pincet for at holde spidsdiameteren inden for 30-50 μm. Til dette skal du bryde halerne 1 cm distale til enden af den skrå del.
- Til kraniotomi fremstilles et kranievindue ved limning af en større ydre glasskive, 4 mm i diameter, 0,15 ± 0,02 mm i tykkelse, på en mindre indre glasskive, 2 mm i diameter, 0,525 ± 0,075 mm i tykkelse ved hjælp af et UV-lyshærdende reagens (figur 2A).
2. AAV injektion
- Fremstilling af injektionsapparatur
- En glaspipette forbundet til en 26 G Hamilton-sprøjte gennem et rør anbringes på en pipetteholder på et stereotaksisk instrument, og pipetteholderen vippes derefter 60° anteriort fra den lodrette akse (figur 1A,B).
- Fyld glaspipetten, sprøjten og forbindelsesrøret med flydende paraffin. Placer sprøjten på en mikroinjektor.
- Kirurgisk procedure
BEMÆRK: Følgende operation blev udført i en steriliseret kabine. Et stereomikroskop blev brugt til operationen, hvis det var nødvendigt.- Bedøv en CX3CR1-EGFP-hanmus (detaljerede oplysninger i materialetabellen) ved 7 til 8 uger gammel (legemsvægt 22-26 g) med 3% isofluran i et gastæt kammer. Efter 3 minutter tages musen ud af kammeret, når den mister frivillig bevægelse undtagen vejrtrækning, og skift derefter til kontinuerlig anæstesi med et næserør med 2% isofluran.
BEMÆRK: Isofluran er kendt for at aktivere mikroglia. Men da billeddiagnostikken udføres 4 uger efter operationen, er der ingen effekt af isofluran på musene under billeddannelsen. Selvom isoflurabedøvelse anvendes i et par minutter, når mus placeres i stereotaksisk instrument før billeddannelse (trin 4.2.1), fandt vi, at effekten af denne korte anæstesi er ubetydelig. - Under operationen skal musen holdes varm med en varmepude ved 37 °C for at forhindre hypotermi. Påfør øjensalve på begge øjne for at forhindre tørhed i hornhinden og administrer en meloxicaminjektion subkutant (5 mg/kg). Fastgør musen til en ekstra ørestang, og fastgør derefter musen på det stereotaksiske instrument med ryggen opad.
- Juster isoflurankoncentrationen til en passende procentdel (1%-2%) under operationen, mens åndedrættet og pulsen overvåges. Fjern håret med hårfjerningscreme og desinficer hovedet flere gange i en cirkulær bevægelse med både en jodbaseret eller chlorhexidinbaseret skrubbe og alkohol. Derefter injiceres 0,1 ml 1% lidokain subkutant og påføres sterile gardiner for at sikre det kirurgiske sted.
- Skær hovedbunden åben langs midterlinjen med en saks og gør snittet ca. 2 cm langt for at sikre en god eksponering af kraniet over den højre primære visuelle cortex. Efter snittet i hovedbunden skylles hovedet med saltvand gennem hele proceduren for at forhindre, at den udsatte kranium og hjerne tørrer.
- Fjern periosteum på den udsatte kraniet ved hjælp af tang. Bor kraniet på de stereotaksiske koordinater: 3 mm lateralt til midterlinjen, 0,5 mm foran lambdalinjen for at skabe et lille hul med ca. 0,5 mm diameter. Skyl om nødvendigt blod og vævsrester fra boret.
- Glaspipetten fyldes med 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 ved hjælp af følgende fremgangsmåde ved en titer på 8,3 x 1012 vektorgenomer/ml22.
- Før sprøjten frem for at skubbe 1 μL flydende paraffin ud af glaspipetten. Der anbringes et stykke gennemsigtig film, ca. 2 cm x 2 cm, på musens blottede kranium, og en dråbe på 1 μL AAV-opløsning udstødes på filmen ved hjælp af en pipettor.
- Anbring glaspipettespidsen i dråben AAV-opløsning på filmen, og træk forsigtigt sprøjten for at aspirere AAV-opløsningen. Efter udkastningen drejes den T-formede stophane for at frigøre trykket inde i røret og glaspipetten.
- Glaspipetten indsættes i en dybde på 500 μm fra hjerneoverfladen gennem hullet i trin 2.2.5, og derefter injiceres 0,5 μL AAV-opløsning ved hjælp af mikroinjektoren (figur 1C). Brug indsprøjtningsvolumenstrømningshastigheden på 2,0 μL/h; en injektion på 0,5 μL tager 15 min, og vent derefter i 5 min.
- Efter injektionen trækkes forsigtigt glaspipetten ud og skylles hjerneoverfladen med saltvand.
- Bedøv en CX3CR1-EGFP-hanmus (detaljerede oplysninger i materialetabellen) ved 7 til 8 uger gammel (legemsvægt 22-26 g) med 3% isofluran i et gastæt kammer. Efter 3 minutter tages musen ud af kammeret, når den mister frivillig bevægelse undtagen vejrtrækning, og skift derefter til kontinuerlig anæstesi med et næserør med 2% isofluran.
3. Kranial vinduesimplantation
BEMÆRK: Kranial vinduesimplantation følger AAV-injektionen samme dag.
- Marker en cirkel med en diameter på 2,5 mm på kraniet, centreret 3 mm sideværts fra lambdaen. Opret en cirkulær rille langs mærket på kraniet ved at bore. Rens snavs, da det kan påvirke kraniets synlighed negativt, og påfør saltvand under boreprocessen for at forhindre opvarmning.
- For at kontrollere, om boredybden i den cirkulære rille er tilstrækkelig til at fjerne det centrale kraniefragment, skal du forsigtigt trykke på det centrale kranium med tang. Hvis den bevæger sig lodret med ringe modstand, er boredybden tilstrækkelig.
- Når rillen når tilstrækkelig dybde, skal du indsætte spidsen af tangen i bunden af det centrale kraniefragment og forsigtigt løfte og fjerne det for at udsætte hjerneoverfladen (figur 1D).
- Brug en 27 G nål til at stikke og rive dura i kanten af den blottede hjerneoverflade. Indsæt spidsen af tangen gennem hullet lavet ved kanten af duraen. Hold dura og skræl det af for at udsætte hjernens overflade.
BEMÆRK: Hvis der opstår blødning, skylles hjerneoverfladen med saltvand, indtil blødningen stopper. - Brug tang til at sprede hæmostatiske fibre en efter en i saltvand i en 3,5 mm skål, og placer derefter de hæmostatiske fibre langs kanterne af hullet, hvor den transekterede dura er til stede.
- Placer et kranievindue, der er forberedt i trin 1.3, på den udsatte hjerneoverflade, og fastgør det derefter til kraniet med øjeblikkelig lim, mens du forsigtigt trykker på vinduet, så vinduet er i tæt kontakt med kraniet.
- Påfør derefter øjeblikkelig lim på hele det udsatte kranium, og fastgør derefter forsigtigt en hovedplade på kraniet, så vinduet lokaliseres i midten af hovedpladens firkantede hul (figur 2C). Sørg for, at hovedpladens overflade er parallel med glasvinduets overflade.
- Når limen er hærdet tilstrækkeligt, påføres tandcement på det udsatte kranium for at forstærke fastgørelsen mellem hovedet og hovedpladen (figur 2).
BEMÆRK: Hvis forsøgene omfatter præsentation af visuelle stimuli til mus, bør vildfarende lys til billedområdet undgås. Det tilrådes at sorte cementen ved at blande den med aktivt kul for at reducere lysrefleksion. - Træk musen ud af bedøvelsen, efter at cementen er hærdet tilstrækkeligt (ca. 20 min). Sæt derefter musen i et nyt bur for at komme sig alene.
- Efter at have bekræftet sin bevidsthed og frivillige bevægelse, hvilket indikerer fuld opsving, sæt musen tilbage i hjemmeburet. Under genopretningen skal du administrere en anden eller mere om nødvendigt meloxicamdosis (en gang hver 24. time i 1-3 dage), hvis der opstår åbenlys smerteindikerende adfærd.
4. In vivo to-foton billeddannelse af mikroglia og neuronal calcium dynamik
- Tilvænning af mus til mikroskopapparatet
- Tre uger efter operationen induceres anæstesi i musen med 3% isofluran, og musen indstilles under den 25x objektive linse i et to-fotonmikroskop ved hjælp af et specialfremstillet stereotaksisk instrument (figur 3C). Til opsætningen her er musen sat på toppen af et løbebånd og får lov til at løbe frit.
- Ca. 10 minutter senere skal du fjerne musen fra mikroskoptrinnet og returnere den til hjemmeburet. Gentag tilvænningen mindst 3 gange hver anden dag før to-foton-billedoptagelse.
- To-foton billedoptagelse
BEMÆRK: Vi anbefaler at udføre billedoptagelsen mere end 4 uger efter operationen, da mikroglial aktivering gradvist vender tilbage til basalniveauet.- Som i trin 4.1 induceres anæstesi i musen med 3% isofluran og indstilles musen under objektivlinsen i to-fotonmikroskopet ved hjælp af et specialfremstillet stereotaksisk instrument.
- Installer den specialfremstillede skyggeenhed og en LCD-skærm til visuel stimulering som beskrevet nedenfor (figur 3D).
- Placer objektivet for at fokusere på hjerneoverfladen, og indstil derefter denne linseposition som den oprindelige Z-position. Hold x-y-koordinaterne konstante, og hæv objektivlinsen; Fjern musen og stereotaksisk instrument fra objektivlinsen og løbebåndet.
- Fastgør en skyggeanordning på toppen af hovedpladen ved hjælp af silikone, som er sort ved blanding med kulpulver, og sørg for, at mellemrummet mellem hovedpladen og skyggeanordningen er godt forseglet.
- Fyld skyggeanordningen med destilleret vand, og fastgør derefter musen og den stereotaxiske ramme igen under målet og på løbebåndet. Nulstil forsigtigt fokalplanet på hjerneoverfladen, kontroller dybden af objektivlinsen.
BEMÆRK: For at undgå risikoen for at beskadige objektivobjektivet skal du først indstille xyz-koordinaterne og derefter anvende objektivobjektivets skyggeanordning. Det er også rimeligt at installere dækslet først og derefter justere koordinaterne, men forsigtig håndtering er nødvendig for denne mulighed. - Dæk objektivobjektivet med sort aluminiumsfolie for at undgå lysforurening fra LCD-skærmen, der bruges til visuel stimulering gennem objektivlinsen (figur 3D). Indstil en 10" LCD-skærm til 12,5 cm foran musens øjne for at præsentere visuelle stimuli (figur 3D).
- Konfigurer filtrene til opsamling af fluorescensemissioner til EGFP-fluorescens (525/50 nm emissionsfilter) og R-CaMP-fluorescens (593/46 nm emissionsfilter) og excitationsbølgelængden til 1.000 nm. Hent billeder med en rumlig opløsning på 0,25 μm/pixel ved hjælp af et 25x 1,1 NA-mål og GaAsP PMT'er.
- Find det billeddannelsesområde, hvor R-CaMP (+) neuroner og EGFP (+) mikroglia kan afbildes samtidigt i lag 2/3. Til denne opsætning var data opnået i figur 4 og video 1 i en dybde på 100 μm fra pialoverfladen ved hjælp af en live billedeksempel. Hold excitationslaserens effekt så lav som muligt for at undgå fotoblegning og skader forårsaget af øget lokal temperatur i billedområdet.
- Få billeder med en billedhastighed på 30 Hz. Samtidig med billedoptagelsen skal du præsentere et drivende gitter visuelle stimuli ved 100% kontrast, 1,5 Hz, 0,04 cyklusser pr. grad i 12 retninger i 6 retninger fra 0 ° til 150 ° i 30 ° trin til musen17.
- Efter billedoptagelsen skal du fjerne musen fra mikroskoptrinnet, løsne skyggeenheden og det stereotaxiske instrument fra musen og returnere musen til sit hjemmebur.
- Registrering af data
- Konverter og gem de erhvervede billeddata (nd2-format i dette tilfælde) som en række tiff-billedfiler for hver farvekanal ved hjælp af Fiji eller softwaren, der leveres med mikroskopet.
- Anvend Turboreg, et plugin fra Fiji, for at udføre registrering med tilstand = oversættelse. Brug gennemsnitligt billede som referencebillede med tiff-billedfilerne på EGFP-kanalen.
- Udfør følgende behandling for hver ramme ved hjælp af MATLAB.
BEMÆRK: Selvom MATLAB bruges i den følgende behandling, fokuserer beskrivelsen hovedsageligt på hensigten med hvert trin, så data kan analyseres af anden programmeringssoftware såsom Python.- Brug funktionen ulæst til at læse to EGFP tiff-billeder før og efter registrering af den samme ramme. Brug funktionen ulæst til at læse R-CaMP tiff-billedet af den samme ramme.
- Brug funktionen normcorr2 til at beregne korrelationsfunktionen mellem de vektoriserede variabler i de to GFP-billeder, der læses i trin 4.3.3.1.
- Brug max-funktionen til at registrere det lineære indeks med den højeste krydskorrelation af korrelationsfunktionen, og brug derefter funktionen ind2sub til at beregne bevægelsespositionen for det registrerede billede fra dets oprindelige billede.
- Brug funktionen fordrejning til at oversætte R-CaMP-billedet til den position, der er beregnet i trin 4.3.3.3, og brug derefter skrivefunktionen til at gemme det registrerede billede af R-CaMP.
- Generering af calciumspor
- Udfør følgende behandling ved hjælp af MATLAB. Brug funktionen ulæst til at læse alle de registrerede R-CaMP tiff-billeder, der er genereret i trin 4.3.3.4. Hvis de registrerede billeder allerede er indlæst som en variabel i arbejdsområdet, skal du udelade dette trin.
- Brug middelfunktionen til at generere et tidsprojektionsbillede. Brug imshow-funktionen til at vise det gennemsnitlige billede som en figur; Brug roipoly-funktionen til at generere en binær ROI-maske af målstrukturen (dendritisk rygsøjle i disse data).
- Brug middelfunktionen med billederne opnået ved at gange den binære maske med billeder af hver ramme som inputvariabler til at beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet inden for ROI for hver ramme.
- Som beskrevet tidligere17 anvender smørfrekvensfilteret på den variabel, der er opnået i trin 4.4.3, smørværdifrekvensfilteret ved afskæring = 1,6 s til skæring af højfrekvent støj, og anvender derefter glidende medianfilter i tidsvinduet = 200 s til reduktion af lavfrekvent støj.
Representative Results
Vi udførte AAV-injektion og kranievinduesimplantation i V1 af en 8 uger gammel CX3XR1-EGFP transgen mus som beskrevet i denne protokol. Fire uger efter operationen udførte vi samtidig in vivo to-foton-billeddannelse af R-CaMP-baseret neural aktivitet og mikroglial dynamik i lag 2/3 af V1 (figur 4 og video 1). Under billeddannelsen blev musen placeret på et løbebånd og fik lov til at løbe frit. Billeder blev taget med en billedhastighed på 30 Hz med den rumlige opløsning på 0,25 μm/pixel ved hjælp af et 25x, 1,1 NA-mål og GaAsP PMT'er. Både EGFP og R-CaMP blev exciteret ved en bølgelængde på 1.000 nm, og EGFP-fluorescens (525/50 nm emissionsfilter) og R-CaMP-fluorescens (593/46 nm emissionsfilter) blev indsamlet samtidigt. Efter registrering af erhvervede data for at minimere bevægelsesartefakter blev hvert fjerde billede gennemsnitligt i en ramme for at reducere baggrundsstøj. Grating visuelle stimuli blev præsenteret for musen, og de visuelle reaktioner af neuroner og individuelle dendritiske rygsøjler blev analyseret (figur 4D). Mikrogliale processer viste hurtig dynamik og ændrede deres morfologi inden for 10 s (figur 4E og video 1). Som beskrevet i afsnittet Diskussion kunne udtrykket af R-CaMP ikke detekteres, da AAV-injektionen mislykkedes. Hvis operationen ikke lykkedes, kunne signalerne fra EGFP og R-CaMP ikke observeres.
Figur 1: AAV-injektion . (A) En glaspipette blev forbundet til en 26 G Hamilton-sprøjte ved hjælp af et siliciumrør. (B) Opsætningen til AAV-injektion. (C) AAV-opløsning blev injiceret via glaspipetten vippet 60° anteriort fra den lodrette akse. D) Skematisk diagram over proceduren for åbent kranium (beskrevet i trin 3.3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kranievindue og hovedplade . (A) Skematisk diagram over kranievinduesimplantation. (B) Der blev anvendt specialfremstillede hovedplader. Til billeddannelse på højre halvkugle skal den kortere arm bruges på højre side. C) Rygbillede af en mus med kranievindue og implanteret hovedplade. (D) Billede med høj forstørrelse af kranievinduet vist i figur 2C. E) Rygbillede af en mus, der er fastgjort med det specialfremstillede stereotaksiske instrument. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opstillingen til in vivo to-foton-billeddannelse. (A) Rygbillede af skyggeanordning. (B) Set fra siden af skyggeanordningen. (C) Billede af en mus med skyggeanordningen på hovedpladen under objektivlinsen. Musen placeres på løbebåndet. (D) Billede under to-foton excitationsmikroskop. En skærm, der præsenterer visuelle stimuli, er placeret på højre side af figuren. Objektivlinsen er dækket af skyggeanordningen og sort aluminiumsfolie for at undgå lys fra skærmen til objektivlinsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mikroglial dynamik og visuelle reaktioner i en dendritisk rygsøjle. (A-C) Tidsgennemsnitlige billeder af EGFP(+) microglia og R-CaMP(+) neuroner i lag 2/3 af V1 i en 12 uger gammel CX3XR1-EGFP transgen mus. Signalintensiteten i hver kanal blev normaliseret uafhængigt. (D) Visuelle reaktioner i en dendritisk rygsøjle. Stribediagrammer med sorte pile angiver retningen af gitterstimuli, der præsenteres i timingen angivet med grå søjler. I calciumspor angiver grå linjer individuelle reaktioner, og en sort linje angiver deres gennemsnit. I højre indsats angiver en gul pilespids den dendritiske rygsøjle, hvor interesseområdet (ROI) blev genereret for at erhverve calciumsporene. (E) Mikroglial proces (cyan pilespids) viste hurtig tilbagetrækning i 10 s. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: To-foton billeddannelse af neuronal aktivitet og mikroglial dynamik. Billeddata af EGFP(+) microglia og R-CaMP(+) neuroner i lag 2/3 af V1 i en 12 uger gammel CX3XR1-EGFP transgen mus. På venstre side af filmen indikerer magenta R-CaMP i neuroner, og grøn angiver EGFP i mikroglia. Filmens centrum svarer til EGFP-signalet, og højre side svarer til R-CaMP-signalet. Signalintensiteten i hver kanal blev normaliseret uafhængigt. Filmens billedhastighed er 40 gange hurtigere end den faktiske hastighed. Skalabjælke = 10 μm Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Vi beskriver protokollen for AAV-injektion og kraniotomi til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus samt databehandling. Denne teknik kan afdække koordineringen mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet på tidsskalaer fra sub-sekund til titusinder af sekunder.
Operationsprotokollen involverer flere teknisk krævende trin. AAV-injektion er et af de kritiske trin. Mislykket AAV-injektion kan medføre en signifikant reduktion i ekspressionen af R-CaMP. Der er to hovedårsager: tilstoppede glaspipetter og vævsskade. Tilstopning af glaspipetter reducerer eller blokerer fuldstændigt udslyngningen af AAV-opløsning. Denne situation kan undgås ved at farve AAV-opløsningen med et farvestof som hurtig grøn og visuelt bekræfte injektionens succes. Vævsskade forårsaget af AAV-injektion forhindrer eksogen genekspression nær midten af injektionsstedet. Den skade, der forårsages af AAV-injektion, skyldes sandsynligvis en pludselig stigning i udstrømningen fra spidsen af glaspipetten efter akkumulering af trykket inde i pipetten. Derfor bør udstrømningen af AAV-opløsning fra glaspipetten være konstant under injektionen. Valg af glaspipetter med en lidt bredere diameter ved deres spidser ville løse dette problem. Ved kranial vinduesimplantation er operationshastigheden kritisk. Hvis operationen tager for lang tid, kan hjernevævet blive alvorligt beskadiget. Derfor er gentagen praksis nødvendig for at sikre operationens hastighed og glathed. Derudover kan kvaliteten af billeddannelsen i løbet af de 4 uger fra operation til billeddannelse reduceres ved vævsregenerering mellem kranievinduet og hjernevævet ved den konventionelle metode17. Metoden her overvinder dette problem ved at anvende tykke briller til kranievinduernes indre glasskive for at hæmme vævsregenerering og holde vinduet klart. I det her beskrevne system var denne effekt tydelig ved anvendelse af en indre glasskive med en tykkelse på 0,525 ± 0,075 μm.
Metoden kan anvendes med succes på mus ældre end 4 uger, men applikationen til yngre mus kan være problematisk. Hos unge mus viser kraniet hurtig og fremtrædende vækst, hvilket fremkalder en uoverensstemmelse mellem kraniebenet og glasvinduet.
I nogle banebrydende undersøgelser blev in vivo to-fotonbilleddannelse brugt til at studere mikroglia-neuroninteraktioner 12,21,23. Især i pionerarbejdet af Merlini et al. udførte de samtidig in vivo-billeddannelse af mikroglial dynamik og neural aktivitet i cellelegemerne21. I denne metode kunne vi ved at bruge tykkere indre briller til kranievinduer undertrykke bevægelsesartefakter i dybdeorienteringen og opnå stabil måling af neuronal aktivitet i mikrostrukturer, såsom dendritiske rygsøjler. Denne metode vil hjælpe med at undersøge synapse-mikrogliale procesinteraktioner i vågne mus.
For nylig viste in vitro-undersøgelse , at tynde filopodia-lignende mikrogliale processer har hurtigere bevægelighed end tykke processer, hvilket tyder på vigtigheden af deres hurtigere bevægelighed i overvågning19. Systemet her kan spore motiliteten af tynde mikrogliale processer med en tidsmæssig opløsning fra et subsekund til et par titalls sekunder. Denne egenskab hjælper med at belyse den funktionelle betydning af deres bevægelighed for overvågning in vivo.
I fremtiden vil kombinationen af denne billeddannelsesteknik med interventioner, såsom optogenetik24 eller kemogenetik25, anvendt på lokale neurale kredsløb eller interregionale neurale forbindelser kaste lys over nye mikrogliale funktioner i synaptisk udvikling og plasticitet, som skulpturerer karakteristika ved neurale kredsløb. Yderligere integration af billeddannelse, intervention og adfærdsmæssige opgaver vil også bidrage til at afsløre koordineringen af mikroglia og neuroner, der ligger til grund for specifik adfærd.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Masashi Kondo og Dr. Masanori Matsuzaki for at levere virusvektorer. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til S.O.), Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til S.O. og JP19dm0207082 til H.M.), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 til H.M.), Brain Science Foundation (til H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
- Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
- Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
- Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
- Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Roth, B. L.
