Summary
Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.
Abstract
Beyin fonksiyonları periferik dokulardan türetilen sinyallerin sürekli etkisi altında olduğundan, beyindeki glial hücrelerin periferdeki çeşitli biyolojik koşulları nasıl algıladığını ve sinyalleri nöronlara nasıl ilettiğini aydınlatmak çok önemlidir. Mikroglia, beyindeki bağışıklık hücreleri, sinaptik gelişim ve plastisitede rol oynar. Bu nedenle, mikroglia'nın vücudun iç durumuna yanıt olarak nöral devre yapısına katkısı, mikroglial dinamikler ve nöronal aktivite arasındaki ilişkinin intravital görüntülemesi ile kritik olarak test edilmelidir.
Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için bir teknik açıklanmaktadır. Kırmızı floresan proteininin gen kodlu bir kalsiyum göstergesi olan adeno ilişkili virüs kodlayan R-CaMP, mikrogliada EGFP'yi eksprese eden CX3CR1-EGFP transgenik farelerde birincil görsel korteksin 2/3 katmanına enjekte edildi. Viral enjeksiyondan sonra, enjekte edilen bölgenin beyin yüzeyine bir kranial pencere yerleştirildi. Ameliyattan 4 hafta sonra uyanık farelerde in vivo iki foton görüntüleme, nöral aktivitenin ve mikroglial dinamiklerin saniyenin altındaki zamansal çözünürlükte aynı anda kaydedilebileceğini göstermiştir. Bu teknik, mikroglial dinamikler ve nöronal aktivite arasındaki koordinasyonu ortaya çıkarabilir, birincisi periferik immünolojik durumlara cevap verirken, ikincisi iç beyin durumlarını kodlar.
Introduction
Vücudun iç durumunun hayvanlarda beyin fonksiyonlarını sürekli olarak etkilediğine dair kanıtlar artmaktadır 1,2,3,4,5. Buna göre, beyin fonksiyonlarını daha iyi anlamak için, beyindeki glial hücrelerin çevredeki biyolojik koşulları nasıl izlediğini ve bilgiyi nöronlara nasıl aktardığını aydınlatmak çok önemlidir.
Mikroglia, beyindeki bağışıklık hücreleri, beyindeki sinir devrelerinin özelliklerini şekillendiren sinaptik gelişim ve plastisitede rol oynar 6,7,8,9. Örneğin, Wake ve ark. tarafından yapılan öncü çalışmalar, mikroglial süreçlerin fare neokorteksindeki nöronal aktiviteye bağımlı bir şekilde sinapslarla temas ettiğini ve yapay iskeminin mikroglia10 ile uzun süreli temastan sonra sinaps kaybına neden olduğunu göstermiştir. Tremblay ve ark., görsel deneyimin değişmesinin sinapslarla mikroglial etkileşim modalitesini değiştirdiğini bulmuşlardır. Primer görsel korteksteki (V1) dendritik omurga döngüsünün binoküler yoksunluk ile arttığı kritik dönemde, karanlık adaptasyon mikroglial süreçlerin hareketliliğini azaltır ve hem sinaptik yarıklarla temas sıklığını hem de mikroglia11'deki hücresel inklüzyonların sayısını arttırır. Bu sonuçlar, mikroglial süreçlerin nöral devreleri yeniden şekillendirmek için nöral aktiviteyi ve çevrelerini algıladığını göstermektedir. Ayrıca, yakın tarihli bir çalışma, mikroglial sürveyansın uyanık ve anestezi altındaki koşullar arasında farklılık gösterdiğini bildirmiştir, bu da fizyolojik koşullar altında nöron-mikroglia iletişimini araştırmak için uyanık farelerin kullanıldığı deneylerin önemini düşündürmektedir12.
İn vivo iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, canlı bir hayvanda aynı anda yüzlerce nöronda devam eden nöronal ateşlemeyi yansıtan kalsiyum dinamiklerinin kaydedilmesi için güçlü bir araçtır13,14,15. Nöronlarda kalsiyum görüntüleme genellikle hızlı nöronal yanıtları izlemek için birkaç Hz'den fazla zamansal çözünürlük gerektirir16,17. Buna karşılık, mikroglial dinamikleri izleyen önceki çalışmalar, mikroglial yapıları 0.1 Hz 18,19,20'den daha düşük nispeten düşük bir zamansal çözünürlükte örneklemiştir. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, nöron-mikroglia iletişimini anlamak için eşzamanlı iki fotonlu görüntüleme uygulanmıştır21. Bununla birlikte, dinamik mikroglial süreçlerin uyanık farelerde birkaç Hz'den daha fazla zamansal çözünürlükte çevredeki nöral aktiviteye nasıl tepki verdiği hala belirsizdir. Bu sorunu ele almak için, uyanık farelerde 1 Hz'den daha yüksek bir zamansal çözünürlüğe sahip nöral aktivite ve mikroglial dinamiklerin eşzamanlı in vivo iki foton görüntüleme yöntemini tanımladık. Bu yöntem, uyanık farelerde daha yüksek kare hızında (maksimum, 512 x 512 piksel piksel kare boyutuyla 30 Hz) kararlı görüntüleme elde etmemizi sağlar ve mikroglia'nın gözetim davranışını veya uyanık farelerde nöronal aktivite ile etkileşimlerini araştırmak için daha uygun bir yol sağlar.
Protocol
Tüm deneyler Tokyo Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Tıp Fakültesi Hayvan Etik Komitesi ve Genetik Rekombinant Deney Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve kılavuzlarına göre gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlık
- Ameliyat için gerekli tüm alet ve aparatları otoklav veya% 70 etanol kullanarak sterilize edin.
- Cam pipet hazırlama.
- 75 μL kalibre edilmiş kılcal damarı mikropipet çektiricinin tutucusuna sıkıca sabitleyin. Çektirmeyi önerilen parametrelerle programa P (basınç) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180 olarak ayarlayın.
- Programı bitirdikten sonra (genellikle 4,5 ila 5 sn), kılcal damar sivrilen kuyruklara sahip iki cam pipete bölünür. Ardından, uç çapını 30-50 μm arasında tutmak için kuyrukların distal kısmını cımbızla kırın. Bunun için kuyrukları eğimli kısmın sonuna kadar 1 cm distal olarak kırın.
- Kraniotomi için, UV ışık kürleme reaktifi kullanarak 4 mm çapında, 0,15 ± 0,02 mm kalınlığında daha büyük bir dış cam diski, 2 mm çapında, 0,525 ± 0,075 mm kalınlığında daha küçük bir iç cam diske yapıştırarak bir kranial pencere hazırlayın (Şekil 2A).
2. AAV enjeksiyonu
- Enjeksiyon aparatının hazırlanması
- 26 G Hamilton şırıngasına bağlı bir cam pipeti bir tüpün içinden stereotaksik bir cihazın pipet tutucusuna yerleştirin ve ardından pipet tutucuyu dikey eksenden 60° öne doğru eğin (Şekil 1A,B).
- Cam pipeti, şırıngayı ve bağlantı borusunu sıvı parafin ile doldurun. Şırıngayı bir mikroenjektöre yerleştirin.
- Cerrahi prosedür
NOT: Aşağıdaki ameliyat sterilize edilmiş bir kabinde yapıldı. Gerekirse ameliyat için stereomikroskop kullanıldı.- Bir erkek CX3CR1-EGFP faresini (Malzeme Tablosunda ayrıntılı bilgi) 7 ila 8 haftalıkken (vücut ağırlığı 22-26 g) gaz geçirmez bir odada% 3 izofluran ile uyuşturun. 3 dakika sonra, nefes alma dışında gönüllü hareketini kaybettiğinde fareyi odadan çıkarın ve% 2 izofluran içeren bir burun tüpü ile sürekli anesteziye geçin.
NOT: İzoflurane'nin mikroglia'yı aktive ettiği bilinmektedir. Ancak görüntüleme ameliyattan 4 hafta sonra yapıldığı için görüntüleme sırasında izofluranın fareler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. İzofluran anestezisi, görüntülemeden önce fareler stereotaksik alete yerleştirildiğinde birkaç dakika boyunca kullanılmasına rağmen (adım 4.2.1), bu kısa anestezinin etkisinin ihmal edilebilir olduğunu bulduk. - Ameliyat sırasında, hipotermiyi önlemek için fareyi 37 ° C'de bir ısıtma yastığı ile sıcak tutun. Kornea kuruluğunu önlemek için her iki göze göz merhemi uygulayın ve deri altından (5 mg / kg) meloksikam enjeksiyonu uygulayın. Fareyi yardımcı bir kulak çubuğuna takın ve ardından fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik aletin üzerine sabitleyin.
- Nefes ve kalp atış hızını izlerken ameliyat sırasında izofluran konsantrasyonunu uygun bir yüzdeye (% 1 -% 2) ayarlayın. Tüy dökücü krem kullanarak saçları çıkarın ve kafayı hem iyot bazlı hem de klorheksidin bazlı bir ovma ve alkol ile dairesel bir hareketle birkaç kez dezenfekte edin. Daha sonra, deri altından 0.1 mL% 1 lidokain enjekte edin ve cerrahi bölgeyi güvence altına almak için steril örtüler uygulayın.
- Kafa derisini orta hat boyunca makasla açın ve kafatasının sağ birincil görsel korteksin üzerinde iyi bir şekilde pozlanmasını sağlamak için insizyonu yaklaşık 2 cm uzunluğunda yapın. Kafa derisinin kesilmesinden sonra, maruz kalan kafatası ve beynin kurumasını önlemek için tüm prosedür boyunca kafayı salinle sulayın.
- Forseps kullanarak açıkta kalan kafatası üzerindeki periosteumu çıkarın. Kafatasını stereotaksik koordinatlar üzerinde delin: yaklaşık 0,5 mm çapında küçük bir delik oluşturmak için orta hatta 3 mm yanal, lambda hattına 0,5 mm önde. Gerekirse, matkap ucundaki kan ve doku kalıntılarını durulayın.
- Aşağıdaki prosedürü kullanarak cam pipeti 8,3 x 1012 vektör genomu/mL22 titresinde 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 ile doldurun.
- Cam pipetten 1 μL sıvı parafin çıkarmak için şırıngayı ilerletin. Farenin açıkta kalan kafatasına yaklaşık 2 cm x 2 cm'lik bir şeffaf film parçası yerleştirin ve bir pipetör kullanarak film üzerine 1 μL AAV çözeltisinden oluşan bir damlacık atın.
- Cam pipet ucunu film üzerindeki AAV çözeltisinin damlacığına yerleştirin ve AAV çözeltisini aspire etmek için şırıngayı yavaşça çekin. Çıkarma işleminden sonra, tüpün ve cam pipetin içindeki basıncı serbest bırakmak için T şeklindeki stopcock'u çevirin.
- Cam pipeti, adım 2.2.5'te oluşturulan delikten beyin yüzeyinden 500 μm derinliğe yerleştirin ve ardından mikroenjektörü kullanarak 0,5 μL AAV çözeltisi enjekte edin (Şekil 1C). 2,0 μL/s enjeksiyon hacmi akış hızını kullanın; 0.5 μL'lik bir enjeksiyon 15 dakika sürer ve daha sonra 5 dakika bekleyin.
- Enjeksiyondan sonra, cam pipeti yavaşça geri çekin ve beyin yüzeyini salinle durulayın.
- Bir erkek CX3CR1-EGFP faresini (Malzeme Tablosunda ayrıntılı bilgi) 7 ila 8 haftalıkken (vücut ağırlığı 22-26 g) gaz geçirmez bir odada% 3 izofluran ile uyuşturun. 3 dakika sonra, nefes alma dışında gönüllü hareketini kaybettiğinde fareyi odadan çıkarın ve% 2 izofluran içeren bir burun tüpü ile sürekli anesteziye geçin.
3. Kraniyal pencere implantasyonu
NOT: Kraniyal pencere implantasyonu aynı gün AAV enjeksiyonunu takip eder.
- Kafatası üzerinde, lambdadan yanal olarak 3 mm ortalanmış 2,5 mm çapında bir daireyi işaretleyin. Delerek kafatası üzerindeki işaret boyunca dairesel bir oluk oluşturun. Kafatasının görünürlüğünü olumsuz yönde etkileyebileceğinden kalıntıları temizleyin ve ısınmayı önlemek için delme işlemi sırasında salin uygulayın.
- Dairesel oluktaki delme derinliğinin merkezi kafatası parçasını çıkarmak için yeterli olup olmadığını kontrol etmek için, merkezi kafatasına forseps ile hafifçe bastırın. Çok az dirençle dikey olarak hareket ederse, sondaj derinliği yeterlidir.
- Oluk yeterli derinliğe ulaştığında, forsepsin ucunu merkezi kafatası parçasının dibine yerleştirin ve beyin yüzeyini ortaya çıkarmak için yavaşça kaldırın ve çıkarın (Şekil 1D).
- 27 G'lik bir iğne kullanarak, açıkta kalan beyin yüzeyinin kenarındaki durayı delin ve yırtın. Forsepsin ucunu duranın kenarında yapılan delikten geçirin. Dura'yı tutun ve beyin yüzeyini ortaya çıkarmak için soyun.
NOT: Kanama meydana gelirse, kanama durana kadar beyin yüzeyini salinle durulayın. - Forseps kullanarak, hemostatik lifleri 3.5 mm'lik bir tabakta tuzlu su içinde birer birer dağıtın ve ardından hemostatik lifleri, transekte duranın bulunduğu deliğin kenarları boyunca yerleştirin.
- Maruz kalan beyin yüzeyine adım 1.3'te hazırlanan bir kafatası penceresi yerleştirin ve ardından pencerenin kafatası ile yakın temas halinde olması için pencereye hafifçe bastırırken anında yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın.
- Daha sonra, açıkta kalan kafatasının tamamına anında yapıştırıcı uygulayın ve ardından kafatasına dikkatlice bir kafa plakası takın, böylece pencere kafa plakasının kare deliğinin merkezinde bulunur (Şekil 2C). Kafa plakasının yüzeyinin cam pencerenin yüzeyine paralel olduğundan emin olun.
- Tutkal yeterince sertleştikten sonra, baş ve kafa plakası arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için açıkta kalan kafatasına diş çimentosu uygulayın (Şekil 2).
NOT: Deneyler farelere görsel uyaranların sunumunu içeriyorsa, görüntüleme alanına giden başıboş ışıktan kaçınılmalıdır. Işık yansımasının azaltılması için çimentonun aktif kömürle karıştırılarak karartılması tavsiye edilir. - Çimento yeterince sertleştikten sonra fareyi anesteziden çekin (yaklaşık 20 dakika). Ardından, tek başına iyileşmek için fareyi yeni bir kafese koyun.
- Bilincini ve gönüllü hareketini doğruladıktan sonra, tam iyileşmeyi göstererek, fareyi tekrar ev kafesine koyun. İyileşme sırasında, bariz ağrı gösteren davranışlar ortaya çıkarsa, ikinci veya gerekirse daha fazla meloksikam dozu (1-3 gün boyunca her 24 saatte bir) uygulayın.
4. Mikroglia ve nöronal kalsiyum dinamiklerinin in vivo iki foton görüntülemesi
- Farelerin mikroskop aparatına alışması
- Ameliyattan üç hafta sonra, farede% 3 izofluran ile anestezi uygulayın ve fareyi özel yapım stereotaksik bir alet kullanarak iki fotonlu bir mikroskobun 25x objektif lensinin altına yerleştirin (Şekil 3C). Buradaki kurulum için, fare bir koşu bandının üstüne yerleştirilir ve serbestçe çalışmasına izin verilir.
- Yaklaşık 10 dakika sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın ve ev kafesine geri getirin. İki fotonlu görüntü elde etmeden önce alışkanlığı her alternatif günde en az 3 kez tekrarlayın.
- İki fotonlu görüntü yakalama
NOT: Mikroglial aktivasyon yavaş yavaş bazal seviyeye geri döndüğünden, görüntü alımını ameliyattan 4 haftadan daha uzun bir süre sonra yapmanızı öneririz.- Adım 4.1'de olduğu gibi,% 3 izofluran ile farede anestezi sağlayın ve özel yapım stereotaksik bir alet kullanarak fareyi iki foton mikroskobunun objektif merceğinin altına yerleştirin.
- Aşağıda açıklandığı gibi görsel stimülasyon için özel yapım gölgelendirme cihazını ve bir LCD monitörü takın (Şekil 3D).
- Lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. x-y koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin; Fareyi ve stereotaksik aleti objektif lensten ve koşu bandından çıkarın.
- Kömür tozu ile karıştırılarak karartılan silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgelendirme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgelendirme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun.
- Gölgelendirme cihazını damıtılmış suyla doldurun ve ardından fareyi ve stereotaksik çerçeveyi hedefin altına ve koşu bandına tekrar sabitleyin. Objektif lensin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın.
NOT: Objektif lense zarar verme riskini önlemek için, önce xyz koordinatlarını ayarlayın ve ardından objektif lensin gölgelendirme cihazını uygulayın. Önce kapağı takmak ve ardından koordinatları ayarlamak da mantıklıdır, ancak bu seçenek için dikkatli kullanım gereklidir. - Objektif lens aracılığıyla görsel stimülasyon için kullanılan LCD monitörden kaynaklanan ışık kirliliğini önlemek için objektif lensi siyah alüminyum folyo ile örtün (Şekil 3D). Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önünde 12,5 cm'lik 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın (Şekil 3D).
- Floresan emisyon toplama filtrelerini EGFP floresan (525/50 nm emisyon filtresi) ve R-CaMP floresan (593/46 nm emisyon filtresi) ve uyarma dalga boyunu 1.000 nm olarak yapılandırın. 25x1,1 NA hedefi ve GaAsP PMT'leri kullanarak 0,25 μm/piksel uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin.
- R-CaMP (+) nöronlarının ve EGFP (+) mikroglia'nın aynı anda katman 2/3'te görüntülenebileceği görüntüleme bölgesini bulun. Bu kurulum için, Şekil 4 ve Video 1'de elde edilen veriler, canlı görüntü önizlemesi kullanılarak pial yüzeyinden 100 μm derinlikteydi. Foto-beyazlatma ve görüntüleme bölgesindeki artan yerel sıcaklığın neden olduğu hasarı önlemek için uyarma lazerinin gücünü mümkün olduğunca düşük tutun.
- Görüntü yakalama ile eşzamanlı olarak, fareye 30° adımlarla 0° ila 150° arasında 6 yönde 12 yönde% 100 kontrastta, 1,5 Hz, derece başına 0,04 döngüde sürüklenen ızgaralı bir görsel uyaran sunun17.
- Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın, gölgeleme cihazını ve stereotaksik aleti fareden ayırın ve fareyi ev kafesine geri getirin.
- Veri kaydı
- Elde edilen görüntü verilerini (bu durumda nd2 formatı), Fiji'yi veya mikroskopla birlikte verilen yazılımı kullanarak her renk kanalı için bir dizi tiff görüntü dosyası olarak dönüştürün ve kaydedin.
- Mode = translation ile kayıt yapmak için Fiji'nin bir eklentisi olan Turboreg'i uygulayın. Ortalama görüntüyü EGFP kanalının tiff görüntü dosyalarıyla referans görüntü olarak kullanın.
- MATLAB kullanarak her kare için aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin.
NOT: Aşağıdaki işlemlerde MATLAB kullanılmasına rağmen, açıklama esas olarak her adımın amacına odaklanır, böylece veriler Python gibi diğer programlama yazılımları tarafından analiz edilebilir.- Aynı karenin kaydından önce ve sonra sırasıyla iki EGFP tiff görüntüsünü okumak için imread işlevini kullanın. Aynı karenin R-CaMP tiff görüntüsünü okumak için imread işlevini kullanın.
- Adım 4.3.3.1'de okunan iki GFP görüntüsünün vektörize değişkenleri arasındaki korelasyon fonksiyonunu hesaplamak için normcorr2 işlevini kullanın.
- Korelasyon fonksiyonunun en yüksek çapraz korelasyonuna sahip lineer indeksi algılamak için max fonksiyonunu kullanın ve ardından kayıtlı görüntünün hareket konumunu orijinal görüntüsünden hesaplamak için ind2sub fonksiyonunu kullanın.
- R-CaMP görüntüsünü adım 4.3.3.3'te hesaplanan konuma çevirmek için çarpıtma işlevini kullanın ve ardından R-CaMP'nin kayıtlı görüntüsünü kaydetmek için imwrite işlevini kullanın.
- Kalsiyum izlerinin oluşumu
- MATLAB kullanarak aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin. Adım 4.3.3.4'te oluşturulan tüm kayıtlı R-CaMP tiff görüntülerini okumak için imread işlevini kullanın. Kayıtlı görüntüler çalışma alanına zaten değişken olarak yüklenmişse, bu adımı atlayın.
- Zaman projeksiyonu görüntüsü oluşturmak için ortalama işlevini kullanın. Ortalama görüntüyü şekil olarak göstermek için imshow işlevini kullanın; hedef yapının ikili ROI maskesini oluşturmak için roipoly işlevini kullanın (bu verilerdeki dendritik omurga).
- İkili maskenin giriş değişkenleri olarak her karenin görüntüleriyle çarpılmasıyla elde edilen görüntülerle ortalama işlevini kullanarak, her kare için YG içindeki ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın.
- Daha önce17'de açıklandığı gibi, adım 4.4.3'te elde edilen değişkene, yüksek frekanslı gürültüyü kesmek için kesme = 1.6 s'de tereyağı değeri frekans filtresini uygulayın ve ardından düşük frekanslı gürültüyü kesmek için zaman penceresinde = 200 s'de kayan medyan filtreyi uygulayın.
Representative Results
Bu protokolde tarif edildiği gibi 8 haftalık CX3XR1-EGFP transgenik farenin V1'ine AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonu uyguladık. Ameliyattan dört hafta sonra, V1'in 2/3 tabakasında R-CaMP tabanlı nöral aktivite ve mikroglial dinamiklerin eşzamanlı in vivo iki foton görüntülemesini gerçekleştirdik (Şekil 4 ve Video 1). Görüntüleme sırasında, fare bir koşu bandına yerleştirildi ve serbestçe koşmasına izin verildi. Görüntüler, 25x, 1,1 NA hedefi ve GaAsP PMT'ler kullanılarak 0,25 μm/piksel uzamsal çözünürlükle 30 Hz kare hızında elde edildi. Hem EGFP hem de R-CaMP, 1.000 nm dalga boyunda uyarıldı ve EGFP floresan (525/50 nm emisyon filtresi) ve R-CaMP floresan (593/46 nm emisyon filtresi) aynı anda toplandı. Hareket artefaktlarını en aza indirmek için elde edilen verilerin kaydedilmesinden sonra, arka plan gürültüsünü azaltmak için her dört karenin ortalaması tek bir kareye alındı. Izgara görsel uyaranları fareye sunuldu ve nöronların ve bireysel dendritik dikenlerin görsel tepkileri analiz edildi (Şekil 4D). Mikroglial süreçler hızlı dinamikler gösterdi ve morfolojilerini 10 saniye içinde değiştirdi (Şekil 4E ve Video 1). Tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, AAV enjeksiyonu başarısız olduğunda, R-CaMP ifadesi tespit edilemedi. Ameliyat başarılı olmazsa, EGFP ve R-CaMP sinyalleri gözlenemedi.
Resim 1: AAV enjeksiyonu . (A) Bir cam pipet, silikon tüp kullanılarak 26 G Hamilton şırıngaya bağlandı. (B) AAV enjeksiyonu için kurulum. (C) AAV çözeltisi, dikey eksenden 60° öne eğilmiş cam pipet aracılığıyla enjekte edildi. (D) Açık kafatası prosedürünün şematik diyagramı (adım 3.3'te açıklanmıştır). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Kraniyal pencere ve kafa plakası . (A) Kraniyal pencere implantasyonunun şematik diyagramı. (B) Ismarlama kafa plakaları kullanılmıştır. Sağ yarımkürede görüntüleme için sağ tarafta daha kısa kol kullanılmalıdır. (C) Kraniyal penceresi ve implante edilmiş kafa plakası olan bir farenin sırt görünümü. (D) Şekil 2C'de gösterilen kafatası penceresinin yüksek büyütmeli görünümü. (E) Özel yapım stereotaksik aletle sabitlenmiş bir farenin sırt görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İn vivo iki fotonlu görüntüleme için kurulum. (A) Gölgelendirme cihazının dorsal görünümü. (B) Gölgelendirme cihazının yandan görünümü. (C) Objektif lensin altındaki kafa plakasında gölgelendirme cihazı bulunan bir farenin görünümü. Fare koşu bandına yerleştirilir. (D) İki fotonlu uyarma mikroskobu altında görüntüleme. Görsel uyaranlar sunan bir monitör şeklin sağ tarafına yerleştirilmiştir. Objektif lens, monitörden objektif lense giden ışığı önlemek için gölgelendirme cihazı ve siyah alüminyum folyo ile kaplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dendritik omurgada mikroglial dinamikler ve görsel tepkiler. (A-C) 12 haftalık CX3XR1-EGFP transgenik farede V1'in 2/3 katmanındaki EGFP(+) mikroglia ve R-CaMP(+) nöronlarının zaman ortalamalı görüntüleri. Her kanaldaki sinyal yoğunluğu bağımsız olarak normalleştirildi. (D) Dendritik omurgada görsel tepkiler. Siyah oklu şerit diyagramları, gri sütunlarla gösterilen zamanlamada sunulan ızgara uyaranlarının yönünü gösterir. Kalsiyum izlerinde, gri çizgiler bireysel tepkileri gösterir ve siyah bir çizgi ortalamalarını gösterir. Sağ girişte, sarı bir ok ucu, kalsiyum izlerini elde etmek için ilgilenilen bölgenin (ROI) üretildiği dendritik omurgayı gösterir. (E) Mikroglial süreç (camgöbeği ok ucu) 10 sn'de hızlı geri çekilme gösterdi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Nöronal aktivite ve mikroglial dinamiklerin iki fotonlu görüntülenmesi. 12 haftalık CX3XR1-EGFP transgenik farede V1'in 2/3 katmanındaki EGFP(+) mikroglia ve R-CaMP(+) nöronlarının görüntüleme verileri. Filmin sol tarafında, macenta nöronlarda R-CaMP'yi gösterir ve yeşil mikrogliada EGFP'yi gösterir. Filmin merkezi EGFP sinyaline karşılık gelir ve sağ taraf R-CaMP sinyaline karşılık gelir. Her kanaldaki sinyal yoğunluğu bağımsız olarak normalleştirildi. Filmin kare hızı, gerçek hızdan 40 kat daha hızlıdır. Ölçek çubuğu = 10 μm Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi ve veri işleme için AAV enjeksiyonu ve kraniyotomi protokolünü tanımladık. Bu teknik, mikroglial dinamikler ve nöronal aktivite arasındaki koordinasyonu, saniyenin altından onlarca saniyeye kadar değişen zaman ölçeklerinde ortaya çıkarabilir.
Ameliyat protokolü teknik olarak zorlu birkaç adımı içerir. AAV enjeksiyonu kritik adımlardan biridir. Başarısız AAV enjeksiyonu, R-CaMP ekspresyonunda önemli bir azalmaya neden olabilir. Bunun iki ana nedeni vardır: tıkanmış cam pipetler ve doku hasarı. Cam pipetlerin tıkanması, AAV çözeltisinin dışarı atılmasını azaltır veya tamamen engeller. Bu durum, AAV çözeltisinin hızlı yeşil gibi bir boya ile renklendirilmesi ve enjeksiyonun başarısını görsel olarak teyit etmesi ile önlenebilir. AAV enjeksiyonunun neden olduğu doku hasarı, enjeksiyon bölgesinin merkezine yakın eksojen gen ekspresyonunu önler. AAV enjeksiyonunun neden olduğu hasarın, pipetin içindeki basıncın birikmesinden sonra cam pipetin ucundaki efflüksteki ani bir artıştan kaynaklanması muhtemeldir. Bu nedenle, AAV çözeltisinin cam pipetten çıkışı enjeksiyon sırasında sabit olmalıdır. Uçlarında biraz daha geniş çaplı cam pipetlerin seçilmesi bu sorunu çözecektir. Kraniyal pencere implantasyonunda, ameliyatın hızı kritiktir. Ameliyat çok uzun sürerse, beyin dokusu ciddi şekilde hasar görebilir. Buna göre, ameliyatın hızını ve pürüzsüzlüğünü sağlamak için tekrarlanan uygulama gereklidir. Ayrıca ameliyattan görüntülemeye kadar geçen 4 hafta boyunca konvansiyonel yöntemle kraniyal pencere ile beyin dokusu arasındaki doku rejenerasyonu ile görüntüleme kalitesi düşebilir17. Buradaki yöntem, doku yenilenmesini engellemek ve pencereyi temiz tutmak için kraniyal pencerelerin iç cam diskine kalın camlar uygulayarak bu sorunun üstesinden gelir. Burada açıklanan sistemde, bu etki 0.525 ± 0.075 μm kalınlığında bir iç cam disk kullanılarak belirgindi.
Yöntem, 4 haftadan daha eski farelere başarıyla uygulanabilir, ancak daha genç farelere uygulama sorunlu olabilir. Genç farelerde, kafatası hızlı ve belirgin bir büyüme gösterir, bu da kafatası kemiği ile cam pencere arasında uyumsuzluğa neden olur.
Bazı son teknoloji çalışmalarda, mikroglia-nöron etkileşimlerini incelemek için in vivo iki foton görüntüleme kullanılmıştır 12,21,23. Özellikle Merlini ve arkadaşlarının öncü çalışmalarında, hücre gövdeleri içindeki mikroglial dinamiklerin ve nöral aktivitenin eşzamanlı in vivo görüntülemesini gerçekleştirdiler21. Bu yöntemde, kraniyal pencereler için daha kalın iç camlar kullanarak, derinlik oryantasyonundaki hareket artefaktlarını bastırabilir ve dendritik dikenler gibi mikroyapılardaki nöronal aktivitenin kararlı ölçümünü sağlayabiliriz. Bu yöntem, uyanık farelerde sinaps-mikroglial süreç etkileşimlerinin araştırılmasına yardımcı olacaktır.
Son zamanlarda, in vitro çalışma, ince filopodia benzeri mikroglial süreçlerin kalın süreçlerden daha hızlı hareketliliğe sahip olduğunu göstermiştir, bu da sürveyansta daha hızlı hareketliliklerinin önemini düşündürmektedir19. Buradaki sistem, ince mikroglial süreçlerin hareketliliğini, bir saniyenin altından birkaç on saniyeye kadar zamansal bir çözünürlükle izleyebilir. Bu özellik, in vivo gözetim için hareketliliklerinin işlevsel önemini aydınlatmaya yardımcı olur.
Gelecekte, bu görüntüleme tekniğinin optogenetik24 veya kemogenetik25 gibi yerel sinir devrelerine veya bölgelerarası sinir bağlantılarına uygulanan müdahalelerle kombinasyonu, sinir devrelerinin özelliklerini şekillendiren sinaptik gelişim ve plastisitedeki yeni mikroglial fonksiyonlara ışık tutacaktır. Ayrıca, görüntüleme, müdahale ve davranışsal görevlerin daha fazla entegrasyonu, belirli davranışların altında yatan mikroglia ve nöronların koordinasyonunun ortaya çıkarılmasına katkıda bulunacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Masashi Kondo ve Dr. Masanori Matsuzaki'ye virüs vektörleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (JP19gm1310003 ve JP17gm5010003 to S.O. ve JP19dm0207082 to H.M.), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı Moonshot R&D (JPMJMS2024 to H.M.), Beyin Bilimi Vakfı (H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
- Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
- Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
- Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
- Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Roth, B. L.
