Summary
Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.
Abstract
Uma vez que as funções cerebrais estão sob a influência contínua dos sinais derivados dos tecidos periféricos, é fundamental elucidar como as células gliais no cérebro percebem várias condições biológicas na periferia e transmitem os sinais aos neurônios. Microglia, células imunes no cérebro, estão envolvidas no desenvolvimento sináptico e plasticidade. Portanto, a contribuição da microglia para a construção de circuitos neurais em resposta ao estado interno do corpo deve ser testada criticamente por imagens intravitais da relação entre a dinâmica da microglia e a atividade neuronal.
Aqui, descrevemos uma técnica para a obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e da atividade neuronal em camundongos acordados. O vírus adenoassociado que codifica o R-CaMP, um indicador de cálcio codificado por genes da proteína de fluorescência vermelha, foi injetado na camada 2/3 do córtex visual primário em camundongos transgênicos CX3CR1-EGFP expressando EGFP na micróglia. Após a injeção viral, uma janela craniana foi instalada na superfície cerebral da região injetada. Imagens in vivo de dois fótons em camundongos acordados 4 semanas após a cirurgia demonstraram que a atividade neural e a dinâmica microglial podem ser registradas simultaneamente na resolução temporal de sub-segundo. Essa técnica pode revelar a coordenação entre a dinâmica microglial e a atividade neuronal, com a primeira respondendo a estados imunológicos periféricos e a segunda codificando os estados cerebrais internos.
Introduction
Há evidências crescentes de que o estado interno do organismo influencia constantemente as funções cerebrais em animais 1,2,3,4,5. Assim, para obter uma compreensão mais profunda das funções cerebrais, é crucial elucidar como as células gliais no cérebro monitoram as condições biológicas na periferia e transmitem as informações aos neurônios.
As microglias, células imunes do cérebro, estão envolvidas no desenvolvimento sináptico e na plasticidade, que esculpem características dos circuitos neurais no cérebro 6,7,8,9. Por exemplo, o trabalho pioneiro de Wake e col. demonstrou que processos microgliais entram em contato com sinapses de maneira neuronal-dependente no neocórtex de camundongos e que a isquemia artificial induz perda de sinapse após contato prolongado com a micróglia10. verificaram que a alteração da experiência visual altera a modalidade de interação microglial com as sinapses. Durante o período crítico em que o turnover da coluna dendrítica no córtex visual primário (V1) é aumentado pela privação binocular, a adaptação ao escuro reduz a motilidade dos processos microgliais e aumenta tanto a frequência de contato com as fendas sinápticas quanto o número de inclusões celulares na micróglia11. Estes resultados sugerem que os processos microgliais detectam a atividade neural e seu ambiente circundante para remodelar circuitos neurais. Além disso, um estudo recente relatou que a vigilância microglial difere entre condições acordadas e anestesiadas, sugerindo a importância de experimentos com camundongos acordados para investigar a comunicação neurônio-microglia em condições fisiológicas12.
A imagem in vivo de cálcio de dois fótons é uma ferramenta poderosa para o registro da dinâmica do cálcio, refletindo o disparo neuronal contínuo, em centenas de neurônios simultaneamente em um animal vivo13,14,15. A imagem do cálcio em neurônios geralmente requer uma resolução temporal de mais de alguns Hz para rastrear respostas neuronais rápidas16,17. Em contraste, estudos anteriores rastreando a dinâmica microglial amostraram estruturas microgliais em uma resolução temporal relativamente baixa, inferior a 0,1 Hz18,19,20. Um estudo recente aplicou imagens simultâneas de dois fótons para entender a comunicação neurônio-microglia21. No entanto, ainda não está claro como os processos microgliais dinâmicos respondem à atividade neural circundante em uma resolução temporal de mais de alguns Hz em camundongos acordados. A fim de abordar esta questão, descrevemos um método de imagem simultânea in vivo de dois fótons da atividade neural e dinâmica microglial com uma resolução temporal superior a 1 Hz em camundongos acordados. Este método nos permite obter imagens estáveis em camundongos acordados a uma taxa de quadros mais alta (máximo, 30 Hz com o tamanho de quadro de pixel de 512 x 512 pixels) e fornece uma maneira mais favorável de investigar o comportamento de vigilância da micróglia ou sua interação com a atividade neuronal em camundongos acordados.
Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal e pelo Comitê de Segurança de Experimentos Recombinantes Genéticos da Escola de Pós-Graduação em Medicina e Faculdade de Medicina da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com suas diretrizes.
1. Preparo
- Esterilizar todos os instrumentais e equipamentos necessários para a cirurgia em autoclave ou etanol 70%.
- Preparação de pipeta de vidro.
- Fixe firmemente um capilar calibrado de 75 μL no suporte do puxador de micropipetas. Ajuste o extrator para o programa com os parâmetros recomendados como P (pressão) = 500, CALOR = 680, TRAÇÃO = 30, VEL = 60, TEMPO = 180.
- Após o término do programa (geralmente 4,5 a 5 s), o capilar é dividido em duas pipetas de vidro com caudas afiladas. Em seguida, quebre a parte distal da cauda com uma pinça para manter o diâmetro da ponta dentro de 30-50 μm. Para isso, quebre as caudas 1 cm distal ao final da parte chanfrada.
- Para craniotomia, preparar uma janela craniana colando um disco de vidro externo maior, de 4 mm de diâmetro, 0,15 ± 0,02 mm de espessura, em um disco de vidro interno menor, de 2 mm de diâmetro, 0,525 ± 0,075 mm de espessura, usando um reagente fotopolimerizável UV (Figura 2A).
2. Injeção de AAV
- Preparação do aparelho de injecção
- Coloque uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton 26 G através de um tubo sobre um suporte de pipeta de um instrumento estereotáxico e, em seguida, incline o suporte de pipeta 60° anteriormente a partir do eixo vertical (Figura 1A,B).
- Encha a pipeta de vidro, a seringa e o tubo de ligação com parafina líquida. Coloque a seringa em um microinjetor.
- Procedimento cirúrgico
OBS: A seguinte cirurgia foi realizada em cabina esterilizada. Um estereomicroscópio foi usado para a cirurgia, se necessário.- Anestesiar um camundongo CX3CR1-EGFP macho (informações detalhadas na Tabela de Materiais) com 7 a 8 semanas de idade (peso corporal 22-26 g) com isoflurano a 3% em uma câmara estanque ao gás. Após 3 min, retirar o camundongo da câmara quando ele perder o movimento voluntário, exceto a respiração, e então mudar para anestesia contínua por um tubo nasal com isoflurano a 2%.
NOTA: O isoflurano é conhecido por ativar a micróglia. No entanto, como os exames de imagem são realizados 4 semanas após a cirurgia, não há efeito do isoflurano nos camundongos durante os exames de imagem. Embora a anestesia com isoflurano seja usada por alguns minutos quando camundongos são colocados no instrumento estereotáxico antes da aquisição de imagens (passo 4.2.1), descobrimos que o efeito dessa anestesia curta é desprezível. - Durante a cirurgia, mantenha o rato aquecido com uma almofada de aquecimento a 37 °C para evitar a hipotermia. Aplicar pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e administrar uma injeção de meloxicam, por via subcutânea (5 mg/kg). Conecte o mouse a uma barra de ouvido auxiliar e, em seguida, fixe o mouse no instrumento estereotáxico com seu lado dorsal para cima.
- Ajustar a concentração de isoflurano para uma porcentagem adequada (1%-2%) durante a cirurgia enquanto monitora a respiração e a frequência cardíaca. Retire os pelos usando creme depilatório e desinfete a cabeça várias vezes em movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool. Em seguida, injetar 0,1 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea e aplicar campos estéreis para fixar o sítio cirúrgico.
- Incise o couro cabeludo aberto ao longo da linha média com tesoura e faça a incisão com cerca de 2 cm de comprimento, para garantir uma boa exposição do crânio acima do córtex visual primário direito. Após a incisão do couro cabeludo, irrige a cabeça com soro fisiológico durante todo o procedimento para evitar que o crânio e o cérebro expostos sequem.
- Remova o periósteo do crânio exposto com pinças. Perfurar o crânio nas coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral à linha média, 0,5 mm anterior à linha lambda, para criar um pequeno orifício com aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Enxágue o sangue e os restos de tecido da broca, se necessário.
- Encher a pipeta de vidro com 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando o seguinte procedimento a um título de 8,3 x10 12 genomas vectoriais/ml22.
- Avançar a seringa para ejetar 1 μL de parafina líquida da pipeta de vidro. Coloque um pedaço de filme transparente, aproximadamente 2 cm x 2cm, sobre o crânio exposto do rato e expulse uma gota de 1 μL de solução de AAV sobre o filme utilizando um pipetador.
- Coloque a ponta da pipeta de vidro na gota da solução de AAV sobre o filme e puxe suavemente a seringa para aspirar a solução de AAV. Após a ejeção, gire a torneira em forma de T para liberar a pressão dentro do tubo e da pipeta de vidro.
- Introduzir a pipeta de vidro a uma profundidade de 500 μm a partir da superfície cerebral através do orifício criado no passo 2.2.5 e, em seguida, injectar 0,5 μL de solução de AAV utilizando o microinjector (Figura 1C). Utilizar o fluxo volumétrico de injeção de 2,0 μL/h; uma injeção de 0,5 μL leva 15 minutos e, em seguida, espera 5 min.
- Após a injeção, retire suavemente a pipeta de vidro e lave a superfície cerebral com soro fisiológico.
- Anestesiar um camundongo CX3CR1-EGFP macho (informações detalhadas na Tabela de Materiais) com 7 a 8 semanas de idade (peso corporal 22-26 g) com isoflurano a 3% em uma câmara estanque ao gás. Após 3 min, retirar o camundongo da câmara quando ele perder o movimento voluntário, exceto a respiração, e então mudar para anestesia contínua por um tubo nasal com isoflurano a 2%.
3. Implante de janela craniana
NOTA: O implante de janela craniana segue a injeção de AAV no mesmo dia.
- Marcar um círculo de 2,5 mm de diâmetro no crânio, centrado 3 mm lateralmente da lambda. Crie um sulco circular ao longo da marca no crânio perfurando. Limpe os detritos, pois pode afetar negativamente a visibilidade do crânio e aplique soro fisiológico durante o processo de perfuração para evitar o aquecimento.
- Para verificar se a profundidade de perfuração no sulco circular é suficiente para remover o fragmento central do crânio, pressione suavemente o crânio central com pinças. Se ele se move verticalmente com pouca resistência, a profundidade de perfuração é suficiente.
- Quando o sulco atingir profundidade suficiente, insira a ponta da pinça na parte inferior do fragmento central do crânio e levante-o e remova-o suavemente para expor a superfície cerebral (Figura 1D).
- Usando uma agulha de 27 G, pice e rasgue a dura-máter na borda da superfície cerebral exposta. Insira a ponta da pinça através do orifício feito na borda da dura-máter. Segure a dura-máter e descasque-a para expor a superfície cerebral.
NOTA: Se ocorrer sangramento, lave a superfície do cérebro com soro fisiológico até que o sangramento pare. - Com o uso de pinças, dispersar as fibras hemostáticas, uma a uma, em solução salina, em uma placa de 3,5 mm e, em seguida, colocar as fibras hemostáticas ao longo das margens do orifício em que a dura-máter transeccionada está presente.
- Coloque uma janela craniana preparada no passo 1.3 na superfície exposta do cérebro e, em seguida, cole-a ao crânio com cola instantânea enquanto pressiona suavemente a janela para que a janela fique em contato próximo com o crânio.
- Em seguida, aplique cola instantânea em todo o crânio exposto e, em seguida, fixe cuidadosamente uma placa de cabeça no crânio para que a janela se localize no centro do orifício quadrado da placa da cabeça (Figura 2C). Certifique-se de que a superfície da placa principal esteja paralela à superfície da janela de vidro.
- Após a cola endurecer o suficiente, aplicar cimento dentário no crânio exposto para reforçar a fixação entre a cabeça e a placa-cabeça (Figura 2).
NOTA: Se os experimentos incluírem a apresentação de estímulos visuais para camundongos, a luz perdida para a área de imagem deve ser evitada. É aconselhável escurecer o cimento misturando-o com o carvão ativado para a redução da reflexão da luz. - Retire o rato da anestesia depois de o cimento ter endurecido suficientemente (cerca de 20 min). Em seguida, coloque o rato em uma nova gaiola para se recuperar sozinho.
- Depois de confirmar sua consciência e movimento voluntário, indicando recuperação completa, coloque o camundongo de volta na gaiola de casa. Durante a recuperação, administrar uma segunda dose, ou mais, se necessário, de meloxicam (uma vez a cada 24 horas durante 1-3 dias) se ocorrerem comportamentos indicativos de dor óbvios.
4. Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio
- Habituação de camundongos ao aparelho microscópico
- Três semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 3C). Para a configuração aqui, o mouse é colocado na parte superior de uma esteira e permitido correr livremente.
- Aproximadamente 10 minutos depois, remova o camundongo do estágio do microscópio e devolva-o à gaiola doméstica. Repetir a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons.
- Aquisição de imagens de dois fótons
OBS: Recomendamos realizar a aquisição das imagens mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.- Como no passo 4.1, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico personalizado.
- Instale o dispositivo de sombreamento personalizado e um monitor LCD para estimulação visual, conforme descrito abaixo (Figura 3D).
- Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira.
- Fixe um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa da cabeça usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa da cabeça e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado.
- Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e o quadro estereotáxico novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.
NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina as coordenadas xyz primeiro e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e, em seguida, ajustar as coordenadas, mas o manuseio cauteloso é necessário para essa opção. - Cubra a lente objetiva com papel alumínio preto para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD utilizado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 3D). Ajuste um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm à frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 3D).
- Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1.000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel utilizando objetiva 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP.
- Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP(+) e a microglia EGFP(+) podem ser fotografados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos na Figura 4 e no Vídeo 1 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar o fotoclareamento e os danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem.
- Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de grade de deriva a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções em 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse17.
- Após a aquisição da imagem, remova o mouse do estágio do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e devolva o mouse à sua gaiola inicial.
- Cadastro de dados
- Converta e salve os dados de imagem adquiridos (formato nd2 neste caso) como uma série de arquivos de imagem tiff para cada canal de cor, usando Fiji ou o software fornecido com o microscópio.
- Aplique o Turboreg, um plugin de Fiji, para realizar o registro com mode = translation. Use a imagem média como a imagem de referência com os arquivos de imagem tiff do canal EGFP.
- Execute o processamento a seguir para cada quadro usando o MATLAB.
NOTA: Embora o MATLAB seja usado no processamento a seguir, a descrição se concentra principalmente na intenção de cada etapa para que os dados possam ser analisados por outros softwares de programação, como o Python.- Use a função imread para ler duas imagens tiff EGFP antes e depois do registro do mesmo quadro, respectivamente. Use a função imread para ler a imagem tiff R-CaMP do mesmo quadro.
- Use a função normcorr2 para calcular a função de correlação entre as variáveis vetorizadas das duas imagens de GFP lidas na etapa 4.3.3.1.
- Use a função max para detectar o índice linear com a maior correlação cruzada da função de correlação e, em seguida, use a função ind2sub para calcular a posição de movimento da imagem registrada a partir de sua imagem original.
- Use a função imwarp para traduzir a imagem R-CaMP para a posição calculada na etapa 4.3.3.3 e, em seguida, use a função imwrite para salvar a imagem registrada do R-CaMP.
- Geração de traços de cálcio
- Execute o processamento a seguir usando o MATLAB. Use a função imread para ler todas as imagens tiff R-CaMP registradas geradas na etapa 4.3.3.4. Se as imagens registradas já tiverem sido carregadas como uma variável no espaço de trabalho, omita esta etapa.
- Use a função mean para gerar uma imagem de projeção de tempo. Use a função imshow para mostrar a imagem média como uma figura; use a função roipoly para gerar uma máscara de ROI binária da estrutura alvo (coluna dendrítica nesses dados).
- Usando a função média com as imagens obtidas multiplicando a máscara binária com imagens de cada quadro como variáveis de entrada, calcule a intensidade média de fluorescência dentro da ROI para cada quadro.
- Como descrito anteriormente17, para a variável obtida no passo 4.4.3, aplicar o filtro de frequência de manteiga no ponto de corte = 1,6 s, para cortar ruído de alta frequência, e em seguida aplicar o filtro de mediana deslizante na janela de tempo = 200 s, para cortar ruído de baixa frequência.
Representative Results
Realizamos a injeção de AAV e o implante de janela craniana em V1 de um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP com 8 semanas de idade, conforme descrito neste protocolo. Quatro semanas após a cirurgia, realizamos imagens simultâneas in vivo de dois fótons da atividade neural baseada em R-CaMP e dinâmica microglial na camada 2/3 de V1 (Figura 4 e Vídeo 1). Durante a realização das imagens, o camundongo foi colocado em uma esteira e deixado correr livremente. As imagens foram adquiridas na taxa de quadros de 30 Hz com resolução espacial de 0,25 μm/pixel, utilizando-se objetiva de 25x, 1,1 NA e PMTs GaAsP. Tanto o EGFP quanto o R-CaMP foram excitados em um comprimento de onda de 1.000 nm, e a fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e a fluorescência do R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) foram coletadas simultaneamente. Após o registro dos dados adquiridos para minimizar os artefatos de movimento, a cada quatro quadros foi calculada a média em um quadro para reduzir o ruído de fundo. Estímulos visuais gradeados foram apresentados ao camundongo, e as respostas visuais dos neurônios e espinhos dendríticos individuais foram analisadas (Figura 4D). Os processos microgliais apresentaram dinâmica rápida e mudaram sua morfologia em 10 s (Figura 4E e Vídeo 1). Conforme detalhado na seção Discussão, quando a injeção de AAV falhou, a expressão de R-CaMP não pôde ser detectada. Se a cirurgia não fosse bem sucedida, os sinais de EGFP e R-CaMP não poderiam ser observados.
Figura 1: Injeção de AAV . (A) Uma pipeta de vidro foi conectada a uma seringa Hamilton 26 G usando um tubo de silicone. (B) A configuração para a injeção de AAV. (C) A solução de AAV foi injetada através da pipeta de vidro inclinada 60° anteriormente em relação ao eixo vertical. (D) Diagrama esquemático do procedimento de crânio aberto (descrito no passo 3.3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Janela craniana e placa cefálica . (A) Diagrama esquemático do implante da janela craniana. (B) Foram utilizadas placas de cabeça sob medida. Para exames de imagem no hemisfério direito, o braço mais curto deve ser usado no lado direito. (C) Vista dorsal de um camundongo com janela craniana e placa cefálica implantada. (D) Vista de grande magnificação da janela craniana mostrada na Figura 2C. (E) Vista dorsal de um mouse fixada com o instrumento estereotáxico personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração para imagens in vivo de dois fótons. (A) Vista dorsal do dispositivo de sombreamento. (B) Vista lateral do dispositivo de sombreamento. (C) Vista de um mouse com o dispositivo de sombreamento na placa da cabeça sob a lente objetiva. O mouse é colocado na esteira. (D) Visão sob microscópio de excitação de dois fótons. Um monitor apresentando estímulos visuais é colocado no lado direito da figura. A lente objetiva é coberta com o dispositivo de sombreamento e folha de alumínio preta para evitar a luz do monitor para a lente objetiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dinâmica microglial e respostas visuais em uma coluna dendrítica. (A-C) Imagens de tempo médio dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. (D) Respostas visuais em uma coluna dendrítica. Diagramas de listras com setas pretas indicam a direção dos estímulos de grade apresentados no tempo indicado pelas colunas cinzas. Nos traços de cálcio, linhas cinzas indicam respostas individuais, e uma linha preta indica sua média. No inset direito, uma seta amarela indica a espinha dendrítica na qual a região de interesse (ROI) foi gerada para adquirir os traços de cálcio. (E) O processo microglial (cabeça de seta ciano) mostrou rápida retração em 10 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagem de dois fótons da atividade neuronal e dinâmica microglial. Dados de imagem dos neurônios EGFP(+) microglia e R-CaMP(+) na camada 2/3 de V1 em um camundongo transgênico CX3XR1-EGFP de 12 semanas de idade. No lado esquerdo do filme, magenta indica R-CaMP em neurônios, e verde indica EGFP em microglia. O centro do filme corresponde ao sinal EGFP e o lado direito corresponde ao sinal R-CaMP. A intensidade do sinal em cada canal foi normalizada independentemente. A taxa de quadros do filme é 40 vezes mais rápida do que a taxa real. Barra de escala = 10 μm Clique aqui para baixar este vídeo.
Discussion
Descrevemos o protocolo de injeção de AAV e craniotomia para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados, bem como processamento de dados. Esta técnica pode descobrir a coordenação entre a dinâmica microglial e a atividade neuronal em escalas de tempo que variam de sub-segundo a dezenas de segundos.
O protocolo cirúrgico envolve várias etapas tecnicamente exigentes. A injeção de AAV é uma das etapas críticas. A injeção malsucedida de AAV pode causar uma redução significativa na expressão de R-CaMP. Existem duas razões principais: pipetas de vidro entupidas e danos nos tecidos. O entupimento das pipetas de vidro reduz ou bloqueia completamente a ejeção da solução de AAV. Esta situação pode ser evitada colorindo-se a solução de AAV com um corante como verde rápido e confirmando visualmente o sucesso da injeção. O dano tecidual causado pela injeção de AAV impede a expressão gênica exógena perto do centro do local da injeção. É provável que o dano induzido pela injeção de AAV seja causado por um aumento súbito do efluxo da ponta da pipeta de vidro após o acúmulo da pressão no interior da pipeta. Portanto, a saída da solução de AAV da pipeta de vidro deve ser constante durante a injeção. Selecionar pipetas de vidro com um diâmetro um pouco maior em suas pontas resolveria esse problema. No implante de janela craniana, a velocidade da cirurgia é crítica. Se a cirurgia demorar muito, o tecido cerebral pode ser gravemente danificado. Assim, a prática repetida é necessária para garantir a rapidez e a suavidade da cirurgia. Além disso, durante as 4 semanas entre a cirurgia e os exames de imagem, a qualidade da imagem pode ser reduzida pela regeneração tecidual entre a janela craniana e o tecido cerebral pelo métodoconvencional17. O método aqui supera essa questão aplicando vidros espessos para o disco de vidro interno das janelas cranianas para inibir a regeneração do tecido e manter a janela limpa. No sistema aqui descrito, esse efeito foi evidente com o uso de um disco de vidro interno com espessura de 0,525 ± 0,075 μm.
O método pode ser aplicado com sucesso em camundongos com mais de 4 semanas, mas a aplicação em camundongos mais jovens pode ser problemática. Em camundongos juvenis, o crânio apresenta crescimento rápido e proeminente, o que induz a um descompasso entre o osso craniano e a janela de vidro.
Em alguns estudos de ponta, imagens in vivo de dois fótons foram usadas para estudar interações microglia-neurônio 12,21,23. Especialmente no trabalho pioneiro de Merlini e col., eles realizaram imagens simultâneas in vivo da dinâmica microglial e da atividade neural dentro dos corposcelulares21. Neste método, usando vidros internos mais espessos para janelas cranianas, pudemos suprimir artefatos de movimento na orientação de profundidade e obter a medida estável da atividade neuronal em microestruturas, como espinhos dendríticos. Este método ajudaria a investigar as interações sinapse-processo microglial em camundongos acordados.
Recentemente, estudos in vitro demonstraram que processos microgliais filopódios finos têm motilidade mais rápida do que processos espessos, sugerindo a importância de sua motilidade mais rápida na vigilância19. O sistema aqui pode rastrear a motilidade de processos microgliais finos com uma resolução temporal de um sub-segundo a algumas dezenas de segundos. Esta propriedade ajuda a elucidar o significado funcional de sua motilidade para vigilância in vivo.
No futuro, a combinação dessa técnica de imagem com intervenções, como optogenética24 ouquimiogenética25, aplicadas a circuitos neurais locais ou conexões neurais inter-regionais, lançaria luz sobre novas funções microgliais no desenvolvimento sináptico e plasticidade que esculpem características de circuitos neurais. Além disso, uma maior integração de tarefas de imagem, intervenção e comportamentais contribuiria para revelar a coordenação da microglia e dos neurônios subjacentes a comportamentos específicos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Masashi Kondo e ao Dr. Masanori Matsuzaki pelo fornecimento de vetores virais. Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), pela Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 e JP17gm5010003 to S.O. e JP19dm0207082 to H.M.), pelo UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), pela Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 to H.M.), Brain Science Foundation (para H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
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