Summary
هنا ، نصف بروتوكولا يجمع بين حقن الفيروس المرتبط بالغدي وزرع نافذة الجمجمة للتصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة.
Abstract
نظرا لأن وظائف الدماغ تخضع للتأثير المستمر للإشارات المشتقة من الأنسجة المحيطية ، فمن الأهمية بمكان توضيح كيفية استشعار الخلايا الدبقية في الدماغ للظروف البيولوجية المختلفة في المحيط ونقل الإشارات إلى الخلايا العصبية. تشارك الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية في الدماغ ، في التطور المشبكي واللدونة. لذلك ، يجب اختبار مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في بناء الدائرة العصبية استجابة للحالة الداخلية للجسم بشكل حاسم عن طريق التصوير داخل الجسم للعلاقة بين ديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي.
هنا ، نصف تقنية للتصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة. تم حقن ترميز الفيروس المرتبط بالغدي R-CaMP ، وهو مؤشر كالسيوم مشفر جينيا لبروتين مضان أحمر ، في الطبقة 2/3 من القشرة البصرية الأولية في الفئران المعدلة وراثيا CX3CR1-EGFP التي تعبر عن EGFP في الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد الحقن الفيروسي ، تم تثبيت نافذة الجمجمة على سطح الدماغ في المنطقة المحقونة. أظهر التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي في الفئران المستيقظة بعد 4 أسابيع من الجراحة أنه يمكن تسجيل النشاط العصبي وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في وقت واحد بدقة زمنية دون الثانية. يمكن لهذه التقنية أن تكشف عن التنسيق بين ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي ، حيث تستجيب الأولى للحالات المناعية المحيطية والأخيرة تشفر حالات الدماغ الداخلية.
Introduction
هناك أدلة متزايدة على أن الحالة الداخلية للجسم تؤثر باستمرار على وظائف الدماغ في الحيوانات1،2،3،4،5. وفقا لذلك ، للحصول على فهم أعمق لوظائف الدماغ ، من الأهمية بمكان توضيح كيفية مراقبة الخلايا الدبقية في الدماغ للظروف البيولوجية في المحيط ونقل المعلومات إلى الخلايا العصبية.
تشارك الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية في الدماغ ، في التطور المشبكي واللدونة ، والتي تنحت خصائص الدوائر العصبية في الدماغ6،7،8،9. على سبيل المثال ، أظهر العمل الرائد الذي قام به Wake et al. أن العمليات الدبقية الصغيرة تتلامس مع نقاط الاشتباك العصبي بطريقة تعتمد على النشاط العصبي في القشرة المخية الحديثة للفأر وأن نقص التروية الاصطناعي يؤدي إلى فقدان المشبك العصبي بعد الاتصال المطول مع الخلايا الدبقيةالصغيرة 10. وجد Tremblay et al. أن تغيير التجربة البصرية يغير طريقة التفاعل الدبقي الصغير مع نقاط الاشتباك العصبي. خلال الفترة الحرجة التي يزداد فيها دوران العمود الفقري التغصني في القشرة البصرية الأولية (V1) عن طريق الحرمان من مجهر ، يقلل التكيف الداكن من حركة العمليات الدبقية الصغيرة ويزيد من تواتر الاتصال مع الشقوق المشبكية وعدد الادراج الخلوية في الخلايا الدبقية الصغيرة11. تشير هذه النتائج إلى أن العمليات الدبقية الصغيرة تستشعر النشاط العصبي والبيئة المحيطة بها لإعادة تشكيل الدوائر العصبية. علاوة على ذلك ، ذكرت دراسة حديثة أن مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة تختلف بين حالات اليقظة والتخدير ، مما يشير إلى أهمية التجارب التي تستخدم الفئران المستيقظة للتحقيق في التواصل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الفسيولوجية12.
يعد تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الجسم الحي أداة قوية لتسجيل ديناميكيات الكالسيوم ، مما يعكس إطلاق الخلايا العصبية المستمر ، في مئات الخلايا العصبية في وقت واحد في حي13،14،15. يتطلب تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية عموما دقة زمنية تزيد عن بضعة هرتز لتتبع الاستجابات العصبية السريعة16,17. في المقابل ، قامت الدراسات السابقة التي تتبع ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة بأخذ عينات من الهياكل الدبقية الصغيرة بدقة زمنية منخفضة نسبيا تقل عن 0.1 هرتز18،19،20. طبقت إحدى الدراسات الحديثة التصوير المتزامن ثنائي الفوتون لفهم اتصال الخلايا العصبية والخلايا الدبقيةالصغيرة 21. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تستجيب العمليات الدبقية الصغيرة الديناميكية للنشاط العصبي المحيط بدقة زمنية تزيد عن بضعة هرتز في الفئران المستيقظة. من أجل معالجة هذه المشكلة ، وصفنا طريقة تصوير متزامنة ثنائية الفوتون في الجسم الحي للنشاط العصبي وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة بدقة زمنية أعلى من 1 هرتز في الفئران المستيقظة. تسمح لنا هذه الطريقة بتحقيق تصوير مستقر في الفئران المستيقظة بمعدل إطارات أعلى (الحد الأقصى ، 30 هرتز مع حجم إطار بكسل 512 × 512 بكسل) وتوفر طريقة أكثر ملاءمة للتحقيق في سلوك مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة أو تفاعلها مع النشاط العصبي في الفئران المستيقظة.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان ولجنة سلامة التجارب الوراثية المؤتلفة في كلية الطب العليا وكلية الطب بجامعة طوكيو ، وتم إجراؤها وفقا لإرشاداتهم.
1. التحضير
- تعقيم جميع الأدوات والأجهزة اللازمة للجراحة باستخدام الأوتوكلاف أو 70٪ من الإيثانول.
- إعداد ماصة الزجاج.
- ثبت بإحكام شعيرات دموية معايرة 75 ميكرولتر على حامل مجتذب الماصة الدقيقة. اضبط الساحب على البرنامج مع المعلمات الموصى بها ك P (الضغط) = 500 ، HEAT = 680 ، PULL = 30 ، VEL = 60 ، TIME = 180.
- بعد الانتهاء من البرنامج (عادة من 4.5 إلى 5 ثوان) ، تنقسم الشعيرات الدموية إلى ماصات زجاجية مع ذيول مستدقة. ثم ، كسر الجزء البعيد من ذيول مع ملاقط للحفاظ على قطر الطرف في حدود 30-50 ميكرومتر. لهذا ، كسر ذيول 1 سم البعيدة حتى نهاية الجزء المشطوف.
- لحج القحف ، قم بإعداد نافذة الجمجمة عن طريق لصق قرص زجاجي خارجي أكبر ، قطره 4 مم ، وسمك 0.15 ± 0.02 مم ، إلى قرص زجاجي داخلي أصغر ، قطره 2 مم ، سمك 0.525 ± 0.075 مم ، باستخدام كاشف معالجة ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2 أ).
2. حقن AAV
- تحضير جهاز الحقن
- ضع ماصة زجاجية متصلة بحقنة هاملتون 26 جيجا من خلال أنبوب على حامل ماصة لأداة مجسمة ، ثم قم بإمالة حامل الماصة 60 درجة إلى الأمام من المحور الرأسي (الشكل 1 أ ، ب).
- املأ الماصة الزجاجية والمحقنة وأنبوب التوصيل بالبارافين السائل. ضع المحقنة على حاقن دقيق.
- الإجراء الجراحي
ملاحظة: تم إجراء الجراحة التالية في كشك معقم. تم استخدام مجهر مجسم للجراحة إذا لزم الأمر.- تخدير ذكر ماوس CX3CR1-EGFP (معلومات مفصلة في جدول المواد) في عمر 7 إلى 8 أسابيع (وزن الجسم 22-26 جم) مع 3٪ إيزوفلوران في غرفة محكمة الغلق. بعد 3 دقائق ، أخرج الفأر من الغرفة عندما يفقد الحركة الإرادية باستثناء التنفس ، ثم انتقل إلى التخدير المستمر بواسطة أنبوب أنفي يحتوي على 2٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: من المعروف أن إيزوفلوران ينشط الخلايا الدبقية الصغيرة. ومع ذلك ، نظرا لأن التصوير يتم إجراؤه بعد 4 أسابيع من الجراحة ، فلا يوجد أي تأثير للأيزوفلوران على الفئران أثناء التصوير. على الرغم من استخدام تخدير الأيزوفلوران لبضع دقائق عندما يتم وضع الفئران في أداة التجسيم قبل التصوير (الخطوة 4.2.1) ، وجدنا أن تأثير هذا التخدير القصير لا يكاد يذكر. - أثناء الجراحة ، حافظ على دفء الماوس باستخدام وسادة تدفئة عند 37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية وتطبيق حقن ميلوكسيكام تحت الجلد (5 ملغ/كغ). قم بتوصيل الماوس بشريط أذن إضافي ، ثم قم بتثبيت الماوس على أداة التجسيم مع جانبها الظهري لأعلى.
- اضبط تركيز الأيزوفلوران على نسبة مناسبة (1٪ -2٪) أثناء الجراحة أثناء مراقبة التنفس ومعدل ضربات القلب. قم بإزالة الشعر باستخدام كريم مزيل الشعر وتطهير الرأس عدة مرات بحركة دائرية باستخدام كل من المقشر القائم على اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول. ثم ، حقن 0.1 مل من 1 ٪ يدوكائين تحت الجلد وتطبيق الستائر المعقمة لتأمين موقع الجراحة.
- شق فروة الرأس مفتوحة على طول خط الوسط بالمقص وجعل الشق بطول حوالي 2 سم ، لضمان التعرض الجيد للجمجمة فوق القشرة البصرية الأولية اليمنى. بعد شق فروة الرأس ، قم بري الرأس بالمحلول الملحي طوال العملية بأكملها لمنع الجمجمة والدماغ المكشوفين من الجفاف.
- إزالة السمحاق على الجمجمة المكشوفة باستخدام ملقط. حفر الجمجمة على الإحداثيات المجسمة: 3 مم جانبي إلى خط الوسط ، 0.5 مم أمامي لخط لامدا ، لإنشاء ثقب صغير بقطر 0.5 مم تقريبا. شطف الدم وحطام الأنسجة من لقمة الحفر ، إذا لزم الأمر.
- املأ الماصة الزجاجية ب 1 ميكرولتر من rAAV2 / 1-hSyn-R-CaMP1.07 باستخدام الإجراء التالي عند عيار 8.3 × 1012 جينوم متجه / مل22.
- تقدم المحقنة لإخراج 1 ميكرولتر من البارافين السائل من الماصة الزجاجية. ضع قطعة من الفيلم الشفاف ، حوالي 2 سم × 2 سم ، على الجمجمة المكشوفة للماوس وطرد قطرة من 1 ميكرولتر من محلول AAV على الفيلم باستخدام ماصة.
- ضع طرف الماصة الزجاجي في قطرة محلول AAV على الفيلم واسحب المحقنة برفق لشفط محلول AAV. بعد الطرد ، أدر المحبس على شكل حرف T لتحرير الضغط داخل الأنبوب والماصة الزجاجية.
- أدخل الماصة الزجاجية على عمق 500 ميكرومتر من سطح الدماغ من خلال الفتحة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.2.5 ، ثم قم بحقن 0.5 ميكرولتر من محلول AAV باستخدام الحاقن الدقيق (الشكل 1C). استخدم معدل تدفق حجم الحقن البالغ 2.0 ميكرولتر / ساعة ؛ يستغرق حقن 0.5 ميكرولتر 15 دقيقة ، ثم ينتظر بعد ذلك لمدة 5 دقائق.
- بعد الحقن ، اسحب الماصة الزجاجية برفق وشطف سطح الدماغ بالمحلول الملحي.
- تخدير ذكر ماوس CX3CR1-EGFP (معلومات مفصلة في جدول المواد) في عمر 7 إلى 8 أسابيع (وزن الجسم 22-26 جم) مع 3٪ إيزوفلوران في غرفة محكمة الغلق. بعد 3 دقائق ، أخرج الفأر من الغرفة عندما يفقد الحركة الإرادية باستثناء التنفس ، ثم انتقل إلى التخدير المستمر بواسطة أنبوب أنفي يحتوي على 2٪ إيزوفلوران.
3. زرع نافذة الجمجمة
ملاحظة: زرع نافذة الجمجمة يتبع حقن AAV في نفس اليوم.
- ضع علامة على دائرة قطرها 2.5 مم على الجمجمة ، تتمركز 3 مم بشكل جانبي من لامدا. إنشاء أخدود دائري على طول العلامة على الجمجمة عن طريق الحفر. نظف الحطام لأنه قد يؤثر سلبا على رؤية الجمجمة واستخدم محلول ملحي أثناء عملية الحفر لمنع التسخين.
- للتحقق مما إذا كان عمق الحفر في الأخدود الدائري كافيا لإزالة جزء الجمجمة المركزي ، اضغط برفق على الجمجمة المركزية بالملقط. إذا تحرك عموديا مع مقاومة قليلة ، يكون عمق الحفر كافيا.
- عندما يصل الأخدود إلى عمق كاف ، أدخل طرف الملقط في الجزء السفلي من جزء الجمجمة المركزي وارفعه برفق وأزله لكشف سطح الدماغ (الشكل 1 د).
- باستخدام إبرة 27 G ، وخز وتمزيق الجافية على حافة سطح الدماغ المكشوف. أدخل طرف الملقط من خلال الفتحة المصنوعة على حافة الجافية. امسك الجافية وقشرها لكشف سطح الدماغ.
ملاحظة: في حالة حدوث نزيف ، اشطف سطح المخ بمحلول ملحي حتى يتوقف النزيف. - باستخدام الملقط ، قم بتفريق ألياف مرقئ واحدة تلو الأخرى في محلول ملحي في طبق 3.5 مم ، ثم ضع ألياف مرقئ على طول هوامش الفتحة التي يوجد فيها الجافية المعبرة.
- ضع نافذة الجمجمة المحضرة في الخطوة 1.3 على سطح الدماغ المكشوف ، ثم ألصقها بالجمجمة بالغراء الفوري مع الضغط برفق على النافذة بحيث تكون النافذة على اتصال وثيق بالجمجمة.
- بعد ذلك ، ضع الغراء الفوري على الجمجمة المكشوفة بأكملها ، ثم قم بتوصيل لوحة رأس بعناية على الجمجمة بحيث تقع النافذة في وسط الفتحة المربعة للوحة الرأس (الشكل 2C). تأكد من أن سطح لوحة الرأس مواز لسطح النافذة الزجاجية.
- بعد أن يصلب الغراء بدرجة كافية ، ضع الأسمنت السني على الجمجمة المكشوفة لتعزيز الارتباط بين الرأس ولوحة الرأس (الشكل 2).
ملاحظة: إذا تضمنت التجارب عرض محفزات بصرية على الفئران ، فيجب تجنب الضوء الشارد إلى منطقة التصوير. ينصح بتعتيم الأسمنت عن طريق مزجه بالفحم المنشط لتقليل انعكاس الضوء. - اسحب الماوس من التخدير بعد أن يصلب الأسمنت بدرجة كافية (حوالي 20 دقيقة). ثم ضع الماوس في قفص جديد للتعافي بمفرده.
- بعد تأكيد وعيه وحركته الطوعية ، مما يشير إلى الشفاء التام ، أعد الماوس إلى قفص المنزل. أثناء الشفاء ، يتم تطبيق جرعة ثانية أو أكثر إذا لزم الأمر من ميلوكسيكام (مرة كل 24 ساعة لمدة 1-3 أيام) في حالة حدوث سلوكيات واضحة تشير إلى الألم.
4. في الجسم الحي التصوير ثنائي الفوتون من الخلايا الدبقية الصغيرة وديناميات الكالسيوم العصبية
- تعود الفئران على جهاز المجهر
- بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة ، قم بتخدير الفأر بنسبة 3٪ إيزوفلوران ، واضبط الماوس تحت العدسة الموضوعية 25x لمجهر ثنائي الفوتون باستخدام أداة مجسمة مصنوعة خصيصا (الشكل 3C). بالنسبة للإعداد هنا ، يتم ضبط الماوس على الجزء العلوي من جهاز المشي ويسمح له بالعمل بحرية.
- بعد حوالي 10 دقائق ، أخرج الماوس من مرحلة المجهر وأعده إلى القفص المنزلي. كرر التعود 3 مرات على الأقل كل يوم بديل قبل الحصول على صورة فوتونين.
- الحصول على صورة ثنائية الفوتون
ملاحظة: نوصي بإجراء التقاط الصورة بعد أكثر من 4 أسابيع من الجراحة ، حيث يعود تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة تدريجيا إلى المستوى القاعدي.- كما في الخطوة 4.1 ، قم بتحفيز التخدير في الماوس باستخدام 3٪ isoflurane واضبط الماوس تحت العدسة الموضوعية للمجهر ثنائي الفوتون باستخدام أداة مجسمة مصنوعة خصيصا.
- قم بتثبيت جهاز التظليل المخصص وشاشة LCD للتحفيز البصري كما هو موضح أدناه (الشكل 3D).
- ضع العدسة للتركيز على سطح الدماغ ، ثم اضبط موضع العدسة هذا على أنه موضع Z الأصلي. حافظ على إحداثيات x-y ثابتة وارفع العدسة الشيئية ؛ قم بإزالة الماوس والأداة المجسمة من العدسة الموضوعية وجهاز المشي.
- قم بتوصيل جهاز تظليل أعلى لوحة الرأس باستخدام السيليكون ، والذي يتم اسوداده عن طريق الخلط مع مسحوق الفحم ، وتأكد من أن المسافة بين لوحة الرأس وجهاز التظليل محكمة الغلق.
- املأ جهاز التظليل بالماء المقطر ، ثم قم بإصلاح الماوس والإطار التجسيمي مرة أخرى تحت الهدف وعلى جهاز المشي. أعد ضبط المستوى البؤري بعناية على سطح الدماغ ، وتحقق من عمق العدسة الموضوعية.
ملاحظة: لتجنب خطر تلف العدسة الشيئية، قم بتعيين إحداثيات xyz أولا، ثم قم بتطبيق جهاز التظليل الخاص بالعدسة الموضوعية. من المعقول أيضا تثبيت الغطاء أولا ، ثم ضبط الإحداثيات ، ولكن المعالجة الحذرة ضرورية لهذا الخيار. - قم بتغطية العدسة الموضوعية بورق الألمنيوم الأسود لتجنب تلوث الضوء من شاشة LCD المستخدمة للتحفيز البصري من خلال العدسة الموضوعية (الشكل 3D). اضبط شاشة LCD مقاس 10 بوصات على ارتفاع 12.5 سم أمام عيني الماوس لتقديم محفزات بصرية (الشكل 3D).
- قم بتكوين مرشحات تجميع الانبعاثات الفلورية إلى مضان EGFP (مرشح انبعاث 525/50 نانومتر) ومضان R-CaMP (مرشح انبعاث 593/46 نانومتر) والطول الموجي للإثارة إلى 1000 نانومتر. احصل على صور بدقة مكانية تبلغ 0.25 ميكرومتر / بكسل باستخدام هدف 25x 1.1 NA و GaAsP PMTs.
- ابحث عن منطقة التصوير التي يمكن فيها تصوير الخلايا العصبية R-CaMP(+) والخلايا الدبقية الصغيرة EGFP (+) في وقت واحد في الطبقة 2/3. بالنسبة لهذا الإعداد ، كانت البيانات التي تم الحصول عليها في الشكل 4 والفيديو 1 على عمق 100 ميكرومتر من سطح pial ، باستخدام معاينة صورة حية. حافظ على قوة ليزر الإثارة منخفضة قدر الإمكان لتجنب تبييض الصور والأضرار الناجمة عن زيادة درجة الحرارة المحلية في منطقة التصوير.
- احصل على صور بمعدل إطارات 30 هرتز. بالتزامن مع الحصول على الصورة ، قدم محفزات بصرية مبهمة عند تباين 100٪ ، 1.5 هرتز ، 0.04 دورة لكل درجة في 12 اتجاها في 6 اتجاهات من 0 درجة إلى 150 درجة في خطوات 30 درجة للماوس17.
- بعد الحصول على الصورة ، قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر ، وافصل جهاز التظليل وأداة التجسيم عن الماوس ، وأعد الماوس إلى قفصه المنزلي.
- تسجيل البيانات
- قم بتحويل وحفظ بيانات الصورة المكتسبة (تنسيق nd2 في هذه الحالة) كسلسلة من ملفات صور tiff لكل قناة ملونة ، باستخدام Fiji أو البرنامج المرفق مع المجهر.
- قم بتطبيق Turboreg ، وهو مكون إضافي لفيجي ، لإجراء التسجيل باستخدام الوضع = الترجمة. استخدم متوسط الصورة كصورة مرجعية مع ملفات صور tiff لقناة EGFP.
- قم بإجراء المعالجة التالية لكل إطار باستخدام MATLAB.
ملاحظة: على الرغم من استخدام MATLAB في المعالجة التالية ، إلا أن الوصف يركز بشكل أساسي على نية كل خطوة بحيث يمكن تحليل البيانات بواسطة برامج برمجة أخرى مثل Python.- استخدم وظيفة القراءة لقراءة صورتين EGFP tiff قبل وبعد تسجيل نفس الإطار ، على التوالي. استخدم وظيفة القراءة لقراءة صورة R-CaMP tiff لنفس الإطار.
- استخدم الدالة normcorr2 لحساب دالة الارتباط بين المتغيرات المتجهة لصورتي GFP المقروءتين في الخطوة 4.3.3.1.
- استخدم الدالة max للكشف عن الفهرس الخطي بأعلى ارتباط متقاطع لدالة الارتباط ، ثم استخدم الدالة ind2sub لحساب موضع حركة الصورة المسجلة من صورتها الأصلية.
- استخدم الدالة imwarp لترجمة صورة R-CaMP إلى الموضع المحسوب في الخطوة 4.3.3.3، ثم استخدم الدالة imwrite لحفظ الصورة المسجلة ل R-CaMP.
- توليد آثار الكالسيوم
- قم بإجراء المعالجة التالية باستخدام MATLAB. استخدم وظيفة imread لقراءة جميع صور R-CaMP tiff المسجلة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.3.3.4. إذا تم تحميل الصور المسجلة بالفعل كمتغير في مساحة العمل، فاحذف هذه الخطوة.
- استخدم الدالة المتوسطة لإنشاء صورة إسقاط الوقت. استخدم وظيفة imshow لإظهار الصورة المتوسطة كرقم ؛ استخدم دالة Roipoly لإنشاء قناع عائد استثمار ثنائي للبنية المستهدفة (العمود الفقري التغصني في هذه البيانات).
- باستخدام دالة المتوسط مع الصور التي تم الحصول عليها عن طريق ضرب القناع الثنائي بصور كل إطار كمتغيرات إدخال ، احسب متوسط شدة التألق ضمن عائد الاستثمار لكل إطار.
- كما هو موضح سابقا17 ، على المتغير الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.4.3 ، قم بتطبيق مرشح تردد قيمة الزبدة عند القطع = 1.6 ثانية ، لخفض الضوضاء عالية التردد ، ثم قم بتطبيق مرشح الوسيط المنزلق في النافذة الزمنية = 200 ثانية ، لخفض ضوضاء التردد المنخفض.
Representative Results
أجرينا حقن AAV وزرع نافذة الجمجمة في V1 لماوس CX3XR1-EGFP المعدل وراثيا عمره 8 أسابيع كما هو موضح في هذا البروتوكول. بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، أجرينا تصويرا متزامنا في الجسم الحي ثنائي الفوتون للنشاط العصبي القائم على R-CaMP، وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الطبقة 2/3 من V1 (الشكل 4 والفيديو 1). أثناء التصوير ، تم وضع الماوس على جهاز المشي وسمح له بالركض بحرية. تم الحصول على الصور بمعدل إطارات 30 هرتز مع استبانة مكانية تبلغ 0.25 ميكرومتر / بكسل باستخدام هدف 25x و 1.1 NA و GaAsP PMTs. تم إثارة كل من EGFP و R-CaMP بطول موجي يبلغ 1000 نانومتر ، وتم جمع مضان EGFP (مرشح انبعاث 525/50 نانومتر) ومضان R-CaMP (مرشح انبعاث 593/46 نانومتر) في وقت واحد. بعد تسجيل البيانات المكتسبة لتقليل عناصر الحركة ، تم حساب متوسط كل أربعة إطارات في إطار واحد لتقليل ضوضاء الخلفية. تم تقديم المحفزات البصرية الشبكية للفأر ، وتم تحليل الاستجابات البصرية للخلايا العصبية والعمود الفقري الشجيري الفردي (الشكل 4D). أظهرت العمليات الدبقية الصغيرة ديناميكيات سريعة وغيرت مورفولوجيتها في غضون 10 ثوان (الشكل 4E والفيديو 1). كما هو مفصل في قسم المناقشة ، عندما فشل حقن AAV ، تعذر اكتشاف تعبير R-CaMP. إذا لم تنجح الجراحة ، فلا يمكن ملاحظة إشارات EGFP و R-CaMP.
الشكل 1: حقن AAV . (أ) تم توصيل ماصة زجاجية بحقنة هاملتون 26 G باستخدام أنبوب سيليكون. (ب) الإعداد لحقن AAV. (C) تم حقن محلول AAV عبر ماصة زجاجية مائلة 60 درجة إلى الأمام من المحور الرأسي. (د) رسم تخطيطي لإجراء الجمجمة المفتوحة (الموصوف في الخطوة 3.3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نافذة الجمجمة ولوحة الرأس. (أ) رسم تخطيطي لزراعة نافذة الجمجمة. (ب) تم استخدام ألواح رأس مصنوعة حسب الطلب. للتصوير في نصف الكرة الأيمن ، يجب استخدام الذراع الأقصر على الجانب الأيمن. ج: منظر ظهري لفأر به نافذة جمجمة وصفيحة رأس مزروعة. (د) منظر تكبير عالي لنافذة الجمجمة الموضح في الشكل 2C. (ه) منظر ظهري لفأر مثبت بأداة مجسمة مصنوعة خصيصا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإعداد للتصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي . (أ) منظر ظهري لجهاز التظليل. ( ب) منظر جانبي لجهاز التظليل. ( ج) منظر للماوس مع جهاز التظليل على لوحة الرأس تحت العدسة الموضوعية. يتم وضع الماوس على حلقة مفرغة. د: العرض تحت مجهر الإثارة ثنائي الفوتون. يتم وضع شاشة تقدم محفزات بصرية على الجانب الأيمن من الشكل. العدسة الموضوعية مغطاة بجهاز التظليل ورقائق الألومنيوم السوداء لتجنب الضوء من الشاشة إلى العدسة الموضوعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ديناميكا الخلايا الدبقية الصغرى والاستجابات البصرية في العمود الفقري التغصني. (A-C) صور متوسطة الوقت للخلايا العصبية EGFP (+) الخلايا العصبية microglia و R-CaMP (+) في الطبقة 2/3 من V1 في فأر معدل وراثيا CX3XR1-EGFP عمره 12 أسبوعا. تم تطبيع شدة الإشارة في كل قناة بشكل مستقل. د: الاستجابات البصرية في العمود الفقري التغصني. تشير المخططات الشريطية ذات الأسهم السوداء إلى اتجاه محفزات الشبكة المعروضة في التوقيت المشار إليه بالأعمدة الرمادية. في آثار الكالسيوم ، تشير الخطوط الرمادية إلى الاستجابات الفردية ، ويشير الخط الأسود إلى متوسطها. في الجزء الداخلي الأيمن ، يشير رأس السهم الأصفر إلى العمود الفقري الشجيري الذي تم فيه إنشاء منطقة الاهتمام (ROI) للحصول على آثار الكالسيوم. (ه) أظهرت عملية الخلايا الدبقية الصغيرة (رأس السهم السماوي) تراجعا سريعا في 10 ثوان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: تصوير ثنائي الفوتون للنشاط العصبي وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة. بيانات التصوير للخلايا الدبقية الصغيرة EGFP (+) والخلايا العصبية R-CaMP(+) في الطبقة 2/3 من V1 في فأر معدل وراثيا CX3XR1-EGFP عمره 12 أسبوعا. على الجانب الأيسر من الفيلم ، يشير اللون الأرجواني إلى R-CaMP في الخلايا العصبية ، ويشير اللون الأخضر إلى EGFP في الخلايا الدبقية الصغيرة. يتوافق مركز الفيلم مع إشارة EGFP ، ويتوافق الجانب الأيمن مع إشارة R-CaMP. تم تطبيع شدة الإشارة في كل قناة بشكل مستقل. معدل الإطارات للفيلم أسرع 40 مرة من المعدل الفعلي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Discussion
وصفنا بروتوكول حقن AAV وحج القحف للتصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة وكذلك معالجة البيانات. يمكن لهذه التقنية الكشف عن التنسيق بين ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي على نطاقات زمنية تتراوح من دون الثانية إلى عشرات الثواني.
يتضمن بروتوكول الجراحة عدة خطوات تتطلب الكثير من الناحية الفنية. حقن AAV هو أحد الخطوات الحاسمة. قد يتسبب حقن AAV غير الناجح في انخفاض كبير في التعبير عن R-CaMP. هناك سببان رئيسيان: انسداد الماصات الزجاجية وتلف الأنسجة. يؤدي انسداد الماصات الزجاجية إلى تقليل أو منع طرد محلول AAV تماما. يمكن تجنب هذا الموقف عن طريق تلوين محلول AAV بصبغة مثل الأخضر السريع وتأكيد نجاح الحقن بصريا. يمنع تلف الأنسجة الناجم عن حقن AAV التعبير الجيني الخارجي بالقرب من مركز موقع الحقن. من المحتمل أن يكون الضرر الناجم عن حقن AAV ناتجا عن زيادة مفاجئة في التدفق من طرف الماصة الزجاجية بعد تراكم الضغط داخل الماصة. لذلك ، يجب أن يكون تدفق محلول AAV من الماصة الزجاجية ثابتا أثناء الحقن. إن اختيار الماصات الزجاجية ذات القطر الأوسع قليلا عند أطرافها من شأنه أن يحل هذه المشكلة. في زرع نافذة الجمجمة ، تكون سرعة الجراحة أمرا بالغ الأهمية. إذا استغرقت الجراحة وقتا طويلا ، فقد تتضرر أنسجة المخ بشدة. وفقا لذلك ، الممارسة المتكررة ضرورية لضمان سرعة وسلاسة الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، خلال 4 أسابيع من الجراحة إلى التصوير ، يمكن تقليل جودة التصوير عن طريق تجديد الأنسجة بين نافذة الجمجمة وأنسجة المخ بالطريقة التقليدية17. تتغلب الطريقة هنا على هذه المشكلة عن طريق تطبيق نظارات سميكة للقرص الزجاجي الداخلي للنوافذ القحفية لمنع تجديد الأنسجة والحفاظ على النافذة واضحة. في النظام الموصوف هنا ، كان هذا التأثير واضحا باستخدام قرص زجاجي داخلي بسمك 0.525 ± 0.075 ميكرومتر.
يمكن تطبيق الطريقة بنجاح على الفئران التي يزيد عمرها عن 4 أسابيع ، ولكن التطبيق على الفئران الأصغر سنا قد يكون مشكلة. في الفئران اليافعة ، تظهر الجمجمة نموا سريعا وبارزا ، مما يؤدي إلى عدم تطابق بين عظم الجمجمة والنافذة الزجاجية.
في بعض الدراسات المتطورة ، تم استخدام التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة12،21،23. خاصة في العمل الرائد الذي قام به Merlini et al. ، قاموا بالتصوير المتزامن في الجسم الحي لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي داخل أجسام الخلايا21. في هذه الطريقة ، باستخدام نظارات داخلية أكثر سمكا لنوافذ الجمجمة ، يمكننا قمع القطع الأثرية الحركية في اتجاه العمق وتحقيق قياس مستقر للنشاط العصبي في الهياكل المجهرية ، مثل العمود الفقري التغصني. ستساعد هذه الطريقة في التحقيق في تفاعلات عملية المشبك العصبي والخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران المستيقظة.
في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة في المختبر أن العمليات الدبقية الصغيرة الرقيقة الشبيهة بالفيلوبوديا لها حركة أسرع من العمليات السميكة ، مما يشير إلى أهمية حركتها الأسرع في المراقبة19. يمكن للنظام هنا تتبع حركة العمليات الدبقية الصغيرة الرقيقة بدقة زمنية من ثانية إلى بضع عشرات من الثواني. تساعد هذه الخاصية في توضيح الأهمية الوظيفية لحركتها للمراقبة في الجسم الحي.
في المستقبل ، فإن الجمع بين تقنية التصوير هذه والتدخلات ، مثل علم البصريات الوراثي24 أو علم الوراثة الكيميائي25 ، المطبق على الدوائر العصبية المحلية أو الاتصالات العصبية بين الأقاليم من شأنه أن يلقي الضوء على وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة الجديدة في التطور المشبكي واللدونة التي تنحت خصائص الدوائر العصبية. أيضا ، فإن المزيد من التكامل بين التصوير والتدخل والمهام السلوكية من شأنه أن يساهم في الكشف عن تنسيق الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية الكامنة وراء سلوكيات محددة.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ماساشي كوندو والدكتور ماسانوري ماتسوزاكي على توفير ناقلات الفيروس. تم دعم هذا العمل من قبل المنح في المعونة للبحث العلمي (20H00481 ، 20A301 ، 20H05894 ، 20H05895 إلى S.O.) ، الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (JP19gm1310003 و JP17gm5010003 إلى S.O. و JP19dm0207082 إلى HM) ، ومركز UTokyo للعلوم التكاملية للسلوك البشري (CiSHuB) ، ووكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية Moonshot R &D (JPMJMS2024 to H.M.) ، مؤسسة علوم الدماغ (إلى H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
- Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
- Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
- Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
- Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Roth, B. L.
