Summary
El análisis de imágenes de códigos de barras multiplexadas ha mejorado recientemente la caracterización del microambiente tumoral, permitiendo estudios exhaustivos de la composición celular, el estado funcional y las interacciones célula-célula. Aquí, describimos un protocolo de tinción e imagen utilizando el código de barras de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos y el ciclo de imágenes, que permite el uso de una técnica de análisis de imágenes de alta dimensión.
Abstract
La tecnología de imágenes multiplexadas que utiliza códigos de barras de anticuerpos con oligonucleótidos, que detecta secuencialmente múltiples epítopos en la misma sección de tejido, es una metodología efectiva para la evaluación de tumores que mejora la comprensión del microambiente tumoral. La visualización de la expresión de proteínas en tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina se logra cuando un fluoróforo específico se recoce a un código de barras unido a anticuerpos a través de oligonucleótidos complementarios y luego se realiza una imagen de muestra; De hecho, este método permite el uso de paneles personalizables de más de 40 anticuerpos en una sola reacción de tinción tisular. Este método es compatible con tejido fresco congelado, tejido fijado en formalina, tejido incrustado en parafina, células cultivadas y células mononucleares de sangre periférica, lo que significa que los investigadores pueden usar esta tecnología para ver una variedad de tipos de muestras a una resolución de una sola célula. Este método comienza con un protocolo manual de tinción y fijación, y todos los códigos de barras de anticuerpos se aplican utilizando un cóctel de anticuerpos. El instrumento de tinción fluídica está totalmente automatizado y realiza ciclos iterativos de etiquetado, imágenes y eliminación de fluoróforos espectralmente distintos hasta que todos los biomarcadores hayan sido fotografiados utilizando un microscopio de fluorescencia estándar. Luego, las imágenes se recopilan y compilan en todos los ciclos de imágenes para lograr una resolución de una sola célula para todos los marcadores. La tinción de un solo paso y la eliminación suave del fluoróforo no solo permiten el análisis de biomarcadores altamente multiplexados, sino que también preservan la muestra para un análisis posterior adicional si se desea (por ejemplo, tinción de hematoxilina y eosina). Además, el software de análisis de imágenes permite el procesamiento de imágenes (compensación de deriva, sustracción de fondo, segmentación celular y agrupamiento), así como la visualización y análisis de las imágenes y fenotipos celulares para la generación de mapas de redes espaciales. En resumen, esta tecnología emplea un sistema microfluídico computarizado y un microscopio de fluorescencia para hibridar iterativamente, obtener imágenes y tirar sondas de ADN marcadas con fluorescencia que son complementarias a los anticuerpos conjugados con oligonucleótidos unidos a tejidos.
Introduction
El microambiente tumoral (EMT) es extremadamente heterogéneo, consistiendo en células tumorales, células del estroma tumoral, células inmunes, componentes no celulares de la matriz extracelular y numerosas moléculas abundantes producidas y liberadas por las células tumorales, estromales e inmunes 1,2. La evidencia acumulada demuestra que el EMT tiene un papel fundamental en la reprogramación de la diferenciación tumoral, el crecimiento, la invasión, la metástasis y la respuesta a las terapias3.
Comprender cómo los diferentes tipos de células en el TME interactúan y se comunican entre sí a través de redes de señalización es esencial para mejorar el diagnóstico del cáncer, optimizar la inmunoterapia y desarrollar nuevos tratamientos4. Las técnicas tradicionales de microscopía tisular, incluida la inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia (IF), se han utilizado durante décadas para estudiar los tipos de células, la abundancia y las comunicaciones en muestras tumorales. Desafortunadamente, estas técnicas típicamente pueden evaluar sólo uno o dos marcadores de proteínas en una sección de tejido y no pueden revelar las complejas relaciones espaciales y estructurales entre estas células 5,8,7.
En las últimas dos décadas, se han establecido varias tecnologías de imágenes multiplexadas8. Estas tecnologías proporcionan vistas mucho mejores de la composición, función y ubicación de las células inmunes dentro del TME, lo que lleva a rápidos avances en la capacidad de identificar y perfilar espacialmente TME complejos a nivel de una sola célula 9,10. Las relaciones espaciales y estructurales de varias células tumorales e inmunes en el TME están ahora a la vanguardia de los estudios biológicos y clínicos que utilizan estas tecnologías de imagen multiplexada11,12.
La tecnología de imágenes multiplexadas recientemente desarrollada utilizando códigos de barras de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos es una influyente plataforma de investigación biológica unicelular basada en la detección de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos en muestras fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE)13,14. Actualmente, esta tecnología de imagen multiplexada permite la obtención simultánea de imágenes de más de 100 marcadores en una sola sección de tejido15, lo que ha aumentado el número de tipos de células que se distinguen in situ. Esto permite un nivel de análisis espacial de las células tumorales e inmunes que no es posible utilizando los enfoques tradicionales de inmunofenotipado16.
Aquí, describimos un protocolo optimizado para conjugar anticuerpos purificados contra oligonucleótidos y validar esta conjugación utilizando la plataforma de imágenes multiplexadas y un procedimiento de imagen multiciclo con tejido FFPE. Además, describimos los procedimientos básicos de procesamiento de imágenes y análisis de datos utilizados con esta tecnología.
Protocol
Este estudio retrospectivo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Las muestras de tejido FFPE se recolectaron de pacientes en el MD Anderson como parte de la atención estándar de rutina. No se realizaron intervenciones diagnósticas o terapéuticas. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para el uso de las muestras recolectadas para la investigación y publicación.
1. Fuentes de anticuerpos utilizadas para el diseño del panel de anticuerpos
- Cree un panel de anticuerpos para imágenes multiplexadas después de considerar cuidadosamente la calidad de los tejidos y proteínas de interés. Se consideran tres fuentes de anticuerpos para el diseño del panel de anticuerpos: 1) anticuerpos totalmente validados comercialmente, 2) anticuerpos examinados con tecnología de imágenes multiplexadas y 3) anticuerpos compartidos por el usuario final.
NOTA: Se ha demostrado que los anticuerpos examinados con tecnología de imágenes multiplexadas funcionan y están disponibles a través de los proveedores. Estos anticuerpos cribados se pueden aplicar a la tinción de imágenes multiplexadas después de la conjugación de oligonucleótidos por parte del usuario. - Si no se puede encontrar una proteína de interés en las fuentes mencionadas anteriormente, emplee los clones de anticuerpos que se sabe que funcionan con IHQ. Además, se recomiendan isotipos de IgG en lugar de clones de IgM para esta tecnología de imágenes multiplexadas debido a la mayor tasa de fallos con IgM que con clones de IgG.
2. Antes de la conjugación de anticuerpos
- Al identificar clones de anticuerpos para la conjugación utilizando códigos de barras de imágenes multiplexadas, considere comprar anticuerpos libres de portadores en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o un tampón similar. Se sabe que las proteínas transportadoras, incluyendo BSA, gluten, glicerol y otros aditivos proteicos, reducen la capacidad de conjugación.
- Seleccione el clon de anticuerpos más adecuado y siempre optimice las condiciones de tinción (es decir, recuperación y titulación del antígeno) antes de la conjugación. Haga esto aplicando un clon de anticuerpos no conjugados al tejido positivo y negativo para este anticuerpo usando IF estándar o IHC.
NOTA: Si un anticuerpo purificado no está disponible comercialmente, se debe realizar un proceso de purificación de anticuerpos antes de la conjugación. El procedimiento de purificación utilizado con los kits de purificación de anticuerpos no se discute aquí.
3. Conjugación de anticuerpos
- Obtener los reactivos de conjugación de anticuerpos. Los kits de conjugación disponibles comercialmente contienen una solución de bloqueo de filtro, solución de reducción 2, solución de conjugación, solución de purificación, solución de almacenamiento de anticuerpos (todas almacenadas a 4 °C) y solución de reducción 1 (almacenada a -20 °C).
- Conjugación
NOTA: Un anticuerpo purificado se trata con un agente reductor, lo que permite que las fracciones reducidas del anticuerpo reaccionen con el código de barras de imágenes multiplexado utilizado con esta tecnología y, por lo tanto, formen un enlace covalente. Este proceso dura aproximadamente 4,5 h y da como resultado aproximadamente 120 μL de anticuerpos conjugados, que es viable durante 1 año. Todo el giro se realiza a temperatura ambiente (RT) y el flujo se descarta, excepto en el último paso (3.2.9), en el que un tubo de recolección contiene el anticuerpo conjugado.- Aspirar y aplicar 500 μL de la solución bloqueadora del filtro con una pipeta a las columnas de filtro de corte de peso molecular de 50 kDa, y girar hacia abajo a 12.000 x g durante 2 min para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos.
NOTA: Si la solución residual en la parte superior de la columna es notable, invierta el filtro en el tubo de recolección y gire hacia abajo a 3,000 x g durante 2 min. - Pipetear 50 μg del anticuerpo en un volumen de solución de 100 μL a la columna del filtro, y girar hacia abajo a 12.000 x g durante 8 min.
NOTA: Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración del anticuerpo purificado y para calcular el volumen de solución correspondiente a 50 μg del anticuerpo. Si el volumen de la solución de anticuerpos es inferior a 100 μL, ajuste el volumen a 100 μL agregando 1x PBS. Retener 1 μg de anticuerpos no conjugados para la confirmación de la conjugación (paso 4.4). - Pipetear 260 μL de mezcla maestra de reducción (20 μL de solución reductora 1 mezclada con 825 μL de solución reductora 2, que es suficiente para tres reacciones de conjugación de anticuerpos) a cada columna filtrante. Realice un vórtice suave de la mezcla maestra durante 2-3 s, o pipete hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución con el anticuerpo. Incubar a RT durante 30 min.
- Después de la incubación, gire las columnas del filtro a 12,000 x g durante 8 min. Agregue 450 μL de solución de conjugación a las columnas del filtro y gire hacia abajo a 12,000 x g durante 8 min.
- Resuspender el código de barras deseado en 10 μL de agua libre de nucleasa y 210 μL de solución de conjugación.
NOTA: Prepare una etiqueta de anticuerpos inmediatamente antes de usarla para la tinción. No reutilice alícuotas de códigos de barras de anticuerpos. - Una vez finalizada la escisión en el paso 3.2.4, añadir la etiqueta de anticuerpo resuspendido (aproximadamente 220 μL) en cada columna de filtro correspondiente. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar los reactivos. Cierre las tapas de la columna del filtro e incube la reacción de conjugación en RT durante 2 h. Después de 2 h, gire hacia abajo las columnas del filtro a 12,000 x g durante 8 min.
NOTA: Se recomienda reservar 5 μL de la solución conjugada en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa y almacenarla a 4 °C para el protocolo de confirmación (ver más abajo). - Pipetear 450 μL de la solución de purificación en cada columna de filtro y girar hacia abajo a 12.000 x g durante 8 min. Repita tres veces.
- Pipetear 100 μL de la solución de almacenamiento en las columnas del filtro. Pipetea suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo más de 10 veces, y lava cuidadosamente los lados de los filtros en la columna.
NOTA: Disuelva 50 μg de anticuerpos en 100 μL de la solución de almacenamiento. Si la reacción de conjugación se inicia con más de 50 μg de anticuerpo, agregue más solución de almacenamiento en esta proporción. - Invierta las columnas del filtro en un tubo de recolección nuevo. Girar a 3.000 x g durante 2 min en RT. Conservar la solución recogida. Pipetear la solución de anticuerpos conjugados en tubos estériles con tapa de rosca y conservar durante un máximo de 1 año a 4 °C.
NOTA: Un anticuerpo conjugado debe probarse con la tecnología de imágenes multiplexadas después de 2 días. Las pruebas previas a esto pueden resultar en una tinción nuclear de alto fondo.
- Aspirar y aplicar 500 μL de la solución bloqueadora del filtro con una pipeta a las columnas de filtro de corte de peso molecular de 50 kDa, y girar hacia abajo a 12.000 x g durante 2 min para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos.
4. Confirmación de conjugación
NOTA: Antes de realizar experimentos de tinción con un anticuerpo conjugado por el usuario utilizando la tecnología de imagen multiplexada, la conjugación debe confirmarse utilizando electroforesis en gel con 5 μL del anticuerpo conjugado (ver paso 3.2.6) junto con 1 μg de un anticuerpo no conjugado (generalmente en 2 μL de la mezcla) como control. Una conjugación exitosa de anticuerpos se demostrará mediante un aumento en el peso molecular del anticuerpo. Sin embargo, este protocolo de confirmación solo evalúa el éxito de la reacción química para la conjugación y no aborda la validación de anticuerpos utilizada para imágenes multiplexadas.
- Pipetear 8 μL y 11 μL de agua libre de nucleasas en el anticuerpo conjugado reservado y controlar el anticuerpo no conjugado, respectivamente, para obtener un volumen final de 13 μL.
- Pipetear 5 μL de LDS (u otro sistema de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida) tampón de muestra y 2 μL de agente reductor de muestras en cada muestra del anticuerpo conjugado reservado, y desnaturalizar las muestras en un baño seco a 95 °C durante 10 min.
- Mientras las muestras se desnaturalizan, diluya 40 ml de tampón de funcionamiento MOPS SDS en 760 ml de agua ultrapura, coloque un gel en el tanque de un sistema de electroforesis y vierta el tampón de funcionamiento diluido sobre el gel.
- Una vez completado el período de desnaturalización de 10 minutos, cargar un pocillo del gel con un estándar de proteína preteñida, uno con el anticuerpo no conjugado (del paso 3.2.2) y los pocillos restantes con las muestras de anticuerpos conjugados. A continuación, ejecute el gel a 150 V hasta que aparezca el estándar de proteína al final del gel.
NOTA: El gel se adhiere fácilmente a recipientes aptos para microondas y, por lo tanto, puede romperse, por lo que el gel debe manipularse con precaución en los siguientes pasos. - Una vez completada la carrera, transfiera el gel a un recipiente apto para microondas precargado con agua ultrapura y caliéntelo en un microondas hasta que se visualice la primera burbuja en el agua.
NOTA: El tiempo para que se formen burbujas varía mucho dependiendo del microondas utilizado. - Drene el agua del recipiente, vierta aproximadamente 250 ml de tinción Coomassie G-250 sobre el gel y caliente el gel en un microondas hasta que se visualice la primera burbuja. Después, retire el recipiente con el gel y la mancha Coomassie G-250 del microondas y colóquelo en una coctelera durante 10 minutos.
- Después de agitar, drene cuidadosamente la mancha, reemplácela con aproximadamente 200 ml de agua ultrapura y luego coloque el recipiente en la coctelera para lavar el gel.
- Drene el agua ultrapura y reemplácela con agua ultrapura nueva cinco veces o hasta que los restos de la mancha no sean evidentes en el baño de agua. Deje que el gel se lave durante la noche en la coctelera hasta que las bandas sean visibles, si es necesario, antes de fotografiar el gel (Figura 1).
NOTA: Los anticuerpos utilizados en imágenes multiplexadas deben tener patrones de tinción comparables a los de los anticuerpos conjugados con colorante. Las secciones de tejido con antígenos conocidos positivos para anticuerpos conjugados se pueden teñir con anticuerpos conjugados con oligonucleótidos y conjugados con colorantes. En este trabajo, en cada caso, las morfologías tisulares para ambos tipos de anticuerpos fueron equivalentes y armonizadas entre sí, así como la distribución celular anticipada, basada en la biología de las proteínas de interés y las muestras de tejido de prueba. Este resultado demuestra la efectividad del uso de restos de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos para enfoques basados en la tinción tisular utilizando tejido FFPE.
5. Tinción de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos
- Prepare cubreobjetos para la colocación de tejidos.
- Remojar los cubreobjetos en una solución de poli-L-lisina al 0,1% durante 24 h en RT para mejorar la adherencia tisular.
- Después de remojar, drene la solución de poli-L-lisina y lave los cubreobjetos con agua ultrapura durante 30 s. Repita el lavado de cuatro a seis veces. Retire los cubreobjetos del agua ultrapura utilizada para lavar y colóquelos sobre una toalla sin pelusa para que se sequen durante la noche.
NOTA: Un histólogo debe cortar el tejido seleccionado en secciones de 5 μm de espesor, colocarlas en el centro de un cubreobjetos cargado de poli-L-lisina y dejar que se sequen durante la noche. Después del secado, los cubreobjetos con las secciones de tejido deben almacenarse a 4 °C durante no más de 6 meses. El panel de tinción en este protocolo contenía 26 marcadores. El tejido utilizado en este protocolo era tejido de amígdalas humanas normales. El tiempo de remojo del cubreobjetos no debe exceder 1 semana. Los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina pueden almacenarse en RT y deben usarse dentro de los 2 meses posteriores a la preparación.
- El día antes de la tinción, coloque el portacubreobjetos en un horno a 60 °C durante la noche.
- Al día siguiente, coloque la muestra de cubreobjetos en un portaobjetos precalentado en un horno a 60 °C. Después de hornear durante 30 minutos, verifique que la parafina se haya derretido del tejido.
- Coloque rápidamente el portaobjetos/muestra en la siguiente serie de soluciones: dos rondas de agente desparafinador durante 6 minutos cada una; dos rondas de etanol al 100% durante 5 minutos cada una; una ronda de etanol al 90% durante 5 min; una ronda de etanol al 70% durante 5 min; una ronda de etanol al 50% durante 5 min; una ronda de etanol al 30% durante 5 min; y dos rondas de agua ultrapura tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) durante 5 minutos cada una.
NOTA: Todas las diluciones de etanol se preparan con agua ultrapura tratada con DEPC. Si se usa xileno para desparafinar, debe usarse en una capucha. - Mientras somete el portaobjetos/muestra a la serie de soluciones, haga lo siguiente:
- Prepare una cámara de humedad colocando una caja de punta de pipeta vacía con una toalla de papel empapada en agua en la parte inferior.
- Llene una olla a presión con suficiente agua para cubrir hasta la mitad un vaso de precipitados de 50 ml.
- Introducir 5 ml de metanol por muestra en el vaso de precipitados a 4 °C.
- Tampón AR9 diluido con agua ultrapura tratada con DEPC a 1x; Se necesitan aproximadamente 50 ml del tampón diluido por soporte de cubreobjetos.
- Una vez completada la serie de soluciones, llene un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml con aproximadamente 40 ml de 1 tampón AR9, sumerja el portaobjetos/muestra en el vaso de precipitados y cubra completamente el recipiente de precipitados/cubreobjetos con papel de aluminio.
- Coloque el recipiente de precipitados / cubreobjetos cubierto de papel de aluminio en la olla a presión llena de agua y cocine a alta presión (aproximadamente 15 psi) durante 20 minutos.
- Después de cocinar, retire el soporte del vaso de precipitados / cubreobjetos, desenvuelva cuidadosamente el papel de aluminio y deje que el soporte del vaso de precipitados / cubreobjetos se enfríe a RT durante aproximadamente 10 minutos.
- Retire el portaobjetos/muestra del tampón AR9 1x y sumérjalo en dos rondas de agua ultrapura tratada con DEPC, realizando una incubación de las muestras en ambas rondas durante 2 minutos cada una.
- Durante la incubación, recupere el tampón de hidratación, las soluciones de bloqueo N, bloqueo G, bloqueo J y bloqueo S, y el diluyente/bloque de anticuerpos del kit de tinción de imágenes multiplexadas. Para dos muestras de cubreobjetos, etiquete las placas de 6 pocillos para las soluciones utilizando las configuraciones que se muestran en la Figura 2.
- Coloque la muestra de cubreobjetos en dos rondas de 5 ml del tampón de hidratación durante 2 minutos cada una.
- Después de ambas rondas de colocación en el tampón de hidratación, coloque la muestra de cubreobjetos en 5 ml del diluyente/bloque de anticuerpos multiplexados para imágenes e incube durante 20-30 min a RT (no exceda los 30 min).
- Durante la incubación, prepare un cóctel de anticuerpos haciendo una mezcla maestra de 200 μL de diluyente/bloque de anticuerpos multiplexados por imágenes, bloqueador de N, bloqueador G, bloqueador J y soluciones de bloqueadores S.
NOTA: Calcule la cantidad total de anticuerpos basándose en el número de marcadores y la titulación validada de cada marcador, y reste la cantidad total de anticuerpos de la mezcla maestra. Por ejemplo, para seis marcadores, cada uno con una valoración de 1:200, la ecuación sería 200 μL de mezcla maestra − 6 μL de cóctel de anticuerpos = 194 μL de mezcla maestra.
- Después de la incubación en el diluyente/bloque de anticuerpos multiplexados para imágenes, colocar la muestra de la cápsula en la cámara de humedad preparada en el paso 5.5.1, pipetear 190 μL del cóctel de anticuerpos sobre la muestra de la cubierta e incubar la muestra de la cápsula en RT durante 3 h.
- Después de la incubación, lave la muestra de cubreobjetos en dos rondas con 5 ml del diluyente/bloque de anticuerpos multiplexados por imágenes durante 2 minutos cada una.
- Para fijar los anticuerpos unidos al tejido en el cubreobjetos, realice los pasos 5.7.3-5.7.5 en la cámara de humedad.
- Incubar los cubedores durante 10 minutos con formaldehído al 16% diluido al 1,6% con solución de almacenamiento, y luego lavar los cubreobjetos tres veces con 1x PBS.
- Incubar los cubobjetos durante 5 minutos con metanol a 4 °C y, a continuación, lavar los cubreobjetos tres veces con 1x PBS.
- Incubar los cubeobjetos durante 20 minutos con 5 ml del reactivo fijador diluido con 1x PBS, y luego lavar los cubreobjetos tres veces con 1x PBS.
- Conservar las muestras de cubreobjetos manchados en el tampón de almacenamiento a 4 °C durante un máximo de 2 semanas
6. Placa reportera de imágenes multiplexadas
NOTA: Una placa de 96 pocillos, denominada placa reportera, que contiene fluoróforos con código de barras en pocillos individuales se prepara de acuerdo con experimentos de imágenes multiplexadas diseñados a medida y se correlaciona con cada muestra de cubreobjetos teñidos. Los siguientes pasos son para la preparación de la placa del reportero.
- Prepare una mezcla maestra reportera combinando 4.880 μL de agua libre de nucleasas, 600 μL de tampón de imagen multiplexado 10x, 500 μL de un reactivo de ensayo y 20 μL de solución de tinción nuclear. Esto será suficiente para 20 ciclos de todos los pozos.
- En cada ciclo del experimento de imágenes multiplexadas diseñado a medida, llene un pozo con 245 μL de una solución que contenga la mezcla maestra reportera y los fluoróforos con código de barras específicos para ese ciclo.
NOTA: Consulte la Figura 3 para la configuración de la placa reportera utilizada en este protocolo para un panel de carcinoma. - Para proteger los fluoróforos con código de barras, adhiera una cubierta de placa de aluminio sobre la placa reportera y coloque la placa dentro del instrumento de imágenes multiplexado.
- Guarde la placa del reportero en una caja oscura a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
7. Calibración y funcionamiento de la máquina de imágenes multiplexadas
NOTA: El microscopio de fluorescencia de imágenes de alta resolución captura cuatro canales de fluorescencia diferentes en cada ciclo de imágenes multiplexadas a 20x, 100% de luz de excitación y con bajo fotoblanqueo.
- Calibre el foco de la imagen utilizando el canal DAPI colocando un cubreobjetos de muestra en la etapa del microscopio, pipeteando manualmente 700 μL de una titulación 1:1.500 de solución de tinción nuclear en el tejido.
NOTA: El cubreobjetos se retiene en la etapa del microscopio durante el lavado de la muestra y la obtención de imágenes. - Para preparar el instrumento de imágenes multiplexadas, diluya el tampón de imágenes multiplexado 10x a 1x usando agua ultrapura tratada con DEPC y llene las botellas de reactivos con soluciones/solventes apropiados, incluido el tampón de imágenes multiplexado diluido 1x, agua ultrapura tratada con DEPC y dimetilsulfóxido (DMSO).
- Una vez que las botellas de reactivos se llenen adecuadamente, ingrese el diseño experimental en el software de administrador de instrumentos de imágenes multiplexadas; designar el ciclo correcto, los números de pozo, los lugares de la pila z, el nombre del marcador, la clase y el tiempo de exposición para cada ciclo (Figura 4); establecer todos los parámetros del microscopio; y seleccione las regiones de interés en el cubreobjetos de muestra que se van a fotografiar.
- Haga clic en el botón Experimento en el software de control (Figura 4A). En la ventana Configuración y administración del experimento , haga clic en el botón Nueva plantilla (Figura 4B).
- Escriba el nombre del proyecto en el espacio junto al botón Proyecto (Figura 4C). Escriba o seleccione el número total de ciclos (Figura 4D).
- Haga clic en el botón Asignación de canales , escriba la información de cada ciclo en las columnas (Figura 4E) y haga clic en el botón Guardar plantilla . Inicie el experimento haciendo clic en el botón Iniciar experimento .
NOTA: Durante un experimento de imágenes multiplexadas, el instrumento recupera los fluoróforos con código de barras de un pocillo de la placa reportera (máximo de cuatro fluoróforos por pocillo, incluido DAPI), los dispensa directamente sobre el cubreobjetos de muestra y toma imágenes de las regiones de interés para cada canal de fluorescencia. Después de todas las imágenes para ese ciclo, el instrumento lava los fluoróforos con código de barras y dispensa el siguiente ciclo de reporteros (desde el siguiente pocillo en la placa del reportero). Las imágenes continúan hasta que se hayan completado todos los ciclos con 26 marcadores.
8. Colección de imágenes
NOTA: Las imágenes multiplexadas se pueden recolectar utilizando cualquier microscopio de fluorescencia invertido adaptado configurado con cuatro canales de fluorescencia (DAPI, Cy3, Cy5 y Cy7) y equipado con una lente Plan Fluor 20x. Las imágenes y el lavado de las muestras de cubreobjetos se realizan iterativamente automáticamente utilizando una configuración de fluidos especialmente desarrollada. Las imágenes se adquieren utilizando el software del procesador (v1.8.0.7) en formato QPTIFF.
- En la ventana del procesador, haga clic en el botón Entrada y seleccione el nombre del experimento.
- En la sección Opciones de procesamiento , seleccione y active Resta de fondo, Deconvolución, Profundidad de campo extendida y Corrección de sombreado. Haga clic en el botón Inicio .
9. Análisis de imágenes
NOTA: Las imágenes adquiridas se pueden cargar en un software patentado de análisis automatizado de imágenes o en un programa de software de código abierto (Figura 5) para su análisis posterior.
- Haga clic en el icono QuPath en la computadora y abra el software. Arrastre el archivo QPTIFF a la ventana Visor .
- Haga clic en el botón Brillo y contraste, que abrirá la ventana Brillo y contraste. Marque o desactive el marcador en la columna Seleccionado para mostrar o cerrar la señal del marcador.
- Haga clic en el botón Zoom to fit para acercar o alejar el área de interés.
NOTA: La visualización de datos de imágenes multiplexadas proporciona al usuario una visión profunda del microambiente tisular. Los marcadores individuales en muestras de FFPE se pueden visualizar en formato de fluorescencia (Figura 6 y Figura 7) o en vista de patología. Se pueden utilizar varias plataformas computacionales para procesar las imágenes compuestas y analizar los datos de imágenes de tejido multiplexadas. Con este software, el fenotipado espacial, así como el descubrimiento de células raras y el cálculo del vecindario celular, se pueden lograr con imágenes de diapositivas completas de tejido multiplexado ultra alto generado a través de la tecnología de imágenes multiplexadas. Ver Figura 6 para los 26 anticuerpos en el panel de carcinoma y la muestra de amígdalas (Figura complementaria 1).
Representative Results
Empleamos muestras de amígdalas FFPE para desarrollar un panel de oncología inmune de 26 marcadores para ilustrar el estado inmune del tejido FFPE utilizando un sistema de análisis de imágenes de código de barras. En general, 19 anticuerpos se utilizan actualmente en otros estudios de imágenes multiplexadas en nuestro laboratorio. Todos los marcadores se han probado utilizando tejido FFPE con IHQ cromogénica. Todos los anticuerpos se conjugaron con oligonucleótidos de ADN únicos. Al configurar los cubreobjetos utilizando el administrador de instrumentos basado en la web (Figura 4) para esta tecnología de análisis de imágenes de código de barras, debe tenerse en cuenta que el primer y el último ciclo siempre están "en blanco" (Figura 2 y Figura 4), lo que proporciona las señales de fluorescencia de fondo que se deben restar de las señales específicas de los anticuerpos. Después de que las imágenes en formato QPTIFF se han recogido con el microscopio de fluorescencia, se pueden visualizar utilizando varios programas patentados de análisis automatizado de imágenes o programas de software de código abierto. Las imágenes compuestas pueden mostrar todos los marcadores o marcadores seleccionados para una mejor vista de las señales (Figura 5). Además, cada anticuerpo puede ser evaluado visualmente para la localización nuclear, citoplasmática o membranosa. Las células inmunes, tumorales y estromales se pueden identificar fácilmente. Posteriormente, el análisis de imágenes puede proporcionar información sobre la intensidad de la señal, el rango dinámico y la distribución espacial de todos los marcadores (Figura 6). Esta técnica nos permitió analizar los 26 marcadores a nivel subcelular en una sola sección de tejido (Figura 7). Al analizar la colocalización de los marcadores, pudimos identificar los fenotipos celulares, localizar la posición espacial de las células, calcular la distancia entre las células y encontrar la distribución de las células. El impacto crucial de esta tecnología es la presentación de un robusto panel de 26 marcadores centrado en el estado inmune del microambiente tisular.
Figura 1: Imagen de validación de anticuerpos conjugados personalizados utilizando un gel de proteína Bis-Tris. El carril 1 del gel muestra el estándar de proteína. El carril 2 y el carril 4 muestran anticuerpos conjugados con código de barras (flechas). El carril 3 y el carril 5 muestran las bandas de cadena pesada y ligera de un anticuerpo no conjugado (puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mapa de configuración de la placa de tinción para dos muestras de cubreobjetos. Abreviaturas: HB = tampón de hidratación; B = diluyente/bloqueo de anticuerpos; PSFS = solución fijadora posterior a la tinción; PBS = solución salina tamponada con fosfato; MeOH = metanol; S = solución de almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de la placa reportera. Cada anticuerpo conjugado tiene un código de barras que es complementario a un informador específico. Para configurar la placa del reportero, se deben enumerar todos los anticuerpos conjugados y su reportero correspondiente. A continuación, a cada anticuerpo se le asigna un número de ciclo. El rendimiento de dos ciclos en blanco (C1 y C18) se utiliza para evaluar el nivel de autofluorescencia en los tres canales de fluorescencia y para la sustracción de fondo posterior a la imagen utilizando el software de control de adquisición de imágenes. Un asistente de software verificará el instrumento en esta etapa para asegurarse de que todos los ajustes sean correctos (Figura 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Adquisición de imágenes utilizando el software de control para la configuración del experimento. (A) Seleccione la pestaña Experimento en la esquina inferior izquierda del software de control para preparar e iniciar la configuración. (B,C) Seleccione Nueva plantilla para introducir la configuración experimental con un nuevo proyecto y nombre de experimento. (D) Cambiar el ciclo de inicio y el número de ciclos para reflejar la ubicación del reportero en la placa del reportero de 96 pocillos. (E) Asignar los canales de fluorescencia apropiados a los cuatro canales designados para la ejecución experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Visualización de imágenes utilizando software basado en web (QuPath). La ventana del visor muestra 26 marcadores en la sección FFPE del tejido de las amígdalas teñidas. La ventana Brillo y contraste muestra los marcadores con las marcas de verificación. Finalmente, la ventana del visor muestra el ejemplo FFPE con los marcadores seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Visualización de imágenes utilizando software basado en web. (A) Las secciones de tejido de las amígdalas se tiñeron para los 26 marcadores, y las imágenes de las secciones en formato QPTIFF se visualizaron utilizando un software comercial de visualización de diapositivas digitales o un software de código abierto (QuPath) para anotación y revisión. (B-F) Se mostraron seis marcadores en la misma anotación para una mejor vista de las señales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Vistas de los 26 marcadores individuales utilizados con software basado en web. La expresión del marcador en el tejido de las amígdalas se muestra a través de la tinción de inmunofluorescencia con un panel de oncología inmune (arriba a la izquierda). Se muestran marcadores individuales en dos áreas pequeñas (rectángulos rojos). El inserto ampliado muestra celdas positivas para estos marcadores (flechas blancas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Resumen del flujo de trabajo de adquisición de imágenes multiplexadas. Las secciones de tejido FFPE se tiñeron utilizando el panel de 26 anticuerpos seguido de una reacción multiciclo. Las imágenes en bruto de las secciones teñidas se procesaron computacionalmente, y se realizó un análisis espacial y de densidad celular utilizando las imágenes compuestas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Validación de IHQ en tejido de amígdalas. Las secciones de tejido FFPE se tiñeron con un anticuerpo individual. La expresión del marcador en el tejido de las amígdalas se muestra con un aumento bajo, y el inserto ampliado muestra células positivas para el marcador (rectángulos rojos). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
El TME desempeña un papel esencial en el desarrollo, la progresión y las respuestas al tratamiento del cáncer. Además, la densidad de subconjuntos específicos de linfocitos infiltrantes de tumores en el TME puede servir como un biomarcador pronóstico para ciertos tipos de cáncer. Sorprendentemente, además de la composición celular del TME, las características espaciales de un tumor pueden proporcionar un esquema para comprender la biología del tumor e identificar posibles biomarcadores pronósticos12,17.
Como numerosas poblaciones de células inmunes están involucradas en respuestas procancerosas o anticancerígenas, una mejor comprensión de estas células y sus relaciones espaciales entre sí y con las células cancerosas ayudará a guiar la identificación de nuevas estrategias inmunoterapéuticas. Estudios previos han estratificado la localización y distribución espacial de las células TME con base en la estructura tisular en las áreas intratumoral y peritumoral y los márgenes invasivos de las células tumorales18,19. En los últimos 15 años, los avances tecnológicos han hecho que el análisis fenotípico de células individuales basado en su dispersión espacial sea una herramienta novedosa e influyente para estudiar el TME y categorizar biomarcadores potenciales para la inmunoterapia tumoral. La histoquímica múltiple de FI puede estimar simultáneamente múltiples marcadores biológicos20.
Similar a la estrategia de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos, se utilizan cuatro tipos de plataformas multiplex basadas en proteínas para estudiar el TME: sistemas de detección de anticuerpos marcados con macógenos, fluorescencias, códigos de barras de ADN e isótopos metálicos. Las plataformas de IHQ cromogénicas rentables permiten la visualización de diapositivas completas y la evaluación patológica mediante el uso de microscopía convencional de campo claro. En IF multiplexado e IHC, se utilizan anticuerpos conjugados con fluoróforos. La plataforma multiplex IF/IHQ detecta anticuerpos con alta especificidad y puede cuantificar anticuerpos dirigidos incluso a nivel subcelular 6,21. Además, debido a la naturaleza de los cromógenos y fluoróforos, el uso de un panel de anticuerpos puede capturar la expresión de hasta 10 biomarcadores en un solo portaobjetos. En plataformas basadas en isótopos metálicos, los anticuerpos marcados con metales se utilizan para realizar imágenes multiplexadas con resolución espacial y de una sola célula, y alta sensibilidad para secciones de tejido individuales22. Teóricamente, estos enfoques de anticuerpos conjugados con metales permiten la detección simultánea de más de 100 biomarcadores en una sola sección de tejido. Un desafío de la técnica de marcado isotópico es la interferencia isobárica, que impide que se alcance el 100% de pureza del enriquecimiento23. Además, la interferencia aumenta a medida que aumenta el número de marcadores. Las plataformas de detección de anticuerpos conjugados con ADN reconocen anticuerpos marcados con códigos de barras de ADN únicos. Más de 40 biomarcadores pueden ser capturados simultáneamente con alta especificidad en estas plataformas6.
Las imágenes multiplexadas son una plataforma de detección de anticuerpos etiquetados con códigos de barras de ADN disponible comercialmente para aplicar anticuerpos conjugados con ADN a un solo portaobjetos de tejido en un solo paso (Figura 8). Para la etapa de preparación de tejidos, a diferencia de la plataforma de imágenes de haz de iones multiplexado, que requiere el uso de portaobjetos recubiertos de oro obtenidos de los fabricantes, la plataforma de imágenes multiplexadas requiere solo cubreobjetos regulares o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina al 0,1% para ayudar a que el tejido se adhiera a ella y mantenga el tejido intacto durante el proceso de tinción e imagen. Se recomienda el uso de secciones de tejido en cubreobjetos dentro de las 4 semanas posteriores a la sección, ya que el almacenamiento prolongado de portaobjetos sin teñir da como resultado una reducción de la antigenicidad. Una muestra de cubreobjetos teñidos puede mantenerse en tampón de almacenamiento a 4 °C durante un máximo de 2 semanas sin perder su señal de tinción. No se requiere equipo especial para el almacenamiento de las muestras de cubreobjetos. El sistema de imágenes multiplexadas se ha actualizado para utilizar portaobjetos regulares en lugar de cubreobjetos, lo que permite la tinción de tejidos más grandes y un fácil manejo. Cuando se utilice una solución de reducción para la conjugación de anticuerpos (paso 3.2.3), la reacción debe limitarse a no más de 30 minutos para evitar daños a los anticuerpos. Los búferes de bloqueo del paso 5.6.6 deben estar recién preparados y los búferes de bloqueo no deben reutilizarse.
En comparación con las plataformas de detección de anticuerpos multiplexados marcados con isótopos cromológicos, fluorescentes y metálicos, la tecnología de imágenes multiplexadas tiene ciertas ventajas. Por ejemplo, más de 60 paneles de anticuerpos prediseñados para imágenes multiplexadas están disponibles comercialmente, lo que ayuda a ahorrar tiempo y costos en la conjugación y validación de anticuerpos, y el número de paneles de anticuerpos prediseñados está creciendo. Estos anticuerpos, que incluyen el marcador de carcinoma pancitoqueratina, el marcador de melanoma SOX10, el marcador vascular CD31, el marcador estromal SMA y numerosos marcadores de células inmunes, están validados y listos para experimentar. Para los anticuerpos que no están prediseñados, el kit de conjugación disponible comercialmente diseñado para su uso con imágenes multiplexadas es sencillo y fácil de usar. Los anticuerpos conjugados por el cliente son válidos durante 1 año cuando se almacenan a 4 °C. Además, no se requiere calentamiento de la máquina para capturar las imágenes. En esta tecnología de imágenes multiplexadas, los pasos iterativos de lavado, hibridación y extracción en la adquisición de imágenes rara vez resultan en una disminución de la intensidad del marcador o una morfología del tejido degradado 5,24,25. Además, las imágenes compuestas se capturan en formato QPTIFF con un simple microscopio de fluorescencia de tres colores y se pueden cargar y analizar utilizando software de análisis digital de terceros. Los marcadores de tinción se pueden visualizar a una resolución de una sola célula, y los fenotipos celulares se pueden caracterizar a través de la colocalización de los marcadores (Figura 6 y Figura 7). El análisis exhaustivo de una imagen multiplexada revela además los compartimentos de tejido, la cuantificación de marcadores de una sola célula y los datos de vecino más cercano y proximidad (Figura 8).
Un desafío en el análisis de imágenes multiplexadas es la identificación del tipo celular. Por lo general, cuando se aplican más clasificadores de un solo objeto a una imagen, se anotarán más fenotipos poco comunes. Por lo tanto, se recomienda utilizar marcadores conocidos que no estén coexpresados en el mismo clasificador y aplicar solo el clasificador relacionado con el fenotipo a la anotación de celdas individuales. Las variaciones en la anotación del tipo celular darán lugar a resultados espaciales sustancialmente diferentes, como las diferencias en la distribución espacial celular y el análisis de vecindad celular26,27.
El análisis de imágenes multiplexadas ha demostrado ser exitoso en la tinción y obtención de imágenes de muchos tipos de muestras, incluido el tejido FFPE, el tejido fresco congelado, las diapositivas enteras archivadas y las micromatrices de tejidos. Las imágenes multiplexadas de secciones de mama, cerebro, pulmón, bazo, riñón, ganglios linfáticos y tejido cutáneo se pueden adquirir con datos profundos de fenotipado espacial unicelular 5,16,25,28.
En el futuro, se esperan más anticuerpos prediseñados para imágenes multiplexadas. Además, el desarrollo de software específico para el análisis de imágenes multiplexadas es muy necesario. Actualmente, existen muchos programas de software disponibles comercialmente y de código abierto para el análisis de imágenes Hi-Plex29, pero los científicos aún necesitan ayuda para crear un flujo de trabajo estándar para estos análisis30,31. Aunque las imágenes compuestas capturadas con este protocolo son compatibles con software de terceros, esto puede resultar en costos adicionales para el usuario. Otra desventaja de la tecnología de imágenes multiplexadas es la reducción de la señal en la detección de proteínas nucleares después del lavado iterativo, la hibridación y la extracción con grandes paneles de anticuerpos. Afortunadamente, esto se puede minimizar recuperando los fluoróforos con código de barras en los primeros ciclos al diseñar las placas del reportero. Recientemente, esta plataforma se actualizó con un nuevo sistema de escaneo de alta velocidad, que ha reducido drásticamente el tiempo para obtener imágenes compuestas32. Además, se ha informado que una nueva estrategia que utiliza códigos de barras conjugados con tiramida mejora las imágenes basadas en códigos de barras de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos. Esta tecnología tiene como objetivo amplificar las señales de tinción para las cuales los anticuerpos conjugados con código de barras son difíciles de obtener33.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Donald R. Norwood de Editing Services, Research Medical Library en MD Anderson por editar este artículo y el laboratorio multiplex de FI y análisis de imágenes en el Departamento de Patología Molecular Traslacional del MD Anderson. Este proyecto fue apoyado en parte por la Plataforma Moonshots del laboratorio de Patología Molecular Traslacional-Inmunoperfil (TMP-IL) del Departamento de Patología Molecular Traslacional, el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas y el U24CA224285 del Acuerdo de Cooperación del NCI (al MD Anderson Cancer Center CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
| 1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
| Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| Ethanol, 200 proof | |||
| G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
| Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
| Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |
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