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Cancer Research

पैराफिन ऊतक नमूनों के एकल-सेल विश्लेषण में इम्यूनोप्रोफाइलिंग और स्थानिक मानचित्रण लक्षण वर्णन के लिए मल्टीप्लेक्स बारकोडिंग छवि विश्लेषण

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64758
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

मल्टीप्लेक्स बारकोडिंग छवि विश्लेषण ने हाल ही में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के लक्षण वर्णन में सुधार किया है, जिससे सेल संरचना, कार्यात्मक स्थिति और सेल-सेल इंटरैक्शन के व्यापक अध्ययन की अनुमति मिलती है। यहां, हम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी और चक्र इमेजिंग के बारकोडिंग का उपयोग करके एक धुंधला और इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एक उच्च-आयामी छवि विश्लेषण तकनीक के उपयोग की अनुमति देता है।

Abstract

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ एंटीबॉडी बारकोडिंग का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक, जो क्रमिक रूप से एक ही ऊतक अनुभाग में कई एपिटोप्स का पता लगाती है, ट्यूमर मूल्यांकन के लिए एक प्रभावी पद्धति है जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की समझ में सुधार करती है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विज़ुअलाइज़ेशन तब प्राप्त किया जाता है जब एक विशिष्ट फ्लोरोफोरे को पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के माध्यम से एंटीबॉडी-बाउंड बारकोड में लगाया जाता है और फिर नमूना इमेजिंग की जाती है; दरअसल, यह विधि एकल ऊतक धुंधला प्रतिक्रिया में 40 से अधिक एंटीबॉडी के अनुकूलन योग्य पैनलों के उपयोग की अनुमति देती है। यह विधि ताजा जमे हुए ऊतक, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, सुसंस्कृत कोशिकाओं और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के साथ संगत है, जिसका अर्थ है कि शोधकर्ता एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों को देखने के लिए इस तकनीक का उपयोग कर सकते हैं। यह विधि एक मैनुअल धुंधला और फिक्सिंग प्रोटोकॉल के साथ शुरू होती है, और सभी एंटीबॉडी बारकोड एक एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग करके लागू किए जाते हैं। धुंधला तरल पदार्थ उपकरण पूरी तरह से स्वचालित है और लेबलिंग, इमेजिंग और वर्णक्रमीय रूप से अलग फ्लोरोफोरे को हटाने के पुनरावृत्ति चक्र करता है जब तक कि सभी बायोमाकर्स को मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित नहीं किया जाता है। फिर छवियों को सभी मार्करों के लिए एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए सभी इमेजिंग चक्रों में एकत्र और संकलित किया जाता है। एकल-चरण धुंधला और कोमल फ्लोरोफोरे हटाने से न केवल अत्यधिक मल्टीप्लेक्स बायोमार्कर विश्लेषण की अनुमति मिलती है, बल्कि वांछित होने पर अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नमूने को संरक्षित भी किया जाता है (जैसे, हेमटोक्सीलिन और ईओसिन धुंधला)। इसके अलावा, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर छवि प्रसंस्करण-बहाव मुआवजा, पृष्ठभूमि घटाव, सेल विभाजन और क्लस्टरिंग-साथ ही स्थानिक नेटवर्क मानचित्रों की पीढ़ी के लिए छवियों और सेल फेनोटाइप के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण को सक्षम करता है। सारांश में, यह तकनीक एक कम्प्यूटरीकृत माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप को पुनरावर्ती रूप से संकरण, छवि और स्ट्रिप फ्लोरोसेंटली लेबल डीएनए जांच के लिए नियोजित करती है जो ऊतक-बाध्य, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी के पूरक हैं।

Introduction

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) बेहद विषम है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं, ट्यूमर स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, बाह्य मैट्रिक्स के गैर-कोशिकीय घटक और ट्यूमर, स्ट्रोमल औरप्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित और जारी कई प्रचुर मात्रा में अणु शामिल हैं। साक्ष्य जमा करना दर्शाता है कि टीएमई में ट्यूमर भेदभाव, विकास, आक्रमण, मेटास्टेसिस और उपचार ों की प्रतिक्रिया को पुन: प्रोग्राम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिकाहै।

यह समझना कि टीएमई में विभिन्न सेल प्रकार सिग्नलिंग नेटवर्क के माध्यम से एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं और संवाद करते हैं, कैंसर निदान में सुधार, इम्यूनोथेरेपी को अनुकूलित करने औरनए उपचार विकसित करने के लिए आवश्यक है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) सहित पारंपरिक ऊतक माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग ट्यूमर के नमूनों में सेल प्रकार, बहुतायत और संचार का अध्ययन करने के लिए दशकों से किया गया है। दुर्भाग्य से, ये तकनीक ें आमतौर पर एक ऊतक अनुभाग में केवल एक या दो प्रोटीन मार्करों का मूल्यांकन कर सकती हैं और इन कोशिकाओं के बीच जटिल स्थानिक और संरचनात्मक संबंधों को प्रकट नहीं कर सकतीहैं।

पिछले दो दशकों में, कई मल्टीप्लेक्स इमेजिंगप्रौद्योगिकियां स्थापित की गई हैं। ये प्रौद्योगिकियां टीएमई के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना, कार्य और स्थान के बहुत बेहतर दृश्य प्रदान करती हैं, जिससे एकल-कोशिका स्तर 9,10 पर जटिल टीएमई की पहचान करने और स्थानिक रूप से प्रोफाइल करने की क्षमता में तेजी से प्रगति होती है। टीएमई में विभिन्न ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक और संरचनात्मक संबंध अब इन मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों11,12 का उपयोग करके जैविक और नैदानिक अध्ययनों में सबसे आगे हैं।

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी बारकोडिंग का उपयोग करके हाल ही में विकसित मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक एक प्रभावशाली एकल-कोशिका जैविक अनुसंधान मंच है जो फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) नमूनों में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने पर आधारित है। वर्तमान में, यह मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक एकल ऊतक खंड15 में 100 से अधिक मार्करों की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देती है, जिसने सेल प्रकारों की संख्या में वृद्धि की है जो सीटू में अलग-अलग हैं। यह ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक विश्लेषण के स्तर को सक्षम करता है जो पारंपरिक इम्यूनोफेनोटाइपिंग दृष्टिकोण16 का उपयोग करके संभव नहीं है।

यहां, हम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए शुद्ध एंटीबॉडी को संयुग्मित करने और मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्लेटफॉर्म और एफएफपीई ऊतक के साथ एक मल्टीसाइकिल इमेजिंग प्रक्रिया का उपयोग करके इस संयुग्मन को मान्य करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक के साथ उपयोग की जाने वाली बुनियादी छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।

Protocol

इस पूर्वव्यापी अध्ययन को टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। एफएफपीई ऊतक के नमूने नियमित मानक देखभाल के हिस्से के रूप में एमडी एंडरसन में रोगियों से एकत्र किए गए थे। कोई नैदानिक या चिकित्सीय हस्तक्षेप नहीं किया गया था। अनुसंधान और प्रकाशन के लिए एकत्र किए गए नमूनों का उपयोग करने के लिए रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. एंटीबॉडी पैनल डिजाइन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी स्रोत

  1. रुचि के ऊतकों और प्रोटीन की गुणवत्ता पर सावधानीपूर्वक विचार करने के बाद मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए एक एंटीबॉडी पैनल बनाएं। एंटीबॉडी पैनल डिजाइन के लिए एंटीबॉडी के तीन स्रोतों पर विचार किया जाता है: 1) पूरी तरह से व्यावसायिक रूप से मान्य एंटीबॉडी, 2) मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक-स्क्रीन किए गए एंटीबॉडी, और 3) अंत उपयोगकर्ता-साझा एंटीबॉडी।
    नोट: मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक-स्क्रीन एंटीबॉडी को काम करने के लिए दिखाया गया है और विक्रेताओं से उपलब्ध हैं। इन स्क्रीन किए गए एंटीबॉडी को उपयोगकर्ता द्वारा ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संयुग्मन के बाद मल्टीप्लेक्स छवि धुंधला करने पर लागू किया जा सकता है।
  2. यदि ऊपर उल्लिखित स्रोतों में रुचि का प्रोटीन नहीं पाया जा सकता है, तो एंटीबॉडी क्लोन को नियोजित करें जो आईएचसी के साथ काम करने के लिए जाने जाते हैं। इसके अलावा, आईजीजी क्लोन की तुलना में आईजीएम के साथ उच्च विफलता दर के कारण इस मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक के लिए आईजीएम क्लोन के बजाय आईजीजी आइसोटाइप्स की सिफारिश की जाती है।

2. एंटीबॉडी संयुग्मन से पहले

  1. मल्टीप्लेक्स इमेजिंग बारकोड का उपयोग करके संयुग्मन के लिए एंटीबॉडी क्लोन की पहचान करते समय, फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) या इसी तरह के बफर में वाहक-मुक्त एंटीबॉडी खरीदने पर विचार करें। बीएसए, ग्लूटेन, ग्लिसरॉल और अन्य प्रोटीन एडिटिव्स सहित वाहक प्रोटीन, संयुग्मन क्षमता को कम करने के लिए जाने जाते हैं।
  2. सबसे उपयुक्त एंटीबॉडी क्लोन का चयन करें, और संयुग्मन से पहले हमेशा धुंधला स्थितियों (यानी, एंटीजन पुनर्प्राप्ति और अनुमापन) का अनुकूलन करें। मानक आईएफ या आईएचसी का उपयोग करके इस एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक ऊतक में एक असंगत एंटीबॉडी क्लोन लागू करके ऐसा करें।
    नोट: यदि एक शुद्ध एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, तो संयुग्मन से पहले एक एंटीबॉडी शुद्धिकरण प्रक्रिया की जानी चाहिए। एंटीबॉडी शुद्धिकरण किट के साथ उपयोग की जाने वाली शुद्धिकरण प्रक्रिया पर यहां चर्चा नहीं की गई है।

3. एंटीबॉडी संयुग्मन

  1. एंटीबॉडी संयुग्मन अभिकर्मक प्राप्त करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संयुग्मन किट में एक फ़िल्टर-ब्लॉकिंग समाधान, कमी समाधान 2, संयुग्मन समाधान, शुद्धि समाधान, एंटीबॉडी भंडारण समाधान (सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत), और कमी समाधान 1 (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) होते हैं।
  2. संयुग्मन
    नोट: एक शुद्ध एंटीबॉडी को कम करने वाले एजेंट के साथ इलाज किया जाता है, जिससे एंटीबॉडी की कम मात्रा इस तकनीक के साथ उपयोग किए जाने वाले मल्टीप्लेक्स इमेजिंग बारकोड के साथ प्रतिक्रिया कर सकती है और इस प्रकार, एक सहसंयोजक बंधन बनाती है। इस प्रक्रिया में लगभग 4.5 घंटे लगते हैं और इसके परिणामस्वरूप संयुग्मित एंटीबॉडी के लगभग 120 μL होते हैं, जो 1 वर्ष के लिए व्यवहार्य है। सभी स्पिन-डाउन कमरे के तापमान (आरटी) पर आयोजित किए जाते हैं, और प्रवाह-थ्रू को बहुत अंतिम चरण (3.2.9) को छोड़कर छोड़ दिया जाता है, जिसमें एक संग्रह ट्यूब में संयुग्मित एंटीबॉडी होता है।
    1. 50 केडीए आणविक भार कटऑफ फिल्टर कॉलम पर एक पिपेट का उपयोग करके फ़िल्टर-ब्लॉकिंग समाधान के 500 μL को एस्पिरेट और लागू करें, और गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को अवरुद्ध करने के लिए 2 मिनट के लिए 12,000 x g पर स्पिन करें।
      नोट: यदि कॉलम के शीर्ष पर अवशिष्ट समाधान ध्यान देने योग्य है, तो संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर को उलटा करें, और 2 मिनट के लिए 3,000 x g पर स्पिन करें।
    2. फिल्टर कॉलम में समाधान के 100 μL वॉल्यूम में एंटीबॉडी के 50 μg को पिपेट करें, और 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर घूमें।
      नोट: शुद्ध एंटीबॉडी की एकाग्रता को मापने और एंटीबॉडी के 50 μg के अनुरूप समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। यदि एंटीबॉडी समाधान की मात्रा 100 μL से कम है, तो 1x PBS जोड़कर मात्रा को 100 μL में समायोजित करें। संयुग्मन पुष्टि के लिए असंयुग्मित एंटीबॉडी के 1 μg को बनाए रखें (चरण 4.4)।
    3. प्रत्येक फिल्टर कॉलम में पिपेट 260 μL रिडक्शन मास्टर मिक्स (20 μL रिडक्शन सॉल्यूशन 1 825 μL रिडक्शन सॉल्यूशन 2 के साथ मिश्रित, जो तीन एंटीबॉडी संयुग्मन प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है)। धीरे से 2-3 सेकंड के लिए मास्टर मिश्रण को भंवर करें, या एंटीबॉडी के साथ घोल को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर फ़िल्टर कॉलम को स्पिन करें। फ़िल्टर स्तंभों में संयुग्मन समाधान के 450 μL जोड़ें, और 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर स्पिन करें।
    5. न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 10 μL और संयुग्मन समाधान के 210 μL में वांछित बारकोड को पुन: निलंबित करें।
      नोट: धुंधला होने के लिए उपयोग करने से तुरंत पहले एक एंटीबॉडी टैग तैयार करें। एंटीबॉडी बारकोड एलिकोट का पुन: उपयोग न करें।
    6. चरण 3.2.4 में स्पिन-डाउन के पूरा होने के बाद, प्रत्येक संबंधित फ़िल्टर कॉलम में पुन: निलंबित एंटीबॉडी टैग (लगभग 220 μL) जोड़ें। अभिकर्मकों को मिलाने के लिए मिश्रण को धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें। फ़िल्टर कॉलम ढक्कन बंद करें, और 2 घंटे के लिए आरटी पर संयुग्मन प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। 2 घंटे के बाद, 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर फ़िल्टर कॉलम को स्पिन करें।
      नोट: पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन ट्यूब में संयुग्मित समाधान के 5 μL को अलग करना और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करना पुष्टिकरण प्रोटोकॉल के लिए अनुशंसित है (नीचे देखें)।
    7. प्रत्येक फ़िल्टर कॉलम में शुद्धिकरण समाधान के पिपेट 450 μL, और 8 मिनट के लिए 12,000 x g पर स्पिन करें। तीन बार दोहराएं।
    8. फ़िल्टर स्तंभों में भंडारण समाधान के पिपेट 100 μL. धीरे से मिश्रण को 10 से अधिक बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, और कॉलम में फिल्टर के किनारों को ध्यान से धोएं।
      नोट: भंडारण समाधान के 100 μL में एंटीबॉडी के 50 μg को घोलें। यदि संयुग्मन प्रतिक्रिया 50 μg से अधिक एंटीबॉडी के साथ शुरू की जाती है, तो इस अनुपात में अधिक भंडारण समाधान जोड़ें।
    9. फ़िल्टर स्तंभों को एक ताजा संग्रह ट्यूब में उलटा करें। आरटी पर 2 मिनट के लिए 3,000 x g पर स्पिन करें। एकत्रित घोल रखें। संयुग्मित एंटीबॉडी समाधान को बाँझ स्क्रू-टॉप ट्यूबों में पिपेट करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक स्टोर करें।
      नोट: 2 दिनों के बाद मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक के साथ एक संयुग्मित एंटीबॉडी का परीक्षण किया जाना चाहिए। इससे पहले परीक्षण के परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि परमाणु धुंधलापन हो सकता है।

4. संयुग्मन की पुष्टि

नोट: मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके उपयोगकर्ता-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रयोग करने से पहले, संयुग्मन की पुष्टि संयुग्मित एंटीबॉडी के 5 μL (चरण 3.2.6 देखें) के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एक असंयुग्मित एंटीबॉडी (आमतौर पर मिश्रण के 2 μL में) के 1 μg के साथ की जानी चाहिए। एंटीबॉडी के आणविक भार में वृद्धि से एक सफल एंटीबॉडी संयुग्मन का प्रदर्शन किया जाएगा। हालांकि, यह पुष्टिकरण प्रोटोकॉल केवल संयुग्मन के लिए रासायनिक प्रतिक्रिया की सफलता का आकलन करता है और मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी सत्यापन को संबोधित नहीं करता है।

  1. पिपेट 8 μL और 11 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी को आरक्षित संयुग्मित एंटीबॉडी में और 13 μL की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए क्रमशः असंयुग्मित एंटीबॉडी को नियंत्रित करते हैं।
  2. एलडीएस के पिपेट 5 μL (या अन्य सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली) नमूना बफर और आरक्षित संयुग्मित एंटीबॉडी के प्रत्येक नमूने में नमूना कम करने वाले एजेंट के 2 μL, और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस शुष्क स्नान में नमूने को निष्क्रिय करें।
  3. जबकि नमूने विकृत हो रहे हैं, 760 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में बफर चलाने वाले एमओपीएस एसडीएस के 40 एमएल को पतला करें, एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के टैंक में एक जेल रखें, और जेल पर पतला चलने वाला बफर डालें।
  4. एक बार 10 मिनट की डिनेचुराइजेशन अवधि पूरी हो जाने के बाद, जेल के एक कुएं को पूर्व-दाग वाले प्रोटीन मानक के साथ लोड करें, एक असंयुग्मित एंटीबॉडी (चरण 3.2.2 से), और शेष कुओं को संयुग्मित एंटीबॉडी नमूनों के साथ। इसके बाद, जेल को 150 वी पर चलाएं जब तक कि जेल के अंत में प्रोटीन मानक दिखाई न दे।
    नोट: जेल आसानी से माइक्रोवेव-सुरक्षित कंटेनरों का पालन करता है और इस प्रकार, फट सकता है, इसलिए जेल को निम्नलिखित चरणों में सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए।
  5. रन पूरा होने के बाद, जेल को अल्ट्राप्योर पानी से भरे माइक्रोवेव-सुरक्षित कंटेनर में स्थानांतरित करें, और इसे माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि पानी में पहला बुलबुला न दिखाई दे।
    नोट: बुलबुले बनने का समय उपयोग किए गए माइक्रोवेव के आधार पर बहुत भिन्न होता है।
  6. कंटेनर से पानी निकालें, जेल पर कूमासी जी -250 दाग के लगभग 250 मिलीलीटर डालें, और जेल को माइक्रोवेव में गर्म करें जब तक कि पहला बुलबुला दिखाई न दे। बाद में, माइक्रोवेव से जेल और कूमासी जी -250 दाग के साथ कंटेनर को हटा दें, और इसे 10 मिनट के लिए शेकर पर रखें।
  7. हिलाने के बाद, दाग को ध्यान से सूखा लें, इसे लगभग 200 एमएल अल्ट्राप्योर पानी से बदलें, और फिर जेल को धोने के लिए कंटेनर को शेकर पर रखें।
  8. अल्ट्राप्योर पानी को छान लें, और इसे पांच बार नए अल्ट्राप्योर पानी से बदलें या जब तक कि पानी के स्नान में दाग के अवशेष स्पष्ट न हों। जेल को शेकर पर रात भर धोने के लिए छोड़ दें जब तक कि बैंड दिखाई न दें, यदि आवश्यक हो, तो जेल की तस्वीर लेने से पहले (चित्रा 1)।
    नोट: मल्टीप्लेक्स इमेजिंग में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी में डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ तुलनीय धुंधला पैटर्न होना चाहिए। संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक ज्ञात एंटीजन वाले ऊतक वर्गों को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित और डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी से दाग दिया जा सकता है। इस काम में, प्रत्येक मामले में, दोनों एंटीबॉडी प्रकारों के लिए ऊतक आकृति विज्ञान एक-दूसरे के साथ बराबर और सामंजस्यपूर्ण थे, साथ ही प्रत्याशित कोशिका वितरण, रुचि के प्रोटीन के जीव विज्ञान और परीक्षण ऊतक के नमूनों के आधार पर। यह परिणाम एफएफपीई ऊतक का उपयोग करके ऊतक धुंधला-आधारित दृष्टिकोण के लिए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी मोइटीज का उपयोग करने की प्रभावशीलता को दर्शाता है।

5. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी धुंधला

  1. ऊतक प्लेसमेंट के लिए कवरलिप्स तैयार करें।
    1. ऊतक पालन में सुधार के लिए आरटी में 24 घंटे के लिए 0.1% पॉली-एल-लाइसिन समाधान में कवरलिप्स भिगोएं।
    2. भिगोने के बाद, पॉली-एल-लाइसिन समाधान को छान लें, और कवरलिप्स को 30 सेकंड के लिए अल्ट्राप्योर पानी से धो लें। धोने को चार से छह बार दोहराएं। धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले अल्ट्राप्योर पानी से कवरलिप्स को हटा दें, और उन्हें रात भर सूखने के लिए लिंट-फ्री तौलिया पर रखें।
      नोट: एक हिस्टोलॉजिस्ट को चयनित ऊतक को उन वर्गों में काटना चाहिए जो 5 μm मोटे हैं, उन्हें पॉली-एल-लाइसिन-चार्ज कवरस्लिप के केंद्र पर रखें, और उन्हें रात भर सूखने दें। सूखने के बाद, ऊतक वर्गों के साथ कवरलिप्स को 6 महीने से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में स्टेनिंग पैनल में 26 मार्कर थे। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला ऊतक सामान्य मानव टॉन्सिल ऊतक था। कवरस्लिप भिगोने का समय 1 सप्ताह से अधिक नहीं होना चाहिए। पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरलिप्स को आरटी में संग्रहीत किया जा सकता है और तैयारी के 2 महीने के भीतर इसका उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. धुंधला होने से एक दिन पहले, कवरस्लिप होल्डर को रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
  3. अगले दिन, कवरस्लिप नमूने को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में पहले से गर्म कवरस्लिप धारक में रखें। 30 मिनट के लिए बेक करने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि पैराफिन ऊतक से पिघल गया है।
  4. नमूना को जल्दी से निम्नलिखित समाधान श्रृंखला में रखें: प्रत्येक 6 मिनट के लिए डीवैक्सिंग एजेंट के दो राउंड; प्रत्येक 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के दो दौर; 5 मिनट के लिए 90% इथेनॉल का एक दौर; 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का एक दौर; 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल का एक दौर; 5 मिनट के लिए 30% इथेनॉल का एक दौर; और डायथाइल पाइरो कार्बोनेट (डीईपीसी) के दो दौर-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी प्रत्येक 5 मिनट के लिए।
    नोट: इथेनॉल के सभी कमजोर पड़ने डीईपीसी-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी के साथ तैयार किए जाते हैं। यदि जाइलीन का उपयोग डीवैक्सिंग के लिए किया जाता है, तो इसका उपयोग हुड में किया जाना चाहिए।
  5. कवरस्लिप धारक/नमूने को समाधान श्रृंखला के अधीन करते समय, निम्न कार्य करें:
    1. नीचे पानी से भिगोए हुए पेपर तौलिया के साथ एक खाली पिपेट टिप बॉक्स रखकर एक आर्द्रता कक्ष तैयार करें।
    2. एक प्रेशर कुकर को 50 एमएल बीकर को आधा कवर करने के लिए पर्याप्त पानी से भरें।
    3. बीकर में प्रति नमूना 5 मिलीलीटर मेथनॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. डीईपीसी-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी के साथ एआर 9 बफर को 1 गुना तक पतला करें; प्रति कवरस्लिप धारक को लगभग 50 एमएल पतला बफर की आवश्यकता होती है।
  6. समाधान श्रृंखला पूरी होने के बाद, 1x AR9 बफर के लगभग 40 mL के साथ 50 mL ग्लास बीकर भरें, बीकर में कवरस्लिप धारक / नमूना डुबोएं, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर / कवरस्लिप धारक को पूरी तरह से कवर करें।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी से ढके बीकर / कवरस्लिप धारक को पानी से भरे प्रेशर कुकर में रखें, और 20 मिनट के लिए उच्च दबाव (लगभग 15 पीएसआई) पर पकाएं।
    2. खाना पकाने के बाद, बीकर / कवरस्लिप धारक को हटा दें, एल्यूमीनियम पन्नी को ध्यान से अनरैप करें, और बीकर / कवरस्लिप धारक को लगभग 10 मिनट के लिए आरटी पर ठंडा होने दें।
    3. 1x AR9 बफर से कवरस्लिप धारक /नमूना निकालें, और इसे DEPC-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी के दो राउंड में डुबोएं, प्रत्येक 2 मिनट के लिए दोनों राउंड में नमूनों का इनक्यूबेशन करें।
    4. इनक्यूबेशन के दौरान, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग स्टेनिंग किट से हाइड्रेशन बफर, ब्लॉकिंग एन, ब्लॉकिंग जी, ब्लॉकिंग जे, और ब्लॉकिंग एस सॉल्यूशंस और एंटीबॉडी डिल्यूनेट /ब्लॉक को पुनः प्राप्त करें। दो कवरस्लिप नमूनों के लिए, चित्रा 2 में दिखाए गए कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करके समाधानों के लिए 6-वेल प्लेटों को लेबल करें।
    5. कवरस्लिप नमूने को 2 मिनट के लिए हाइड्रेशन बफर के 5 एमएल के दो राउंड में रखें।
    6. हाइड्रेशन बफर में प्लेसमेंट के दोनों राउंड के बाद, कवरस्लिप नमूने को मल्टीप्लेक्स इमेजिंग एंटीबॉडी डिल्यूनेट / ब्लॉक के 5 एमएल में रखें, और आरटी पर 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (30 मिनट से अधिक नहीं)।
    7. इनक्यूबेशन के दौरान, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग एंटीबॉडी डिल्यूनेट / ब्लॉक, एन ब्लॉकर, जी ब्लॉकर, जे ब्लॉकर और एस ब्लॉकर समाधानों का 200 μL मास्टर मिश्रण बनाकर एक एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें।
      नोट: मार्करों की संख्या और प्रत्येक मार्कर के मान्य अनुमापन के आधार पर कुल एंटीबॉडी राशि की गणना करें, और मास्टर मिश्रण से कुल एंटीबॉडी राशि घटाएं। उदाहरण के लिए, छह मार्करों के लिए, प्रत्येक में 1: 200 अनुमापन के साथ, समीकरण मास्टर मिश्रण का 200 μL होगा - एंटीबॉडी कॉकटेल का 6 μL = मास्टर मिश्रण का 194 μL।
  7. ब्लॉक में इनक्यूबेशन के बाद, कवरस्लिप नमूने को चरण 5.5.1 में तैयार आर्द्रता कक्ष में रखें, कवरस्लिप नमूने पर एंटीबॉडी कॉकटेल के 190 μL को कवरस्लिप नमूने पर रखें, और 3 घंटे के लिए आरटी पर कवरस्लिप नमूने को इनक्यूबेट करें।
    1. इनक्यूबेशन के बाद, कवरस्लिप नमूने को दो राउंड में 5 मिलीलीटर मल्टीप्लेक्स इमेजिंग एंटीबॉडी डिल्यूएंट/ब्लॉक के साथ 2 मिनट के लिए धो लें।
    2. कवरस्लिप पर ऊतक के लिए बाध्य एंटीबॉडी को ठीक करने के लिए, आर्द्रता कक्ष में चरण 5.7.3-5.7.5 करें।
    3. स्टोरेज घोल के साथ 16% फॉर्मलाडेहाइड के साथ 10 मिनट के लिए कवरलिप्स को 1.6% तक पतला करें, और फिर कवरलिप्स को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल के साथ 5 मिनट के लिए कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें, और फिर 1x पीबीएस के साथ कवरलिप्स को तीन बार धोएं।
    5. 1x PBS के साथ पतला 5 मिलीलीटर फिक्सेटिव अभिकर्मक के साथ 20 मिनट के लिए कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें, और फिर 1x PBS के साथ कवरलिप्स को तीन बार धोएं।
    6. दाग वाले कवरस्लिप नमूने को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण बफर में स्टोर करें।

6. मल्टीप्लेक्स इमेजिंग रिपोर्टर प्लेट

नोट: एक 96-वेल प्लेट, जिसे रिपोर्टर प्लेट के रूप में संदर्भित किया जाता है, जिसमें अलग-अलग कुओं में बारकोडेड फ्लोरोफोर होते हैं, कस्टम-डिज़ाइन किए गए मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रयोगों के अनुसार तैयार किए जाते हैं और प्रत्येक दाग वाले कवरस्लिप नमूने के साथ संबंध रखते हैं। रिपोर्टर प्लेट की तैयारी के लिए निम्नलिखित चरण हैं।

  1. 4,880 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी, 600 μL 10x मल्टीप्लेक्स इमेजिंग बफर, 500 μL एक परख अभिकर्मक और 20 μL परमाणु दाग समाधान के संयोजन से एक रिपोर्टर मास्टर मिश्रण तैयार करें। यह सभी कुओं के 20 चक्रों के लिए पर्याप्त होगा।
  2. कस्टम-डिज़ाइन किए गए मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रयोग के हर चक्र में, रिपोर्टर मास्टर मिक्स और उस चक्र के लिए विशिष्ट बारकोडेड फ्लोरोफोर वाले समाधान के 245 μL के साथ एक अच्छी तरह से भरें।
    नोट: कार्सिनोमा पैनल के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर प्लेट कॉन्फ़िगरेशन के लिए चित्रा 3 देखें।
  3. बारकोडेड फ्लोरोफोरेस की रक्षा के लिए, रिपोर्टर प्लेट पर एक पन्नी प्लेट कवर का पालन करें, और प्लेट को मल्टीप्लेक्स इमेजिंग उपकरण के भीतर रखें।
  4. रिपोर्टर प्लेट को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बॉक्स में स्टोर करें।

7. मल्टीप्लेक्स इमेजिंग मशीन को कैलिब्रेट करना और चलाना

नोट: उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप प्रत्येक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग चक्र में 20x, 100% उत्तेजना प्रकाश और कम फोटोब्लीचिंग के साथ चार अलग-अलग प्रतिदीप्ति चैनलों को कैप्चर करता है।

  1. माइक्रोस्कोप चरण पर एक नमूना कवरस्लिप रखकर डीएपीआई चैनल का उपयोग करके इमेजिंग के फोकस को कैलिब्रेट करें, ऊतक पर परमाणु दाग समाधान के 1: 1,500 अनुमापन के 700 μL को मैन्युअल रूप से पाइप करें।
    नोट: नमूना धोने और इमेजिंग के दौरान माइक्रोस्कोप चरण पर कवरस्लिप को बरकरार रखा जाता है।
  2. मल्टीप्लेक्स इमेजिंग उपकरण तैयार करने के लिए, डीईपीसी-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करके 10 गुना मल्टीप्लेक्स इमेजिंग बफर को 1 गुना तक पतला करें, और अभिकर्मक बोतलों को उचित समाधान / सॉल्वैंट्स के साथ भरें, जिसमें पतला 1 x मल्टीप्लेक्स इमेजिंग बफर, डीईपीसी-उपचारित अल्ट्राप्योर पानी और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) शामिल हैं।
  3. एक बार अभिकर्मक की बोतलें उचित रूप से भर जाने के बाद, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट मैनेजर सॉफ्टवेयर में प्रयोगात्मक डिजाइन दर्ज करें; प्रत्येक चक्र के लिए सही चक्र, अच्छी संख्या, जेड-स्टैक स्थान, मार्कर नाम, वर्ग और एक्सपोज़र समय निर्दिष्ट करें (चित्रा 4); सभी माइक्रोस्कोप पैरामीटर सेट करें; और छवि बनाने के लिए नमूना कवरस्लिप पर रुचि के क्षेत्रों का चयन करें।
    1. नियंत्रण सॉफ्टवेयर (चित्रा 4 ए) में प्रयोग बटन पर क्लिक करें। प्रयोग सेटअप और प्रबंधन विंडो में, नया टेम्पलेट बटन (चित्रा 4B) पर क्लिक करें।
    2. प्रोजेक्ट का नाम प्रोजेक्ट बटन (चित्रा 4 सी) के बगल में स्थित स्थान में टाइप करें। चक्रों की कुल संख्या लिखें या चुनें (चित्रा 4D).
    3. चैनल असाइनमेंट बटन पर क्लिक करें, कॉलम (चित्रा 4 ई) में प्रत्येक चक्र के लिए जानकारी टाइप करें, और टेम्पलेट सहेजें बटन पर क्लिक करें। प्रयोग प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करके प्रयोग प्रारंभ करें.
      नोट: एक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रयोग के दौरान, उपकरण रिपोर्टर प्लेट के एक कुएं से बारकोडेड फ्लोरोफोर (डीएपीआई सहित प्रति कुएं अधिकतम चार फ्लोरोफोरे) को पुनः प्राप्त करता है, उन्हें सीधे नमूना कवरस्लिप पर वितरित करता है, और प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए रुचि के क्षेत्रों की छवि बनाता है। उस चक्र के लिए सभी इमेजिंग के बाद, उपकरण बारकोडेड फ्लोरोफोरेस को धोता है और संवाददाताओं के अगले चक्र (रिपोर्टर प्लेट पर अगले कुएं से) वितरित करता है। इमेजिंग तब तक जारी रहती है जब तक कि 26 मार्करों का उपयोग करके सभी चक्र पूरे नहीं हो जाते।

8. छवि संग्रह

नोट: मल्टीप्लेक्स छवियों को चार प्रतिदीप्ति चैनलों (DAPI, Cy3, Cy5, और Cy7) के साथ कॉन्फ़िगर किए गए किसी भी अनुकूलित उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है और एक प्लान फ्लोर 20x लेंस से लैस किया जा सकता है। कवरस्लिप नमूनों की इमेजिंग और धुलाई एक विशेष रूप से विकसित फ्लुइडिक्स सेटअप का उपयोग करके स्वचालित रूप से की जाती है। छवियों को क्यूपीटीआईएफएफ प्रारूप में प्रोसेसर सॉफ्टवेयर (v1.8.0.7) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है।

  1. प्रोसेसर विंडो में, इनपुट बटन पर क्लिक करें, और प्रयोग नाम का चयन करें।
  2. प्रसंस्करण विकल्प अनुभाग में, पृष्ठभूमि घटाव, डीकन्वोल्यूशन, फ़ील्ड की विस्तारित गहराई और छायांकन सुधार का चयन करें और जाँचें. प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें।

9. छवि विश्लेषण

नोट: अधिग्रहित छवियों को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पेटेंट स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (चित्रा 5) पर अपलोड किया जा सकता है।

  1. कंप्यूटर पर QuPath चिह्न क्लिक करें, और सॉफ़्टवेयर खोलें। QPTIFF फ़ाइल को व्यूअर विंडो पर खींचें।
  2. ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट बटन पर क्लिक करें, जो ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट विंडो को खोल देगा। मार्कर संकेत दिखाने या बंद करने के लिए चयनित स्तंभ में मार्कर की जाँच करें या उसे अनचेक करें.
  3. रुचि के क्षेत्र में ज़ूम इन करने या बाहर निकलने के लिए ज़ूम टू फिट बटन पर क्लिक करें।
    नोट: मल्टीप्लेक्स छवि डेटा विज़ुअलाइज़ेशन उपयोगकर्ता को ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट में गहरी नज़र प्रदान करता है। एफएफपीई नमूनों में व्यक्तिगत मार्करों को प्रतिदीप्ति प्रारूप (चित्रा 6 और चित्रा 7) या पैथोलॉजी दृश्य में देखा जा सकता है। मिश्रित छवियों को संसाधित करने और मल्टीप्लेक्स ऊतक छवि डेटा का विश्लेषण करने के लिए कई कम्प्यूटेशनल प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है। इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, स्थानिक फेनोटाइपिंग, साथ ही दुर्लभ सेल खोज और सेल पड़ोस गणना, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक के माध्यम से उत्पन्न अल्ट्रा-हाई मल्टीप्लेक्स ऊतक की पूरी-स्लाइड छवियों के साथ पूरा किया जा सकता है। कार्सिनोमा पैनल और टॉन्सिल नमूने में 26 एंटीबॉडी के लिए चित्रा 6 देखें (पूरक चित्रा 1)।

Representative Results

हमने बारकोडिंग छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके एफएफपीई ऊतक की प्रतिरक्षा स्थिति को चित्रित करने के लिए 26 मार्कर प्रतिरक्षा ऑन्कोलॉजी पैनल विकसित करने के लिए एफएफपीई टॉन्सिल नमूनों को नियोजित किया। कुल मिलाकर, 19 एंटीबॉडी वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में अन्य मल्टीप्लेक्स इमेजिंग अध्ययनों में उपयोग किए जाते हैं। क्रोमोजेनिक आईएचसी के साथ एफएफपीई ऊतक का उपयोग करके सभी मार्करों का परीक्षण किया गया है। सभी एंटीबॉडी अद्वितीय डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए संयुग्मित थे। इस बारकोडिंग छवि विश्लेषण तकनीक के लिए वेब-आधारित उपकरण प्रबंधक (चित्रा 4) का उपयोग करके कवरलिप्स स्थापित करते समय, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पहले और अंतिम चक्र हमेशा "खाली" होते हैं (चित्रा 2 और चित्रा 4), जो एंटीबॉडी से विशिष्ट संकेतों से घटाए जाने वाले पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत प्रदान करता है। क्यूपीटीआईएफएफ प्रारूप में छवियों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ एकत्र किए जाने के बाद, उन्हें कई पेटेंट स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके देखा जा सकता है। समग्र छवियां संकेतों के बेहतर दृश्य के लिए सभी मार्करों या चयनित मार्करों को दिखा सकती हैं (चित्रा 5)। इसके अलावा, प्रत्येक एंटीबॉडी को परमाणु, साइटोप्लाज्मिक या झिल्लीदार स्थानीयकरण के लिए नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रतिरक्षा, ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं को आसानी से पहचाना जा सकता है। इसके बाद, छवि विश्लेषण सभी मार्करों के सिग्नल तीव्रता, गतिशील सीमा और स्थानिक वितरण पर जानकारी प्रदान कर सकता है (चित्रा 6)। इस तकनीक ने हमें एक ऊतक खंड (चित्रा 7) में उपकोशिकीय स्तर पर सभी 26 मार्करों का विश्लेषण करने की अनुमति दी। मार्करों के सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण करके, हम सेलुलर फेनोटाइप की पहचान कर सकते हैं, स्थानिक सेल की स्थिति का स्थानीयकरण कर सकते हैं, कोशिकाओं के बीच की दूरी की गणना कर सकते हैं, और कोशिकाओं के वितरण का पता लगा सकते हैं। इस तकनीक का महत्वपूर्ण प्रभाव ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की प्रतिरक्षा स्थिति पर केंद्रित एक मजबूत 26 मार्कर पैनल की प्रस्तुति है।

Figure 1
चित्रा 1: बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल का उपयोग करके कस्टम-संयुग्मित एंटीबॉडी सत्यापन की छवि। जेल का लेन 1 प्रोटीन मानक दिखाता है। लेन 2 और लेन 4 बारकोड-संयुग्मित एंटीबॉडी (तीर) दिखाते हैं। लेन 3 और लेन 5 एक असंगत एंटीबॉडी (तीर) से भारी और हल्के चेन बैंड दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दो कवरस्लिप नमूनों के लिए स्टेनिंग प्लेट कॉन्फ़िगरेशन मैप। संक्षेप: एचबी = हाइड्रेशन बफर; बी = एंटीबॉडी डिल्यूएंट/ ब्लॉक; पीएसएफएस = पोस्ट-स्टेनिंग फिक्सेटिव समाधान; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एमईओएच = मेथनॉल; एस = भंडारण समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रिपोर्टर प्लेट कॉन्फ़िगरेशन। प्रत्येक संयुग्मित एंटीबॉडी में एक बारकोड होता है जो एक विशिष्ट रिपोर्टर का पूरक होता है। रिपोर्टर प्लेट स्थापित करने के लिए, प्रत्येक संयुग्मित एंटीबॉडी और उसके संबंधित रिपोर्टर को सूचीबद्ध किया जाना चाहिए। इसके बाद, प्रत्येक एंटीबॉडी को एक चक्र संख्या सौंपी जाती है। दो रिक्त चक्रों (सी 1 और सी 18) के प्रदर्शन का उपयोग तीन प्रतिदीप्ति चैनलों में ऑटोफ्लोरेसेंस के स्तर का मूल्यांकन करने और छवि अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पोस्ट-इमेजिंग पृष्ठभूमि घटाव के लिए किया जाता है। एक सॉफ्टवेयर विज़ार्ड इस स्तर पर उपकरण की जांच करेगा ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी सेटिंग्स सही हैं (चित्रा 4)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रयोग सेटअप के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि अधिग्रहण। (ए) सेटअप तैयार करने और शुरू करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर के बाएं-नीचे कोने में प्रयोग टैब का चयन करें। (बी, सी) किसी नए प्रोजेक्ट और प्रयोग नाम के साथ प्रयोगात्मक सेटिंग्स इनपुट करने के लिए नया टेम्पलेट चुनें. (डी) 96-वेल रिपोर्टर प्लेट में रिपोर्टर स्थान को प्रतिबिंबित करने के लिए स्टार्ट चक्र और चक्रों की संख्या को अच्छी तरह से बदलें। (ई) प्रयोगात्मक रन के लिए नामित चार चैनलों को उचित प्रतिदीप्ति चैनल असाइन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: वेब-आधारित सॉफ़्टवेयर (QPath) का उपयोग कर छवि विज़ुअलाइज़ेशन। दर्शक विंडो दाग वाले टॉन्सिल ऊतक एफएफपीई अनुभाग में 26 मार्कर दिखाती है। ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट विंडो चेकमार्क के साथ मार्कर दिखाती है। अंत में, दर्शक विंडो चयनित मार्करों के साथ एफएफपीई नमूना दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: वेब-आधारित सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर छवि विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) टॉन्सिल ऊतक वर्गों को 26 मार्करों के लिए दाग दिया गया था, और क्यूपीटीआईएफएफ प्रारूप में अनुभागों की छवियों को एनोटेशन और समीक्षा के लिए वाणिज्यिक डिजिटल स्लाइड व्यूअर सॉफ्टवेयर या ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर (क्यूपाथ) का उपयोग करके देखा गया था। (B-F) संकेतों के बेहतर दृश्य के लिए एक ही एनोटेशन में छह मार्कर प्रदर्शित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: वेब-आधारित सॉफ़्टवेयर के साथ उपयोग किए जाने वाले 26 व्यक्तिगत मार्करों के दृश्य। टॉन्सिल ऊतक में मार्कर अभिव्यक्ति को प्रतिरक्षा ऑन्कोलॉजी पैनल (ऊपर बाएं) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के माध्यम से दिखाया जाता है। दो छोटे क्षेत्रों (लाल आयताकार) में व्यक्तिगत मार्कर दिखाए गए हैं। ज़ूम-इन इंसर्ट इन मार्करों (सफेद तीर) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: मल्टीप्लेक्स छवि अधिग्रहण वर्कफ़्लो का सारांश। एफएफपीई ऊतक वर्गों को 26 एंटीबॉडी पैनल का उपयोग करके दाग दिया गया था, जिसके बाद एक मल्टीसाइकिल प्रतिक्रिया हुई। दाग वाले वर्गों की कच्ची छवियों को कम्प्यूटेशनल रूप से संसाधित किया गया था, और समग्र छवियों का उपयोग करके एक सेल घनत्व और स्थानिक विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: टॉन्सिल ऊतक में आईएचसी सत्यापन। एफएफपीई ऊतक वर्गों को एक व्यक्तिगत एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया था। टॉन्सिल ऊतक में मार्कर अभिव्यक्ति को कम आवर्धन पर दिखाया जाता है, और ज़ूम-इन इंसर्ट मार्कर (लाल आयताकार) के लिए कोशिकाओं को सकारात्मक दिखाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

टीएमई कैंसर के विकास, प्रगति और उपचार प्रतिक्रियाओं में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। इसके अतिरिक्त, टीएमई में विशिष्ट ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइट उपसमुच्चय का घनत्व कुछ प्रकार के कैंसर के लिए एक रोगसूचक बायोमार्कर के रूप में काम कर सकता है। उल्लेखनीय रूप से, टीएमई की सेलुलर संरचना के अलावा, एक ट्यूमर की स्थानिक विशेषताएं ट्यूमर के जीव विज्ञान को समझने और संभावित रोगसूचक बायोमार्कर12,17 की पहचान करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान कर सकती हैं।

चूंकि कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी प्रोकैंसर या एंटीकैंसर प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं, इन कोशिकाओं की बेहतर समझ और एक दूसरे के साथ और कैंसर कोशिकाओं के साथ उनके स्थानिक संबंधों से नई इम्यूनोथेरेप्यूटिक रणनीतियों की पहचान का मार्गदर्शन करने में मदद मिलेगी। पिछले अध्ययनों ने इंट्राट्यूमरल और पेरिट्यूमरल क्षेत्रों में ऊतक संरचना और ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक मार्जिन18,19 के आधार पर टीएमई कोशिकाओं के स्थान और स्थानिक वितरण को स्तरीकृत किया है। पिछले 15 वर्षों में, तकनीकी प्रगति ने उनके स्थानिक फैलाव के आधार पर व्यक्तिगत कोशिकाओं के फेनोटाइपिक विश्लेषण को टीएमई का अध्ययन करने और ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी के लिए संभावित बायोमाकर्स को वर्गीकृत करने के लिए एक नया, प्रभावशाली उपकरण बना दिया है। मल्टीप्लेक्स आईएफ हिस्टोकेमिस्ट्री समवर्ती रूप से कई जैविक मार्करों का अनुमान लगा सकताहै।

ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी रणनीति के समान, टीएमई का अध्ययन करने के लिए चार प्रकार के प्रोटीन-आधारित मल्टीप्लेक्स प्लेटफार्मों का उपयोग किया जाता है: क्रोमोजेन-, फ्लोरेसेंस-, डीएनए बारकोड-, और धातु आइसोटोप-लेबल एंटीबॉडी डिटेक्शन सिस्टम। लागत प्रभावी क्रोमोजेनिक आईएचसी प्लेटफॉर्म पारंपरिक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे स्लाइड विज़ुअलाइज़ेशन और पैथोलॉजिकल मूल्यांकन को सक्षम करते हैं। मल्टीप्लेक्स आईएफ और आईएचसी में, फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। मल्टीप्लेक्स आईएफ/आईएचसी प्लेटफॉर्म उच्च विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी का पता लगाता है और उपकोशिकीय स्तर 6,21 पर भी लक्षित एंटीबॉडी की मात्रा निर्धारित कर सकता है। इसके अलावा, क्रोमोजेन्स और फ्लोरोफोर की प्रकृति के कारण, एक एंटीबॉडी पैनल का उपयोग एक स्लाइड पर 10 बायोमाकर्स की अभिव्यक्ति को पकड़ सकता है। धातु आइसोटोप-आधारित प्लेटफार्मों पर, धातु-टैग किए गए एंटीबॉडी का उपयोग एकल-कोशिका और स्थानिक संकल्प के साथ मल्टीप्लेक्स इमेजिंग करने के लिए किया जाता है, और व्यक्तिगत ऊतक अनुभाग22 के लिए उच्च संवेदनशीलता। सैद्धांतिक रूप से, ये धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी दृष्टिकोण एक एकल ऊतक खंड पर 100 से अधिक बायोमाकर्स का एक साथ पता लगाने में सक्षम होते हैं। आइसोटोप-लेबलिंग तकनीक की एक चुनौती आइसोबेरिक हस्तक्षेप है, जो संवर्धन की 100% शुद्धता को23 तक पहुंचने से रोकती है। इसके अलावा, मार्करों की संख्या बढ़ने के साथ हस्तक्षेप बढ़ जाता है। डीएनए-संयुग्मित एंटीबॉडी डिटेक्शन प्लेटफॉर्म अद्वितीय डीएनए बारकोड के साथ लेबल किए गए एंटीबॉडी को पहचानते हैं। इन प्लेटफार्मों पर उच्च विशिष्टता के साथ 40 से अधिक बायोमाकर्स को एक साथ कैप्चर किया जा सकताहै।

मल्टीप्लेक्स इमेजिंग एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए बारकोड-लेबल एंटीबॉडी डिटेक्शन प्लेटफॉर्म है जो डीएनए-संयुग्मित एंटीबॉडी को एक चरण में एकल ऊतक स्लाइड पर लागू करता है (चित्रा 8)। ऊतक तैयार करने के चरण के लिए, मल्टीप्लेक्स आयन बीम इमेजिंग प्लेटफॉर्म के विपरीत, जिसके लिए निर्माताओं से प्राप्त सोने की लेपित स्लाइड के उपयोग की आवश्यकता होती है, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्लेटफॉर्म को केवल 0.1% पॉली-एल-लाइसिन के साथ लेपित नियमित कवरलिप्स या स्लाइड की आवश्यकता होती है ताकि ऊतक को इसका पालन करने में मदद मिल सके और धुंधला और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान ऊतक बरकरार रह सके। सेक्शनिंग के बाद 4 सप्ताह के भीतर कवरलिप्स पर ऊतक वर्गों के उपयोग की सिफारिश की जाती है, क्योंकि बिना दाग वाली स्लाइडों के लंबे समय तक भंडारण के परिणामस्वरूप एंटीजेनिसिटी में कमी आती है। एक सना हुआ कवरस्लिप नमूना अपने धुंधला संकेत को खोए बिना 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण बफर में बनाए रखा जा सकता है। कवरस्लिप नमूनों के भंडारण के लिए किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है। मल्टीप्लेक्स इमेजिंग सिस्टम को कवरलिप्स के बजाय नियमित स्लाइड का उपयोग करने के लिए अपग्रेड किया गया है, जो बड़े ऊतकों के धुंधला होने और आसान हैंडलिंग को सक्षम बनाता है। एंटीबॉडी संयुग्मन (चरण 3.2.3) के लिए कमी समाधान का उपयोग करते समय, एंटीबॉडी को नुकसान को रोकने के लिए प्रतिक्रिया 30 मिनट से अधिक तक सीमित नहीं होनी चाहिए। चरण 5.6.6 में ब्लॉकिंग बफर को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए, और ब्लॉकिंग बफर का पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।

क्रोमोजेन-, फ्लोरेसेंस-और मेटल आइसोटोप-लेबल मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी डिटेक्शन प्लेटफॉर्म की तुलना में, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक के कुछ फायदे हैं। उदाहरण के लिए, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए 60 से अधिक पूर्व-डिज़ाइन किए गए एंटीबॉडी पैनल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो एंटीबॉडी संयुग्मन और सत्यापन में समय और लागत बचाने में मदद करता है, और पूर्वनिर्धारित एंटीबॉडी पैनलों की संख्या बढ़ रही है। ये एंटीबॉडी, जिनमें कार्सिनोमा मार्कर पैन-साइटोकेराटिन, मेलेनोमा मार्कर एसओएक्स 10, संवहनी मार्कर सीडी 31, स्ट्रोमल मार्कर एसएमए और कई प्रतिरक्षा सेल मार्कर शामिल हैं, मान्य और प्रयोग के लिए तैयार हैं। एंटीबॉडी के लिए जो पूर्वनिर्धारित नहीं हैं, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के साथ उपयोग के लिए डिज़ाइन की गई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संयुग्मन किट सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल है। ग्राहक-संयुग्मित एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 1 वर्ष के लिए अच्छे होते हैं। इसके अतिरिक्त, छवियों को कैप्चर करने के लिए मशीन वार्म-अप की आवश्यकता नहीं है। इस मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक में, छवि अधिग्रहण में पुनरावृत्ति धुलाई, संकरण और स्ट्रिपिंग चरणों के परिणामस्वरूप शायद ही कभी मार्कर तीव्रता या अवक्रमित ऊतक आकृति विज्ञान 5,24,25 में कमी आती है। इसके अलावा, समग्र छवियों को क्यूपीटीआईएफएफ प्रारूप में एक साधारण तीन-रंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कैप्चर किया जाता है और तीसरे पक्ष के डिजिटल विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अपलोड और विश्लेषण किया जा सकता है। धुंधला मार्करों को एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर देखा जा सकता है, और सेल फेनोटाइप्स को मार्करों के सह-स्थानीयकरण के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 6 और चित्रा 7)। एक मल्टीप्लेक्स छवि के व्यापक विश्लेषण से आगे ऊतक डिब्बों, एकल-सेल मार्कर परिमाणीकरण, और निकटतम पड़ोसी और निकटता डेटा का पता चलता है (चित्रा 8)।

मल्टीप्लेक्स छवि विश्लेषण में एक चुनौती सेल-प्रकार की पहचान है। आमतौर पर, जब किसी छवि पर अधिक एकल-ऑब्जेक्ट क्लासिफायर लागू किए जाते हैं, तो अधिक असामान्य फेनोटाइप ्स को एनोटेट किया जाएगा। इसलिए, ज्ञात मार्करों का उपयोग करना जो एक ही क्लासिफायर में सह-व्यक्त नहीं होते हैं और एकल कोशिकाओं के एनोटेशन के लिए केवल फेनोटाइप से संबंधित क्लासिफायर को लागू करने की सिफारिश की जाती है। सेल-प्रकार एनोटेशन में भिन्नता के परिणामस्वरूप काफी अलग स्थानिक परिणाम होंगे, जैसे कि सेल स्थानिक वितरण और सेलुलर पड़ोस विश्लेषण26,27 में अंतर।

मल्टीप्लेक्स छवि विश्लेषण एफएफपीई ऊतक, ताजा जमे हुए ऊतक, संग्रहीत संपूर्ण स्लाइड और ऊतक माइक्रोएरे सहित कई नमूना प्रकारों को धुंधला करने और इमेजिंग करने में सफल साबित हुआ है। स्तन, मस्तिष्क, फेफड़े, प्लीहा, गुर्दे, लिम्फ नोड और त्वचा ऊतक वर्गों की मल्टीप्लेक्स छवियों को गहरे एकल-कोशिका स्थानिक फेनोटाइपिंग डेटा 5,16,25,28 के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

भविष्य में, मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए अधिक पूर्वनिर्धारित एंटीबॉडी की उम्मीद है। इसके अतिरिक्त, मल्टीप्लेक्स छवि विश्लेषण के लिए विशिष्ट सॉफ्टवेयर के विकास की बहुत आवश्यकता है। वर्तमान में, हाई-प्लेक्स छवि विश्लेषण के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर प्रोग्राम मौजूदहैं, लेकिन वैज्ञानिकों को अभी भीइन विश्लेषणों के लिए एक मानक वर्कफ़्लो बनाने में मदद की आवश्यकता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कैप्चर की गई समग्र छवियां तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर के साथ संगत हैं, इसके परिणामस्वरूप उपयोगकर्ता के लिए अतिरिक्त लागत हो सकती है। मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तकनीक का एक और नुकसान एंटीबॉडी के बड़े पैनलों के साथ पुनरावृत्ति धोने, संकरण और स्ट्रिपिंग के बाद परमाणु प्रोटीन का पता लगाने में सिग्नल की कमी है। सौभाग्य से, रिपोर्टर प्लेटों को डिजाइन करते समय शुरुआती चक्रों में बारकोडेड फ्लोरोफोरेस को पुनः प्राप्त करके इसे कम किया जा सकता है। हाल ही में, इस प्लेटफ़ॉर्म को एक नई हाई-स्पीड स्कैनिंग सिस्टम के साथ अपग्रेड किया गया था, जिसने समग्र छवियों को प्राप्त करने के समय को नाटकीय रूप से कम कर दियाहै। इसके अतिरिक्त, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-संयुग्मित एंटीबॉडी बारकोडिंग-आधारित इमेजिंग को बढ़ाने के लिए टायरामाइड-संयुग्मित बारकोड का उपयोग करके एक नई रणनीति की सूचना दी गई है। इस तकनीक का उद्देश्य धुंधला संकेतों को बढ़ाना है जिसके लिए बारकोड-संयुग्मितएंटीबॉडी प्राप्त करना मुश्किल है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस लेख को संपादित करने के लिए एमडी एंडरसन में रिसर्च मेडिकल लाइब्रेरी और एमडी एंडरसन में ट्रांसलेशनल आणविक पैथोलॉजी विभाग में मल्टीप्लेक्स आईएफ और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला के संपादन सेवाओं के डोनाल्ड आर नॉरवुड को धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना को ट्रांसलेशनल मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी विभाग, टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर और एनसीआई सहकारी समझौता U24CA224285 (एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर सीआईएमएसी के लिए) में ट्रांसलेशनल मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी-इम्यूनोप्रोफाइलिंग लेबोरेटरी (टीएमपी-आईएल) मूनशॉट्स प्लेटफॉर्म द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x AR9 Buffer Akoya Biosciences AR900250ML
10x Buffer Akoya Biosciences 7000001
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28906
1X Antibody Diluent/Block Akoya Biosciences ARD1001EA
Antibody Conjugation Kit Akoya Biosciences 7000009 Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution
Assay Reagent Akoya Biosciences 7000002
Diethyl pyrocarbonate Sigma-Aldrich 40718-25ML
Dimethyl sulfoxide Avantor/VWR BDH1115-4LP
Ethanol, 200 proof
G Blocker V2 Akoya Biosciences 240199
Histoclear Thermo Fisher Scientific 50-329-50
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
Milli-Q Integral 10  Millipore  ZRXQ010WW
Niknon Fluorescence microscope Keyence Corp. of America BZ-X810
Nuclear Stain Akoya Biosciences 7000003
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
NuPAGE Thermo Fisher Scientific NP0008
PBS Thermo Fisher Scientific 14190136
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination Akoya Biosciences 5450004 (BX025/RX025)
5450003 (BX022/RX022)
5450023 (BX002/RX002)
 5250002 (BX020/RX020)
2520003 (BX023/RX023)
5250005 (BX029/RX029)
5250007 (BX035/RX035)
5250012 (BX052/RX052)
5550012 (BX030/RX030)
5550015 (BX042/RX042)
5550014 (BX036/RX036)
QuPath Open-Source https://qupath.github.io/
SimplyBlue SafeStain Thermo Fisher Scientific LC6065
Staining Kit (Akoya Biosciences 7000008 Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 194
पैराफिन ऊतक नमूनों के एकल-सेल विश्लेषण में इम्यूनोप्रोफाइलिंग और स्थानिक मानचित्रण लक्षण वर्णन के लिए मल्टीप्लेक्स बारकोडिंग छवि विश्लेषण
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Rodriguez, S., Sun, B., McAllen, S., … More

Rodriguez, S., Sun, B., McAllen, S., Jiang, M., Parra, E. R. Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples. J. Vis. Exp. (194), e64758, doi:10.3791/64758 (2023).

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