Summary
Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.
Abstract
Aynı doku kesitinde birden fazla epitopu sırayla tespit eden oligonükleotidlerle antikor barkodlaması kullanan çoklanmış görüntüleme teknolojisi, tümör mikroçevresinin anlaşılmasını geliştiren tümör değerlendirmesi için etkili bir metodolojidir. Formalin sabit, parafin gömülü dokularda protein ekspresyonunun görselleştirilmesi, spesifik bir floroforun tamamlayıcı oligonükleotidler aracılığıyla antikora bağlı bir barkoda tavlanması ve daha sonra örnek görüntüleme yapılması ile elde edilir; Gerçekten de, bu yöntem, tek bir doku boyama reaksiyonunda 40'tan fazla antikorun özelleştirilebilir panellerinin kullanılmasına izin verir. Bu yöntem, taze dondurulmuş doku, formalin sabit, parafin gömülü doku, kültürlenmiş hücreler ve periferik kan mononükleer hücreleri ile uyumludur, bu da araştırmacıların bu teknolojiyi tek hücreli çözünürlükte çeşitli numune türlerini görüntülemek için kullanabilecekleri anlamına gelir. Bu yöntem manuel boyama ve sabitleme protokolü ile başlar ve tüm antikor barkodları bir antikor kokteyli kullanılarak uygulanır. Boyama akışkanları cihazı tamamen otomatiktir ve tüm biyobelirteçler standart bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenene kadar spektral olarak farklı floroforları etiketleme, görüntüleme ve çıkarma yinelemeli döngülerini gerçekleştirir. Görüntüler daha sonra tüm belirteçler için tek hücreli çözünürlük elde etmek üzere tüm görüntüleme döngüleri boyunca toplanır ve derlenir. Tek adımlı boyama ve nazik florofor giderimi, sadece yüksek oranda çoğullanmış biyobelirteç analizine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda istenirse ek çıkış yönü analizi için numuneyi korur (örneğin, hematoksilin ve eozin boyama). Ayrıca, görüntü analiz yazılımı, görüntü işleme-sürüklenme telafisi, arka plan çıkarma, hücre segmentasyonu ve kümelemenin yanı sıra uzamsal ağ haritalarının oluşturulması için görüntülerin ve hücre fenotiplerinin görselleştirilmesini ve analizini sağlar. Özetle, bu teknoloji, dokuya bağlı, oligonükleotid konjuge antikorlara tamamlayıcı olan floresan olarak etiketlenmiş DNA problarını yinelemeli olarak hibritize etmek, görüntülemek ve şeritlemek için bilgisayarlı bir mikroakışkan sistemi ve floresan mikroskobu kullanır.
Introduction
Tümör mikroçevresi (TME), tümör hücreleri, tümör stromal hücreleri, bağışıklık hücreleri, hücre dışı matriksin hücresel olmayan bileşenleri ve tümör, stromal ve bağışıklık hücreleri tarafından üretilen ve salınan çok sayıda bol molekülden oluşan son derece heterojendir 1,2. Biriken kanıtlar, TME'nin tümör farklılaşması, büyümesi, invazyonu, metastazı ve tedavilere yanıtının yeniden programlanmasında çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir3.
TME'deki farklı hücre tiplerinin sinyal ağları aracılığıyla birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve iletişim kurduğunu anlamak, kanser teşhisini iyileştirmek, immünoterapiyi optimize etmek ve yeni tedaviler geliştirmek için gereklidir4. İmmünohistokimya (IHC) ve immünofloresan (IF) dahil olmak üzere geleneksel doku mikroskobu teknikleri, tümör örneklerinde hücre tiplerini, bolluğunu ve iletişimini incelemek için on yıllardır kullanılmaktadır. Ne yazık ki, bu teknikler tipik olarak bir doku kesitinde sadece bir veya iki protein belirtecini değerlendirebilir ve bu hücreler arasındaki karmaşık mekansal ve yapısal ilişkileri ortaya koyamaz 5,8,7.
Son yirmi yılda, birkaç çoğullanmış görüntüleme teknolojisi kurulmuştur8. Bu teknolojiler, TME içindeki bağışıklık hücrelerinin bileşimi, işlevi ve konumu hakkında çok daha gelişmiş görünümler sunarak, karmaşık TME'leri tek hücre düzeyinde 9,10'da tanımlama ve mekansal olarak profilleme yeteneğinde hızlı ilerlemelere yol açmaktadır. TME'deki çeşitli tümör ve immün hücrelerin mekansal ve yapısal ilişkileri, günümüzde bu çoklanmış görüntüleme teknolojilerinin kullanıldığı biyolojik ve klinik çalışmaların ön saflarında yer almaktadır11,12.
Oligonükleotid konjuge antikor barkodlaması kullanılarak yakın zamanda geliştirilen çoklanmış görüntüleme teknolojisi, formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örneklerde oligonükleotid konjuge antikorların saptanmasına dayanan etkili bir tek hücreli biyolojik araştırma platformudur13,14. Şu anda, bu çoklanmış görüntüleme teknolojisi, tek bir doku bölüm15'te 100'den fazla belirtecin aynı anda görüntülenmesine izin vermekte ve bu da in situ olarak ayırt edilebilen hücre tiplerinin sayısını arttırmaktadır. Bu, geleneksel immünofenotipleme yaklaşımları kullanılarak mümkün olmayan tümör ve bağışıklık hücrelerinin mekansal analizini sağlar16.
Burada, oligonükleotidlere karşı saflaştırılmış antikorların konjuge edilmesi ve bu konjugasyonun çoklanmış görüntüleme platformu ve FFPE dokusu ile çok döngülü bir görüntüleme prosedürü kullanılarak doğrulanması için optimize edilmiş bir protokol tanımlanmıştır. Ayrıca, bu teknoloji ile kullanılan temel görüntü işleme ve veri analizi prosedürlerini açıklıyoruz.
Protocol
Bu retrospektif çalışma, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. FFPE doku örnekleri, rutin standart bakımın bir parçası olarak MD Anderson'daki hastalardan toplandı. Hiçbir tanısal veya terapötik girişim yapılmadı. Araştırma ve yayın için toplanan örneklerin kullanımı için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Antikor paneli tasarımı için kullanılan antikor kaynakları
- İlgilenilen dokuların ve proteinlerin kalitesini dikkatlice değerlendirdikten sonra çoğullanmış görüntüleme için bir antikor paneli oluşturun. Antikor paneli tasarımı için üç antikor kaynağı göz önünde bulundurulur: 1) tamamen ticari olarak doğrulanmış antikorlar, 2) çok katlı görüntüleme teknolojisi ile taranan antikorlar ve 3) son kullanıcı tarafından paylaşılan antikorlar.
NOT: Multipleks görüntüleme teknolojisi ile taranan antikorların işe yaradığı gösterilmiştir ve satıcılardan temin edilebilir. Taranan bu antikorlar, kullanıcı tarafından oligonükleotid konjugasyonu sonrası çoklanmış görüntü boyamalarına uygulanabilir. - Yukarıda belirtilen kaynaklarda ilgilenilen bir protein bulunamazsa, IHC ile çalıştığı bilinen antikor klonlarını kullanın. Ek olarak, bu çoklanmış görüntüleme teknolojisi için IgM klonları yerine IgG izotipleri, IgM ile IgG klonlarından daha yüksek başarısızlık oranı nedeniyle önerilmektedir.
2. Antikor konjugasyonundan önce
- Çok katlı görüntüleme barkodları kullanarak konjugasyon için antikor klonlarını tanımlarken, fosfat tamponlu salin (PBS) veya benzer bir tamponda taşıyıcısız antikorlar satın almayı düşünün. BSA, gluten, gliserol ve diğer protein katkı maddeleri dahil olmak üzere taşıyıcı proteinlerin konjugasyon kapasitesini azalttığı bilinmektedir.
- En uygun antikor klonunu seçin ve konjugasyondan önce her zaman boyama koşullarını (yani antijen alımı ve titrasyon) optimize edin. Bunu, standart IF veya IHC kullanarak bu antikor için pozitif ve negatif dokuya konjuge edilmemiş bir antikor klonu uygulayarak yapın.
NOT: Saflaştırılmış bir antikor ticari olarak mevcut değilse, konjugasyondan önce bir antikor saflaştırma işlemi yapılmalıdır. Antikor saflaştırma kitleri ile kullanılan saflaştırma prosedürü burada tartışılmamıştır.
3. Antikor konjugasyonu
- Antikor konjugasyon reaktiflerini elde edin. Ticari olarak temin edilebilen konjugasyon kitleri bir filtre bloke edici çözelti, indirgeme çözeltisi 2, konjugasyon çözeltisi, saflaştırma çözeltisi, antikor depolama çözeltisi (hepsi 4 ° C'de depolanır) ve indirgeme çözeltisi 1 (-20 ° C'de depolanır) içerir.
- Konjugasyon
NOT: Saflaştırılmış bir antikor, bir indirgeyici ajan ile muamele edilir, bu da antikorun azaltılmış parçalarının bu teknolojiyle kullanılan çoklanmış görüntüleme barkodu ile reaksiyona girmesine ve böylece kovalent bir bağ oluşturmasına izin verir. Bu işlem yaklaşık 4.5 saat sürer ve 1 yıl boyunca canlı olan kabaca 120 μL konjuge antikor ile sonuçlanır. Tüm spin-down oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir ve bir toplama tüpünün konjuge antikoru içerdiği son adım (3.2.9) dışında akış atılır.- 50 kDa moleküler ağırlıklı kesme filtresi sütunlarına bir pipet kullanarak 500 μL filtre bloke edici çözeltiyi aspire edin ve uygulayın ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için 2 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
NOT: Kolonun üst kısmındaki artık çözelti fark edilirse, toplama tüpündeki filtreyi ters çevirin ve 2 dakika boyunca 3.000 x g'de aşağı doğru döndürün. - Filtre kolonuna 100 μL hacimli bir çözelti içinde 50 μg antikor pipeti verin ve 8 dakika boyunca 12.000 x g'de aşağı doğru döndürün.
NOT: Saflaştırılmış antikorun konsantrasyonunu ölçmek ve antikorun 50 μg'ına karşılık gelen çözelti hacmini hesaplamak için bir spektrofotometre kullanın. Antikor çözeltisinin hacmi 100 μL'den azsa, 1x PBS ekleyerek ses seviyesini 100 μL'ye ayarlayın. Konjugasyon doğrulaması için 1 μg konjuge edilmemiş antikor tutun (adım 4.4). - Her filtre sütununa pipet 260 μL indirgeme ana karışımı (20 μL indirgeme çözeltisi 1, üç antikor konjugasyon reaksiyonu için yeterli olan 825 μL indirgeme çözeltisi 2 ile karıştırılır). Ana karışımı 2-3 saniye boyunca yavaşça vorteksleyin veya çözeltiyi antikorla karıştırmak için pipeti yukarı ve aşağı kaydırın. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, filtre sütunlarını 8 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün. Filtre sütunlarına 450 μL konjugasyon çözeltisi ekleyin ve 8 dakika boyunca 12.000 x g'de aşağı doğru döndürün.
- İstenilen barkodu 10 μL nükleaz içermeyen su ve 210 μL konjugasyon çözeltisi içinde tekrar askıya alın.
NOT: Boyama için kullanmadan hemen önce bir antikor etiketi hazırlayın. Antikor barkod aliquots'u tekrar kullanmayın. - Adım 3.2.4'te spin-down'un tamamlanmasından sonra, karşılık gelen her filtre sütununa yeniden askıya alınmış antikor etiketini (yaklaşık 220 μL) ekleyin. Reaktifleri karıştırmak için karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetin. Filtre kolon kapaklarını kapatın ve RT'de konjugasyon reaksiyonunu 2 saat boyunca inkübe edin. 2 saat sonra, filtre sütunlarını 8 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
NOT: Konjuge çözeltinin 5 μL'sinin bir polimeraz zincir reaksiyon tüpünde bir kenara bırakılması ve 4 °C'de saklanması onay protokolü için önerilir (aşağıya bakınız). - Her filtre kolonuna 450 μL saflaştırma çözeltisi pipet edin ve 8 dakika boyunca 12.000 x g'de aşağı doğru döndürün. Üç kez tekrarlayın.
- Pipet 100 μL depolama çözeltisini filtre sütunlarına yerleştirin. Karışımı 10 defadan fazla yukarı ve aşağı yavaşça pipetleyin ve filtrelerin kenarlarını kolonda dikkatlice yıkayın.
NOT: 50 μg antikoru 100 μL depolama çözeltisi içinde çözün. Konjugasyon reaksiyonu 50 μg'den fazla antikor ile başlatılırsa, bu oranda daha fazla depolama çözeltisi ekleyin. - Yeni bir toplama tüpündeki filtre sütunlarını ters çevirin. RT'de 2 dakika boyunca 3.000 x g'de aşağı doğru döndürün. toplanan çözeltiyi saklayın. Konjuge antikor çözeltisini steril vidalı borulara pipetleyin ve 4 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
NOT: Konjuge bir antikor 2 gün sonra multipleks görüntüleme teknolojisi ile test edilmelidir. Bundan önce yapılan testler, yüksek arka planda nükleer lekelenmeye neden olabilir.
- 50 kDa moleküler ağırlıklı kesme filtresi sütunlarına bir pipet kullanarak 500 μL filtre bloke edici çözeltiyi aspire edin ve uygulayın ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için 2 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
4. Konjugasyon onayı
NOT: Çoklanmış görüntüleme teknolojisini kullanarak kullanıcı konjuge bir antikor ile boyama deneyleri yapmadan önce, konjugasyon, kontrol olarak konjuge antikorun 5 μL'si (bkz. adım 3.2.6) ile jel elektroforezi ve 1 μg konjuge edilmemiş antikor (genellikle karışımın 2 μL'sinde) kullanılarak doğrulanmalıdır. Başarılı bir antikor konjugasyonu, antikorun moleküler ağırlığındaki bir artışla gösterilecektir. Bununla birlikte, bu doğrulama protokolü sadece konjugasyon için kimyasal reaksiyonun başarısını değerlendirir ve çoğullanmış görüntüleme için kullanılan antikor doğrulamasını ele almaz.
- Pipet 8 μL ve 11 μL nükleaz içermeyen suyu ayrılmış konjuge antikora içine alın ve 13 μL'lik nihai bir hacim elde etmek için konjuge edilmemiş antikoru kontrol edin.
- Pipet 5 μL LDS (veya diğer sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez sistemi) numune tamponu ve 2 μL numune indirgeyici ajan, ayrılmış konjuge antikorun her bir numunesine yerleştirin ve numuneleri 95 °C'lik kuru bir banyoda 10 dakika boyunca denatüre edin.
- Numuneler denatüre olurken, 40 mL MOPS SDS çalışma tamponunu 760 mL ultra saf suda seyreltin, bir elektroforez sisteminin tankına bir jel yerleştirin ve seyreltilmiş çalışma tamponunu jelin üzerine dökün.
- 10 dakikalık denatürizasyon süresi tamamlandıktan sonra, jelin bir kuyucuğuna önceden boyanmış bir protein standardı, bir tanesi konjuge edilmemiş antikor (adım 3.2.2'den itibaren) ve kalan kuyucuklara konjuge antikor örnekleri ile yükleyin. Daha sonra, jelin sonunda protein standardı görünene kadar jeli 150 V'ta çalıştırın.
NOT: Jel, mikrodalga güvenli kaplara kolayca yapışır ve bu nedenle yırtılabilir, bu nedenle jel aşağıdaki adımlarda dikkatle kullanılmalıdır. - Çalışma tamamlandıktan sonra, jeli ultra saf suyla önceden doldurulmuş mikrodalga güvenli bir kaba aktarın ve sudaki ilk kabarcık görselleşene kadar bir mikrodalgada ısıtın.
NOT: Kabarcıkların oluşma süresi, kullanılan mikrodalgaya bağlı olarak büyük ölçüde değişir. - Suyu kaptan boşaltın, jelin üzerine yaklaşık 250 mL Coomassie G-250 lekesi dökün ve jeli ilk kabarcık görselleşene kadar bir mikrodalgada ısıtın. Daha sonra, jel ve Coomassie G-250 lekesi içeren kabı mikrodalgadan çıkarın ve 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Salladıktan sonra, lekeyi dikkatlice boşaltın, yaklaşık 200 mL ultra saf su ile değiştirin ve ardından jeli yıkamak için kabı çalkalayıcıya yerleştirin.
- Ultra saf suyu boşaltın ve beş kez veya lekenin kalıntıları su banyosunda görünmeyene kadar yeni ultra saf suyla değiştirin. Jeli fotoğraflamadan önce, gerekirse bantlar görünene kadar jeli gece boyunca çalkalayıcıda yıkamaya bırakın (Şekil 1).
NOT: Multipleksli görüntülemede kullanılan antikorlar, boya konjuge antikorlarınkiyle karşılaştırılabilir boyama paternlerine sahip olmalıdır. Konjuge antikorlar için pozitif olduğu bilinen antijenlere sahip doku kesitleri, oligonükleotid konjuge ve boya konjuge antikorlarla boyanabilir. Bu çalışmada, her durumda, her iki antikor tipi için doku morfolojileri, ilgili proteinlerin biyolojisine ve test dokusu örneklerine dayanarak, beklenen hücre dağılımının yanı sıra, birbirleriyle eşdeğer ve uyumlu hale getirilmiştir. Bu sonuç, FFPE dokusu kullanılarak doku boyama temelli yaklaşımlarda oligonükleotid konjuge antikor moieties kullanımının etkinliğini göstermektedir.
5. Oligonükleotid konjuge antikor boyama
- Doku yerleştirme için kapak fişleri hazırlayın.
- Doku yapışmasını iyileştirmek için kapakları RT'de 24 saat boyunca% 0.1'lik bir poli-L-lizin çözeltisine batırın.
- Islattıktan sonra, poli-L-lizin çözeltisini boşaltın ve kapakları 30 s boyunca ultra saf suyla yıkayın. Yıkamayı dört ila altı kez tekrarlayın. Kapakları yıkamak için kullanılan ultra saf sudan çıkarın ve gece boyunca kuruması için tüy bırakmayan bir havluya yerleştirin.
NOT: Bir histolog, seçilen dokuyu 5 μm kalınlığında bölümlere ayırmalı, poli-L-lizin yüklü bir örtünün ortasına yerleştirmeli ve gece boyunca kurumasını sağlamalıdır. Kuruduktan sonra, doku kesitli kapaklar 4 ° C'de 6 aydan fazla olmamak üzere saklanmalıdır. Bu protokoldeki boyama paneli 26 işaretleyici içeriyordu. Bu protokolde kullanılan doku normal insan bademcik dokusuydu. Kapak kayması ıslatma süresi 1 haftayı geçmemelidir. Poli-L-lizin kaplı kapaklar RT'de saklanabilir ve hazırlandıktan sonra 2 ay içinde kullanılmalıdır.
- Boyamadan bir gün önce, kapak tutucuyu gece boyunca 60 ° C'lik bir fırına yerleştirin.
- Ertesi gün, kapak kayması numunesini 60 °C'lik bir fırında önceden ısıtılmış bir kapak tutucusuna yerleştirin. 30 dakika pişirdikten sonra, parafinin dokudan eriyip erimediğini kontrol edin.
- Kapak kayması tutucusunu/numuneyi aşağıdaki çözelti serisine hızlı bir şekilde yerleştirin: her biri 6 dakika boyunca iki tur mum giderme maddesi; her biri 5 dakika boyunca iki tur% 100 etanol; 5 dakika boyunca bir tur% 90 etanol; 5 dakika boyunca bir tur% 70 etanol; 5 dakika boyunca bir tur% 50 etanol; 5 dakika boyunca bir tur% 30 etanol; ve her biri 5 dakika boyunca iki tur dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış ultra saf su.
NOT: Etanolün tüm seyreltmeleri DEPC ile arıtılmış ultra saf su ile hazırlanır. Mum giderme için ksilen kullanılıyorsa, bir başlıkta kullanılmalıdır. - Kapak kayması tutucusunu/numuneyi çözelti serisine tabi tutarken aşağıdakileri yapın:
- Altta suya batırılmış bir kağıt havlu bulunan boş bir pipet ucu kutusu yerleştirerek bir nem odası hazırlayın.
- Bir düdüklü tencereyi 50 mL'lik bir beherin yarısını kaplayacak kadar suyla doldurun.
- Numune başına 5 mL metanolü 4 °C'de beher içine yerleştirin.
- AR9 tamponunu DEPC ile arıtılmış ultra saf su ile 1x'e seyreltin; Kapak tutucu başına yaklaşık 50 mL seyreltilmiş tampon gereklidir.
- Çözelti serisi tamamlandıktan sonra, 50 mL'lik bir cam kabı yaklaşık 40 mL 1x AR9 tamponla doldurun, kapak kapağı tutucusunu / numuneyi beher içine batırın ve beher/kapak tutucuyu tamamen alüminyum folyo ile örtün.
- Alüminyum folyo kaplı beher/kapak tutucuyu su dolu düdüklü tencereye yerleştirin ve 20 dakika boyunca yüksek basınçta (yaklaşık 15 psi) pişirin.
- Pişirdikten sonra, beher/kapak tutucuyu çıkarın, alüminyum folyoyu dikkatlice açın ve beher/kapak tutucunun RT'de yaklaşık 10 dakika soğumasını bekleyin.
- Kapak kayması tutucusunu/numuneyi 1x AR9 tamponundan çıkarın ve iki tur DEPC ile işlenmiş ultra saf suya batırın, numunelerin her iki turda da her biri 2 dakika boyunca inkübasyonunu gerçekleştirin.
- İnkübasyon sırasında, hidrasyon tamponunu, bloke edici N'yi, bloke edici G'yi, bloke eden J ve bloke edici S çözeltilerini ve multipleks görüntüleme boyama kitinden antikor seyreltici / bloğunu alın. İki kapak kaymalı numune için, Şekil 2'de gösterilen konfigürasyonları kullanarak çözeltiler için 6 delikli plakaları etiketleyin.
- Kapak kayması numunesini, her biri 2 dakika boyunca hidrasyon tamponunun 5 mL'lik iki turuna yerleştirin.
- Hidrasyon tamponuna her iki yerleştirme turundan sonra, kapak kayması numunesini çoklanmış görüntüleme antikoru seyreltici / bloğunun 5 mL'sine yerleştirin ve RT'de 20-30 dakika inkübe edin (30 dakikayı geçmeyin).
- Kuluçka sırasında, multipleks görüntüleme antikoru seyreltici / bloğu, N bloker, G bloker, J bloker ve S bloker çözeltilerinin 200 μL'lik bir ana karışımını yaparak bir antikor kokteyli hazırlayın.
NOT: Toplam antikor miktarını, belirteçlerin sayısına ve her bir belirtecin doğrulanmış titrasyonuna göre hesaplayın ve toplam antikor miktarını ana karışımdan çıkarın. Örneğin, her biri 1:200 titrasyona sahip altı belirteç için denklem 200 μL ana karışım − 6 μL antikor kokteyli = 194 μL ana karışım olacaktır.
- Multipleks görüntüleme antikoru seyreltici/bloğunda inkübasyondan sonra, kapak kayması numunesini adım 5.5.1'de hazırlanan nem odasına yerleştirin, antikor kokteylinin 190 μL'lik pipetini kapak kayması numunesinin üzerine yerleştirin ve kapak kayması numunesini RT'de 3 saat boyunca inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, kapak kayması numunesini, her biri 2 dakika boyunca 5 mL çoklanmış görüntüleme antikoru seyreltici / bloğu ile iki tur halinde yıkayın.
- Bağlı antikorları kapak kayması üzerindeki dokuya sabitlemek için, nem odasında 5.7.3-5.7.5 adımlarını uygulayın.
- Kapak kapaklarını% 16 formaldehit ile depolama çözeltisiyle% 1.6'ya seyreltilmiş 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kapak kapaklarını 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Kapak fişlerini 4 °C metanol ile 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kapak fişlerini 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- 1x PBS ile seyreltilmiş 5 mL fiksatif reaktif ile kapak kapaklarını 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kapak kapaklarını 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Lekeli kapak kayması numunelerini 4 °C'de depolama tamponunda 2 haftaya kadar saklayın
6. Çok katlı görüntüleme muhabir plakası
NOT: Muhabir plakası olarak adlandırılan, tek tek kuyucuklarda barkodlu floroforlar içeren 96 delikli bir plaka, özel olarak tasarlanmış çoklanmış görüntüleme deneylerine göre hazırlanır ve her bir lekeli kapak kayması numunesi ile ilişkilendirilir. Aşağıdaki adımlar muhabir plakasının hazırlanması içindir.
- 4.880 μL nükleaz içermeyen su, 600 μL 10x çoğullanmış görüntüleme tamponu, 500 μL tahlil reaktifi ve 20 μL nükleer leke çözeltisini birleştirerek bir muhabir ana karışımı hazırlayın. Bu, tüm kuyuların 20 döngüsü için yeterli olacaktır.
- Özel olarak tasarlanmış çoklanmış görüntüleme deneyinin her döngüsünde, bir kuyucuğu raporlayıcı ana karışımını ve bu döngü için spesifik barkodlu floroforları içeren 245 μL'lik bir çözelti ile doldurun.
NOT: Bir karsinom paneli için bu protokolde kullanılan muhabir plakası yapılandırması için Şekil 3'e bakınız. - Barkodlu floroforları korumak için, muhabir plakasının üzerine bir folyo plaka kapağı yapıştırın ve plakayı çoklanmış görüntüleme cihazının içine yerleştirin.
- Muhabir plakasını karanlık bir kutuda 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
7. Çoklanmış görüntüleme makinesinin kalibre edilmesi ve çalıştırılması
NOT: Yüksek çözünürlüklü görüntüleme floresan mikroskobu, her çok katlı görüntüleme döngüsünde dört farklı floresan kanalını 20x,% 100 uyarma ışığında ve düşük fotobeyazlatma ile yakalar.
- DAPI kanalını kullanarak mikroskop aşamasına bir numune kapağı yerleştirerek görüntülemenin odağını kalibre edin, 1:1.500 nükleer leke çözeltisinin 700 μL'sini dokuya manuel olarak pipetleyin.
NOT: Numune yıkama ve görüntüleme sırasında kapak kayması mikroskop aşamasında tutulur. - Çok katlı görüntüleme cihazını hazırlamak için, DEPC ile işlenmiş ultra saf su kullanarak 10x çoğullanmış görüntüleme arabelleğini 1x'e seyreltin ve seyreltilmiş 1x çoğullanmış görüntüleme tamponu, DEPC ile işlenmiş ultra saf su ve dimetil sülfoksit (DMSO) dahil olmak üzere reaktif şişelerini uygun çözeltiler/çözücülerle doldurun.
- Reaktif şişeleri uygun şekilde doldurulduktan sonra, deneysel tasarımı çoklanmış görüntüleme cihazı yönetici yazılımına girin; her döngü için doğru döngüyü, kuyu numaralarını, z-yığını yerlerini, işaretleyici adını, sınıfını ve pozlama süresini belirleyin (Şekil 4); tüm mikroskop parametrelerini ayarlamak; tıklayın ve görüntülenecek örnek kapak fişinde ilgilenilen bölgeleri seçin.
- Kontrol yazılımındaki Deney düğmesine tıklayın (Şekil 4A). Deneme Kurulumu ve Yönetimi penceresinde, Yeni Şablon düğmesini tıklayın (Şekil 4B).
- Proje adını Proje düğmesinin yanındaki boşluğa yazın (Şekil 4C). Toplam döngü sayısını yazın veya seçin (Şekil 4D).
- Kanal Ataması düğmesine tıklayın, her döngü için bilgileri sütunlara yazın (Şekil 4E) ve Şablonu Kaydet düğmesine tıklayın. Denemeyi Başlat düğmesini tıklayarak denemeyi başlatın.
NOT: Çok katlı bir görüntüleme deneyi sırasında, cihaz barkodlu floroforları muhabir plakasının bir kuyucuğundan alır (DAPI dahil kuyu başına maksimum dört florofor), bunları doğrudan numune kapağına dağıtır ve her floresan kanalı için ilgi alanlarını görüntüler. Bu döngü için tüm görüntülemeyi takiben, cihaz barkodlu floroforları yıkar ve bir sonraki muhabir döngüsünü (muhabir plakasındaki bir sonraki kuyudan) dağıtır. Görüntüleme, 26 belirteç kullanan tüm döngüler tamamlanana kadar devam eder.
8. Görüntü koleksiyonu
NOT: Çoğullanmış görüntüler, dört floresan kanalı (DAPI, Cy3, Cy5 ve Cy7) ile yapılandırılmış ve bir Plan Fluor 20x lens ile donatılmış herhangi bir uyarlanmış ters floresan mikroskop kullanılarak toplanabilir. Kapak kayması numunelerinin görüntülenmesi ve yıkanması, özel olarak geliştirilmiş bir akışkan kurulumu kullanılarak yinelemeli olarak otomatik olarak gerçekleştirilir. Görüntüler, QPTIFF formatında İşlemci yazılımı (v1.8.0.7) kullanılarak elde edilir.
- İşlemci penceresinde, Giriş düğmesine tıklayın ve deneme adını seçin.
- İşleme Seçenekleri bölümünde, Arka Plan Çıkarma, Evrişim Giderme, Genişletilmiş Alan Derinliği ve Gölgelendirme Düzeltme'yi seçin ve işaretleyin. Başlat düğmesine tıklayın.
9. Görüntü analizi
NOT: Elde edilen görüntüler, aşağı akış analizi için patentli bir otomatik görüntü analiz yazılımına veya açık kaynaklı yazılım programına (Şekil 5) yüklenebilir.
- Bilgisayardaki QuPath simgesine tıklayın ve yazılımı açın. QPTIFF dosyasını Görüntüleyici penceresine sürükleyin.
- Parlaklık ve Kontrast penceresini açacak olan Parlaklık ve Kontrast düğmesine tıklayın. İşaretçi sinyalini göstermek veya kapatmak için Seçili sütunundaki işaretçiyi işaretleyin veya işaretini kaldırın.
- İlgi alanını yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için Sığdırmak için yakınlaştır düğmesine tıklayın.
NOT: Çoğullanmış görüntü verisi görselleştirmesi, kullanıcıya doku mikro ortamına derinlemesine bir bakış sağlar. FFPE örneklerindeki bireysel belirteçler floresan formatında (Şekil 6 ve Şekil 7) veya patoloji görünümünde görselleştirilebilir. Kompozit görüntüleri işlemek ve çoğullanmış doku görüntü verilerini analiz etmek için çeşitli hesaplama platformları kullanılabilir. Bu yazılımı kullanarak, uzamsal fenotiplemenin yanı sıra nadir hücre keşfi ve hücre komşuluğu hesaplaması, çoklanmış görüntüleme teknolojisi ile üretilen ultra yüksek çoğullanmış dokunun tüm slayt görüntüleri ile gerçekleştirilebilir. Karsinom panelindeki ve bademcik örneğindeki 26 antikor için Şekil 6'ya bakınız (Ek Şekil 1).
Representative Results
Bir barkodlama görüntü analiz sistemi kullanarak FFPE dokusunun bağışıklık durumunu göstermek için 26 belirteçli bir immün onkoloji paneli geliştirmek için FFPE bademcik örneklerini kullandık. Genel olarak, laboratuvarımızdaki diğer çoklanmış görüntüleme çalışmalarında şu anda 19 antikor kullanılmaktadır. Tüm belirteçler kromojenik IHC ile FFPE dokusu kullanılarak test edilmiştir. Tüm antikorlar benzersiz DNA oligonükleotidlerine konjuge edildi. Bu barkodlama görüntü analiz teknolojisi için web tabanlı cihaz yöneticisini (Şekil 4) kullanarak kapak fişlerini ayarlarken, ilk ve son döngülerin her zaman "boş" olduğu (Şekil 2 ve Şekil 4) ve bu da arka plan floresan sinyallerinin antikorlardan gelen spesifik sinyallerden çıkarılmasını sağlar. QPTIFF formatındaki görüntüler floresan mikroskobu ile toplandıktan sonra, birkaç patentli otomatik görüntü analiz yazılımı veya açık kaynaklı yazılım programları kullanılarak görselleştirilebilir. Bileşik görüntüler, sinyallerin daha iyi görülebilmesi için tüm işaretçileri veya seçilen işaretçileri gösterebilir (Şekil 5). Ayrıca, her antikor nükleer, sitoplazmik veya membranöz lokalizasyon için görsel olarak değerlendirilebilir. İmmün, tümör ve stromal hücreler kolayca tanımlanabilir. Daha sonra, görüntü analizi tüm belirteçlerin sinyal yoğunluğu, dinamik aralığı ve uzamsal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilir (Şekil 6). Bu teknik, hücre altı seviyedeki 26 belirtecin tümünü tek bir doku kesitinde analiz etmemizi sağladı (Şekil 7). Belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu analiz ederek, hücresel fenotipleri tanımlayabilir, uzamsal hücre konumunu lokalize edebilir, hücreler arasındaki mesafeyi hesaplayabilir ve hücrelerin dağılımını bulabiliriz. Bu teknolojinin en önemli etkisi, doku mikro ortamının bağışıklık durumuna odaklanan sağlam bir 26 belirteç panelinin sunulmasıdır.
Şekil 1: Bir Bis-Tris protein jeli kullanılarak özel konjuge antikor doğrulamasının görüntüsü. Jelin şerit 1'i protein standardını gösterir. Şerit 2 ve Şerit 4, barkod konjuge antikorları (oklar) gösterir. Şerit 3 ve Şerit 5, konjuge edilmemiş bir antikordan (ok uçları) ağır ve hafif zincir bantlarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki kapak kayması örneği için boyama plakası konfigürasyon haritası. Kısaltmalar: HB = hidrasyon tamponu; B = antikor seyreltici / blok; PSFS = boyama sonrası fiksatif çözelti; PBS = fosfat tamponlu salin; MeOH = metanol; S = depolama çözümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Muhabir plakası konfigürasyonu. Her konjuge antikor, belirli bir muhabiri tamamlayan bir barkoda sahiptir. Muhabir plakasını ayarlamak için, her konjuge antikor ve buna karşılık gelen muhabir listelenmelidir. Daha sonra, her antikora bir döngü numarası atanır. İki boş döngünün (C1 ve C18) performansı, üç floresan kanalındaki otofloresan seviyesini değerlendirmek ve görüntü yakalama kontrol yazılımını kullanarak görüntüleme sonrası arka plan çıkarma için kullanılır. Bir yazılım sihirbazı, tüm ayarların doğru olduğundan emin olmak için bu aşamada cihazı kontrol edecektir (Şekil 4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deneme kurulumu için kontrol yazılımı kullanılarak görüntü toplama. (A) Kurulumu hazırlamak ve başlatmak için kontrol yazılımının sol alt köşesindeki Deneme sekmesini seçin. (B,C) Deneysel ayarları yeni bir proje ve deneme adıyla girmek için Yeni Şablon'u seçin. (D) Başlangıç döngüsünü ve döngü sayısını, 96 kuyulu raportör plakasındaki raportör konumunu yansıtacak şekilde değiştirin. (E) Deney çalışması için belirlenen dört kanala uygun floresan kanalları atayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Web tabanlı yazılım (QuPath) kullanarak görüntü görselleştirme. Görüntüleyici penceresi, lekeli bademcik dokusu FFPE bölümünde 26 belirteç gösterir. Parlaklık ve Kontrast penceresi, işaretçileri onay işaretleriyle birlikte gösterir. Son olarak, görüntüleyici penceresi FFPE örneğini seçilen işaretçilerle birlikte gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Web tabanlı yazılım kullanarak görüntü görselleştirme. (A) Bademcik doku kesitleri 26 belirteç için boyandı ve QPTIFF formatındaki bölümlerin görüntüleri, ek açıklama ve inceleme için ticari dijital slayt görüntüleyici yazılımı veya açık kaynaklı yazılım (QuPath) kullanılarak görselleştirildi. (B-F) Sinyallerin daha iyi görülebilmesi için aynı ek açıklamada altı işaretçi görüntülendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Web tabanlı yazılımla kullanılan 26 ayrı işaretleyicinin görünümleri. Bademcik dokusundaki belirteç ekspresyonu, immün onkoloji paneli (sol üstte) ile immünofloresan boyama yoluyla gösterilir. İki küçük alandaki (kırmızı dikdörtgenler) bireysel belirteçler gösterilmiştir. Yakınlaştırılmış ekleme, bu işaretçiler için pozitif hücreleri gösterir (beyaz oklar). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Çoğullanmış görüntü alma iş akışının özeti. FFPE doku kesitleri 26 antikor paneli kullanılarak boyandı ve ardından çok döngülü bir reaksiyon izledi. Lekeli kesitlerin ham görüntüleri hesaplamalı olarak işlendi ve kompozit görüntüler kullanılarak bir hücre yoğunluğu ve mekansal analiz yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Bademcik dokusunda IHC validasyonu. FFPE doku kesitleri bireysel bir antikor kullanılarak boyandı. Bademcik dokusundaki işaretleyici ifadesi düşük bir büyütmede gösterilir ve yakınlaştırılmış ek bileşen, işaretleyici için pozitif hücreleri gösterir (kırmızı dikdörtgenler). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
TME, kanser gelişimi, ilerlemesi ve tedavi yanıtlarında önemli bir rol oynar. Ek olarak, TME'deki spesifik tümör infiltrasyonu yapan lenfosit alt gruplarının yoğunluğu, belirli kanser türleri için prognostik bir biyobelirteç görevi görebilir. Dikkat çekici bir şekilde, TME'nin hücresel bileşimine ek olarak, bir tümörün mekansal özellikleri, tümörün biyolojisini anlamak ve potansiyel prognostik biyobelirteçleri tanımlamak için bir taslak sağlayabilir12,17.
Çok sayıda bağışıklık hücresi popülasyonu prokanser veya antikanser yanıtlarına dahil olduğundan, bu hücrelerin ve birbirleriyle ve kanser hücreleriyle mekansal ilişkilerinin daha iyi anlaşılması, yeni immünoterapötik stratejilerin tanımlanmasına rehberlik edecektir. Önceki çalışmalar, TME hücrelerinin yerini ve mekansal dağılımını, intratümöral ve peritümöral alanlardaki doku yapısına ve tümör hücrelerinin invaziv sınırlarına göre tabakalaştırmıştır18,19. Son 15 yılda, teknolojik gelişmeler, bireysel hücrelerin mekansal dağılımlarına dayanan fenotipik analizini, TME'yi incelemek ve tümör immünoterapisi için potansiyel biyobelirteçleri kategorize etmek için yeni, etkili bir araç haline getirmiştir. Multipleks IF histokimyası aynı anda birden fazla biyolojik belirteci tahmin edebilir20.
Oligonükleotid konjuge antikor stratejisine benzer şekilde, TME'yi incelemek için dört tip protein bazlı multipleks platform kullanılır: kromojen, floresan, DNA barkodu ve metal izotop etiketli antikor tespit sistemleri. Uygun maliyetli kromojenik IHC platformları, geleneksel parlak alan mikroskobu kullanarak tüm slaytların görüntülenmesini ve patolojik değerlendirmeyi mümkün kılar. Çok katlı IF ve IHC'de, floroforlarla konjuge edilmiş antikorlar kullanılır. Multipleks IF/IHC platformu, yüksek özgüllüğe sahip antikorları tespit eder ve hücre altı seviye 6,21'de bile hedeflenen antikorları ölçebilir. Ek olarak, kromojenlerin ve floroforların doğası gereği, bir antikor panelinin kullanılması, tek bir slaytta 10 adede kadar biyobelirtecin ekspresyonunu yakalayabilir. Metal izotop bazlı platformlarda, metal etiketli antikorlar, tek hücreli ve uzamsal çözünürlükte çoklanmış görüntüleme yapmak için kullanılır ve bireysel doku bölümleri için yüksek hassasiyet gösterir22. Teorik olarak, bu metal konjuge antikor yaklaşımları, tek bir doku kesitinde 100'den fazla biyobelirtecin aynı anda tespit edilmesini sağlar. İzotop etiketleme tekniğinin bir zorluğu, zenginleştirmenin% 100 saflığına ulaşılmasını önleyen izobarik girişimdir23. Ayrıca, belirteçlerin sayısı arttıkça girişim de artar. DNA konjuge antikor tespit platformları, benzersiz DNA barkodlarıyla etiketlenmiş antikorları tanır. Bu platformlarda 40'tan fazla biyobelirteç aynı anda yüksek özgüllükle yakalanabilir6.
Multipleks görüntüleme, DNA konjuge antikorları tek bir adımda tek bir doku slaytına uygulamak için ticari olarak temin edilebilen DNA barkod etiketli bir antikor tespit platformudur (Şekil 8). Doku hazırlama aşaması için, üreticilerden elde edilen altın kaplı slaytların kullanılmasını gerektiren çoklanmış iyon ışını görüntüleme platformunun aksine, çoklanmış görüntüleme platformu, dokunun yapışmasına yardımcı olmak ve boyama ve görüntüleme işlemi sırasında dokuyu sağlam tutmak için% 0.1 poli-L-lizin ile kaplanmış sadece normal kapaklar veya slaytlar gerektirir. Lekelenmeden sonraki 4 hafta içinde kapak kapaklarında doku kesitlerinin kullanılması tavsiye edilir, çünkü lekesiz slaytların uzun süre depolanması antijenitenin azalmasına neden olur. Lekeli bir kapak kayması numunesi, lekelenme sinyalini kaybetmeden 2 haftaya kadar 4 °C'de depolama tamponunda tutulabilir. Kapak kayması numunelerinin saklanması için özel bir ekipman gerekmez. Çok katlı görüntüleme sistemi, daha büyük dokuların boyanmasını ve kolay kullanımını sağlayan kapak kaymaları yerine normal slaytlar kullanacak şekilde yükseltilmiştir. Antikor konjugasyonu için bir indirgeme çözeltisi kullanıldığında (adım 3.2.3), antikorların zarar görmesini önlemek için reaksiyon en fazla 30 dakika ile sınırlandırılmalıdır. Adım 5.6.6'daki bloke edici tamponlar yeni hazırlanmalı ve bloke edici tamponlar tekrar kullanılmamalıdır.
Kromojen, floresan ve metal izotop etiketli multipleks antikor tespit platformlarıyla karşılaştırıldığında, çoğullanmış görüntüleme teknolojisinin bazı avantajları vardır. Örneğin, çoklanmış görüntüleme için önceden tasarlanmış 60'tan fazla antikor paneli ticari olarak temin edilebilir, bu da antikor konjugasyonu ve validasyonunda zamandan ve maliyetten tasarruf etmenize yardımcı olur ve önceden tasarlanmış antikor panellerinin sayısı artmaktadır. Karsinom belirteci pan-sitokeratin, melanom belirteci SOX10, vasküler belirteç CD31, stromal belirteç SMA ve çok sayıda immün hücre belirtecini içeren bu antikorlar doğrulanır ve deneye hazırdır. Önceden tasarlanmamış antikorlar için, çoklanmış görüntüleme ile kullanılmak üzere tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen konjugasyon kiti basit ve kullanıcı dostudur. Müşteri konjuge antikorları 4 °C'de depolandığında 1 yıl boyunca iyidir. Ek olarak, görüntüleri yakalamak için makinenin ısınması gerekli değildir. Bu çoklanmış görüntüleme teknolojisinde, görüntü elde etmedeki yinelemeli yıkama, hibridizasyon ve sıyırma adımları nadiren belirteç yoğunluğunun azalmasına veya doku morfolojisinin bozulmasına neden olur 5,24,25. Ayrıca, kompozit görüntüler basit bir üç renkli floresan mikroskobu ile QPTIFF formatında yakalanır ve üçüncü taraf dijital analiz yazılımı kullanılarak yüklenebilir ve analiz edilebilir. Boyama belirteçleri tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilebilir ve hücre fenotipleri, belirteçlerin birlikte lokalizasyonu yoluyla karakterize edilebilir (Şekil 6 ve Şekil 7). Çok katlı bir görüntünün kapsamlı analizi, doku bölmelerini, tek hücreli belirteç miktarını ve en yakın komşu ve yakınlık verilerini daha da ortaya koymaktadır (Şekil 8).
Çoğullanmış görüntü analizindeki bir zorluk, hücre tipi tanımlamadır. Genellikle, bir görüntüye daha fazla tek nesneli sınıflandırıcı uygulandığında, daha nadir görülen fenotiplere açıklama eklenir. Bu nedenle, aynı sınıflandırıcıda birlikte ifade edilmeyen bilinen belirteçlerin kullanılması ve tek hücrelerin ek açıklamasına yalnızca fenotiple ilgili sınıflandırıcının uygulanması önerilir. Hücre tipi ek açıklamasındaki değişiklikler, hücre uzamsal dağılımındaki farklılıklar ve hücresel komşuluk analizi26,27 gibi önemli ölçüde farklı uzamsal sonuçlarla sonuçlanacaktır.
Çok katlı görüntü analizinin, FFPE dokusu, taze dondurulmuş doku, arşivlenmiş bütün slaytlar ve doku mikrodizileri dahil olmak üzere birçok numune türünün boyanmasında ve görüntülenmesinde başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Meme, beyin, akciğer, dalak, böbrek, lenf nodu ve deri dokusu kesitlerinin çoğullanmış görüntüleri derin tek hücreli uzamsal fenotipleme verileri ile elde edilebilir 5,16,25,28.
Gelecekte, çoğullanmış görüntüleme için daha önceden tasarlanmış antikorlar beklenmektedir. Ek olarak, çoğullanmış görüntü analizi için özel yazılımların geliştirilmesine büyük ihtiyaç vardır. Şu anda, Hi-Plex görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen ve açık kaynaklı birçok yazılım programı mevcuttur29, ancak bilim adamlarının bu analizler için standart bir iş akışı oluşturmada hala yardıma ihtiyaçları vardır30,31. Bu protokol kullanılarak yakalanan bileşik görüntüler üçüncü taraf yazılımlarla uyumlu olsa da, bu durum kullanıcı için ek maliyetlere neden olabilir. Çoklanmış görüntüleme teknolojisinin bir diğer dezavantajı, yinelemeli yıkama, hibridizasyon ve büyük antikor panelleriyle sıyırma işleminden sonra nükleer protein algılamasında sinyal azalmasıdır. Neyse ki, muhabir plakalarını tasarlarken barkodlu floroforların erken döngülerde alınmasıyla bu en aza indirilebilir. Son zamanlarda, bu platform, kompozit görüntüler elde etme süresini önemli ölçüde azaltan yeni bir yüksek hızlı tarama sistemi ile yükseltildi32. Ek olarak, tiramid-konjuge barkodların kullanıldığı yeni bir stratejinin, oligonükleotid konjuge antikor barkodlama tabanlı görüntülemeyi geliştirdiği bildirilmiştir. Bu teknoloji, barkod konjuge antikorların elde edilmesinin zor olduğu boyama sinyallerini yükseltmeyi amaçlamaktadır33.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bu makaleyi düzenledikleri için Düzenleme Hizmetleri'nden Donald R. Norwood'a, MD Anderson'daki Araştırma Tıp Kütüphanesi'ne ve MD Anderson'daki Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü'ndeki multipleks IF ve görüntü analiz laboratuvarına teşekkür eder. Bu proje kısmen Translasyonel Moleküler Patoloji-İmmünoprofiling laboratuvarı (TMP-IL) Moonshots Platformu, Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü, Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi ve NCI İşbirliği Anlaşması U24CA224285 (MD Anderson Kanser Merkezi CIMAC'a) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
| 1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
| Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| Ethanol, 200 proof | |||
| G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
| Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
| Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses. Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).
- Jin, M. Z., Jin, W. L. The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).
- Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
- Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology. Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).
- Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease. Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).
- Phillips, D., et al. Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma. Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).
- Jhaveri, N., et al. Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues. Cancer Research. 82, 3877 (2022).
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Yuan, Y.
- Bruck, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).
- Tsujikawa, T., et al. Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers. Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).
- Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).
- Parra, E. R., et al. Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues. Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).
- Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).
- Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).
- Schurch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).
- Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging. Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).
- Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data. Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999 (2022).
- Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays. Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).
- Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry. Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- DeRosa, J. Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture. Genetic Engineering & Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).
- Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging. Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).
