Summary
Multiplekset strekkodingsbildeanalyse har nylig forbedret karakteriseringen av tumormikromiljøet, noe som tillater omfattende studier av cellesammensetning, funksjonell tilstand og celle-celle-interaksjoner. Her beskriver vi en farge- og avbildningsprotokoll ved hjelp av strekkoding av oligonukleotid-konjugerte antistoffer og syklusavbildning, som muliggjør bruk av en høydimensjonal bildeanalyseteknikk.
Abstract
Multiplexed imaging teknologi ved hjelp av antistoffstrekkoding med oligonukleotider, som sekvensielt oppdager flere epitoper i samme vevsseksjon, er en effektiv metodikk for tumorevaluering som forbedrer forståelsen av tumormikromiljøet. Visualiseringen av proteinuttrykk i formalinfiksert, parafininnebygd vev oppnås når en spesifikk fluorofor er glødet til en antistoffbundet strekkode via komplementære oligonukleotider og deretter prøveavbildning utføres; Faktisk tillater denne metoden bruk av tilpassbare paneler med mer enn 40 antistoffer i en enkelt vevfargingsreaksjon. Denne metoden er kompatibel med ferskt frosset vev, formalinfiksert, parafininnebygd vev, dyrkede celler og mononukleære celler i perifert blod, noe som betyr at forskere kan bruke denne teknologien til å se en rekke prøvetyper ved enkeltcelleoppløsning. Denne metoden starter med en manuell farge- og festeprotokoll, og alle antistoffstrekkodene påføres ved hjelp av en antistoffcocktail. Instrumentet for fargefluidikk er helautomatisert og utfører iterative sykluser med merking, avbildning og fjerning av spektralt distinkte fluoroforer til alle biomarkørene er avbildet ved hjelp av et standard fluorescensmikroskop. Bildene blir deretter samlet og kompilert på tvers av alle bildebehandlingssyklusene for å oppnå enkeltcelleoppløsning for alle markørene. Enkelttrinnsfarging og skånsom fluoroforfjerning tillater ikke bare svært multiplekset biomarkøranalyse, men bevarer også prøven for ytterligere nedstrømsanalyse om ønskelig (f.eks. Hematoksylin- og eosinfarging). Videre muliggjør bildeanalyseprogramvaren bildebehandling-driftkompensasjon, bakgrunnssubtraksjon, cellesegmentering og klynger - samt visualisering og analyse av bildene og cellefenotypene for generering av romlige nettverkskart. Oppsummert benytter denne teknologien et datastyrt mikrofluidikksystem og fluorescensmikroskop for iterativt å hybridisere, avbilde og stripe fluorescerende merkede DNA-prober som er komplementære til vevbundne, oligonukleotid-konjugerte antistoffer.
Introduction
Tumormikromiljøet (TME) er ekstremt heterogent, bestående av tumorceller, tumorstromale celler, immunceller, ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrisen og mange rikelig molekyler produsert og frigjort av tumor-, stromal- og immunceller 1,2. Akkumulerende bevis viser at TME har en sentral rolle i omprogrammering av tumordifferensiering, vekst, invasjon, metastase og respons på terapier3.
Å forstå hvordan ulike celletyper i TME samhandler og kommuniserer med hverandre gjennom signalnettverk er avgjørende for å forbedre kreftdiagnosen, optimalisere immunterapi og utvikle nye behandlinger4. Tradisjonelle vevsmikroskopiteknikker, inkludert immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescens (IF), har blitt brukt i flere tiår for å studere celletyper, overflod og kommunikasjon i tumorprøver. Dessverre kan disse teknikkene vanligvis bare evaluere en eller to proteinmarkører i en vevsseksjon og kan ikke avsløre de komplekse romlige og strukturelle forholdene mellom disse cellene 5,8,7.
I løpet av de siste to tiårene har flere multipleksede bildeteknologier blitt etablert8. Disse teknologiene gir mye bedre oversikt over sammensetningen, funksjonen og plasseringen av immunceller i TME, noe som fører til raske fremskritt i evnen til å identifisere og romlig profilere komplekse TMEer på enkeltcellenivå 9,10. De romlige og strukturelle forholdene mellom ulike tumor- og immunceller i TME er nå i forkant av biologiske og kliniske studier ved bruk av disse multipleksede bildeteknologiene11,12.
Den nylig utviklede multipleksede bildebehandlingsteknologien ved bruk av oligonukleotidkonjugert antistoffstrekkoding er en innflytelsesrik enkeltcellebiologisk forskningsplattform basert på påvisning av oligonukleotidkonjugerte antistoffer i formalinfikserte, parafininnebygde (FFPE) prøver13,14. For tiden tillater denne multipleksede bildeteknologien samtidig avbildning av mer enn 100 markører i en enkelt vevsseksjon15, noe som har økt antall celletyper som kan skilles in situ. Dette muliggjør et nivå av romlig analyse av tumor- og immunceller som ikke er mulig ved bruk av tradisjonelle immunfenotypingstilnærminger16.
Her beskriver vi en optimalisert protokoll for konjugering av rensede antistoffer mot oligonukleotider og validering av denne konjugeringen ved hjelp av multiplekset bildebehandlingsplattform og en multisyklusavbildningsprosedyre med FFPE-vev. I tillegg beskriver vi de grunnleggende prosedyrene for bildebehandling og dataanalyse som brukes med denne teknologien.
Protocol
Denne retrospektive studien ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. FFPE-vevsprøvene ble samlet inn fra pasienter ved MD Anderson som en del av rutinemessig standardbehandling. Ingen diagnostiske eller terapeutiske inngrep ble utført. Det ble innhentet informert samtykke fra pasientene til å bruke prøvene som ble samlet inn til forskning og publisering.
1. Antistoffkilder som brukes til antistoffpaneldesignet
- Lag et antistoffpanel for multiplekset avbildning etter nøye vurdering av kvaliteten på vev og proteiner av interesse. Tre kilder til antistoffer vurderes for antistoffpaneldesignet: 1) fullt kommersielt validerte antistoffer, 2) multipleksede bildeteknologiscreenede antistoffer og 3) sluttbrukerdelte antistoffer.
MERK: Multiplexed imaging teknologi-screenede antistoffer har vist seg å fungere og er tilgjengelige fra leverandører. Disse screenede antistoffene kan brukes på multiplekset bildefarging etter oligonukleotidkonjugering av brukeren. - Hvis et protein av interesse ikke kan bli funnet i kildene nevnt ovenfor, bruk antistoffklonene som er kjent for å fungere med IHC. I tillegg anbefales IgG-isotyper i stedet for IgM-kloner for denne multipleksede bildebehandlingsteknologien på grunn av den høyere feilfrekvensen med IgM enn med IgG-kloner.
2. Før antistoffkonjugering
- Når du identifiserer antistoffkloner for konjugering ved hjelp av multipleksede bildestrekkoder, bør du vurdere å kjøpe bærerfrie antistoffer i fosfatbufret saltvann (PBS) eller en lignende buffer. Bærerproteiner, inkludert BSA, gluten, glyserol og andre proteintilsetninger, er kjent for å redusere konjugasjonskapasiteten.
- Velg den mest passende antistoffklonen, og optimaliser alltid fargeforholdene (dvs. antigeninnhenting og titrering) før konjugering. Gjør dette ved å bruke en ukonjugert antistoffklon til positivt og negativt vev for dette antistoffet ved bruk av standard IF eller IHC.
MERK: Hvis et renset antistoff ikke er kommersielt tilgjengelig, må en antistoffrenseprosess utføres før konjugering. Renseprosedyren som brukes med antistoffrensesett er ikke omtalt her.
3. Antistoff konjugering
- Få antistoffkonjugasjonsreagensene. Kommersielt tilgjengelige konjugasjonssett inneholder en filterblokkerende løsning, reduksjonsløsning 2, konjugasjonsløsning, renseløsning, antistofflagringsløsning (alle lagret ved 4 °C) og reduksjonsløsning 1 (lagret ved -20 °C).
- Bøyning
MERK: Et renset antistoff behandles med et reduksjonsmiddel, slik at de reduserte delene av antistoffet kan reagere med den multipleksede bildestrekkoden som brukes med denne teknologien og dermed danne en kovalent binding. Denne prosessen tar ca. 4,5 timer og resulterer i omtrent 120 μL konjugert antistoff, som er levedyktig i 1 år. All spin-down utføres ved romtemperatur (RT), og gjennomstrømningen kasseres bortsett fra i det aller siste trinnet (3.2.9), hvor et oppsamlingsrør inneholder det konjugerte antistoffet.- Aspirer og påfør 500 μL av filterblokkeringsløsningen ved hjelp av en pipette på filterkolonnene på 50 kDa molekylvekt, og spinn ned ved 12 000 x g i 2 minutter for å blokkere uspesifikk antistoffbinding.
MERK: Hvis gjenværende oppløsning øverst i kolonnen er merkbar, snu filteret i oppsamlingsrøret og spinn ned ved 3000 x g i 2 minutter. - Pipett 50 μg av antistoffet i et volum på 100 μl oppløsning til filterkolonnen, og spinn ned ved 12 000 x g i 8 minutter.
MERK: Bruk et spektrofotometer til å måle konsentrasjonen av det rensede antistoffet og beregne volumet av oppløsning tilsvarende 50 μg av antistoffet. Hvis volumet av antistoffoppløsningen er mindre enn 100 μL, juster volumet til 100 μL ved å tilsette 1x PBS. Behold 1 μg ukonjugert antistoff for bekreftelse av konjugering (trinn 4.4). - Pipette 260 mikrol reduksjonshovedblanding (20 mikrol reduksjonsoppløsning 1 blandet med 825 mikrol reduksjonsoppløsning 2, som er tilstrekkelig for tre antistoffkonjugasjonsreaksjoner) til hver filterkolonne. Virv hovedblandingen forsiktig i 2-3 s, eller pipett opp og ned for å blande oppløsningen med antistoffet. Inkuber ved RT i 30 min.
- Etter inkubering, spinn ned filterkolonnene ved 12 000 x g i 8 minutter. Tilsett 450 μL konjugasjonsløsning til filterkolonnene, og spinn ned ved 12 000 x g i 8 minutter.
- Suspender ønsket strekkode i 10 μL nukleasefritt vann og 210 μL konjugasjonsløsning.
MERK: Forbered en antistoffetikett umiddelbart før bruk for fargingen. Ikke bruk antibody strekkode alikoter. - Etter at spin-down er fullført i trinn 3.2.4, legger du til den resuspenderte antistoffkoden (ca. 220 μL) i hver tilsvarende filterkolonne. Pipetter blandingen forsiktig opp og ned for å blande reagensene. Lukk lokkene til filterkolonnen, og inkuber konjugasjonsreaksjonen ved RT i 2 timer. Etter 2 timer, spinn ned filterkolonnene på 12 000 x g i 8 minutter.
MERKNAD: For bekreftelsesprotokollen anbefales det å sette til side 5 μL av den konjugerte oppløsningen i et polymerasekjedereaksjonsrør og oppbevare den ved 4 °C (se nedenfor). - Pipett 450 mikrol av renseoppløsningen i hver filterkolonne, og sentrifugering ved 12 000 x g i 8 minutter. Gjenta tre ganger.
- Pipett 100 μL av lagringsløsningen inn i filterkolonnene. Pipett blandingen forsiktig opp og ned mer enn 10 ganger, og vask forsiktig sidene av filtrene i kolonnen.
MERK: Løs opp 50 μg antistoff i 100 mikrol av lagringsoppløsningen. Hvis konjugasjonsreaksjonen startes med mer enn 50 μg antistoff, tilsett mer lagringsoppløsning i dette forholdet. - Inverter filterkolonnene i et nytt oppsamlingsrør. Spinn ned ved 3000 x g i 2 min ved RT. Behold den oppsamlede løsningen. Pipetter den konjugerte antistoffoppløsningen inn i sterile skrurør, og oppbevares i opptil 1 år ved 4 °C.
MERK: Et konjugert antistoff bør testes med multiplekset bildebehandlingsteknologi etter 2 dager. Testing før dette kan resultere i høy bakgrunns kjernefysisk farging.
- Aspirer og påfør 500 μL av filterblokkeringsløsningen ved hjelp av en pipette på filterkolonnene på 50 kDa molekylvekt, og spinn ned ved 12 000 x g i 2 minutter for å blokkere uspesifikk antistoffbinding.
4. Bekreftelse av bøyning
MERK: Før du utfører fargeforsøk med et brukerkonjugert antistoff ved bruk av multiplekset bildeteknologi, bør konjugeringen bekreftes ved å bruke gelelektroforese med 5 μL av det konjugerte antistoffet (se trinn 3.2.6) sammen med 1 μg av et ukonjugert antistoff (vanligvis i 2 μL av blandingen) som en kontroll. En vellykket antistoffkonjugering vil bli demonstrert ved en økning i molekylvekten til antistoffet. Imidlertid vurderer denne bekreftelsesprotokollen bare suksessen til den kjemiske reaksjonen for konjugering og adresserer ikke antistoffvalideringen som brukes til multiplekset avbildning.
- Pipette 8 μL og 11 μL nukleasefritt vann inn i henholdsvis det reserverte konjugerte antistoffet og kontrollerer ukonjugert antistoff for å oppnå et endelig volum på 13 μL.
- Pipette 5 μL LDS (eller annet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforesesystem) prøvebuffer og 2 μL prøvereduksjonsmiddel i hver prøve av det reserverte konjugerte antistoffet, og denaturer prøvene i et 95 °C tørt bad i 10 minutter.
- Mens prøvene er denaturerende, fortynn 40 ml MOPS SDS løpende buffer i 760 ml ultrarent vann, legg en gel i tanken til et elektroforesesystem og hell den fortynnede løpebufferen over gelen.
- Når denaturiseringsperioden på 10 minutter er fullført, laster du en brønn av gelen med en forhåndsfarget proteinstandard, en med det ukonjugerte antistoffet (fra trinn 3.2.2), og de resterende brønnene med de konjugerte antistoffprøvene. Kjør deretter gelen på 150 V til proteinstandarden vises på slutten av gelen.
MERK: Gelen fester seg lett til mikrobølgeovnsikre beholdere og kan dermed rive, så gelen må håndteres med forsiktighet i de følgende trinnene. - Etter at løpet er fullført, overfør gelen til en mikrobølgeovnsikker beholder forhåndsfylt med ultrarent vann, og varm den i en mikrobølgeovn til den første boblen i vannet er visualisert.
MERK: Tiden for bobler å danne varierer sterkt avhengig av mikrobølgeovnen som brukes. - Tøm vannet fra beholderen, hell ca. 250 ml Coomassie G-250-flekk over gelen, og varm gelen i en mikrobølgeovn til den første boblen er visualisert. Fjern deretter beholderen med gelen og Coomassie G-250-flekken fra mikrobølgeovnen, og legg den på en shaker i 10 minutter.
- Etter risting, tøm flekken forsiktig, erstatt den med ca. 200 ml ultrarent vann, og legg deretter beholderen på shakeren for å vaske gelen.
- Tøm det ultrarene vannet, og erstatt det med nytt ultrarent vann fem ganger eller til restene av flekken ikke er synlige i vannbadet. La gelen vaskes over natten på shakeren til båndene er synlige, om nødvendig, før du fotograferer gelen (figur 1).
MERK: Antistoffene som brukes i multiplekset avbildning bør ha fargemønstre som er sammenlignbare med fargestoffkonjugerte antistoffer. Vevssnitt med kjente antigener som er positive for konjugerte antistoffer kan farges med oligonukleotidkonjugerte og fargekonjugerte antistoffer. I dette arbeidet, i hvert tilfelle, var vevsmorfologiene for begge antistofftyper ekvivalente og harmoniserte med hverandre, så vel som den forventede cellefordelingen, basert på biologien til proteinene av interesse og testvevsprøvene. Dette resultatet demonstrerer effektiviteten av å bruke oligonukleotid-konjugerte antistoffdeler for vevsfargingsbaserte tilnærminger ved bruk av FFPE-vev.
5. Oligonukleotid-konjugert antistofffarging
- Forbered deksler for plassering av vev.
- Bløtlegg dekslene i en 0,1% poly-L-lysinløsning i 24 timer ved RT for å forbedre vevsadherens.
- Etter bløtlegging, tøm poly-L-lysinoppløsningen og vask dekslene med ultrarent vann i 30 s. Gjenta vasken fire til seks ganger. Fjern dekslene fra det ultrarene vannet som brukes til vask, og legg dem på et lofritt håndkle for å tørke over natten.
MERK: En histolog må kutte det valgte vevet i seksjoner som er 5 μm tykke, plassere dem på midten av et poly-L-lysinladet deksel og la dem tørke over natten. Etter tørking skal dekslene med vevssnittene oppbevares ved 4 °C i høyst 6 måneder. Fargepanelet i denne protokollen inneholdt 26 markører. Vevet som ble brukt i denne protokollen var normalt humant mandelvev. Coverslip sugetiden bør ikke overstige 1 uke. Poly-L-lysinbelagte dekksedler kan oppbevares ved RT og må brukes innen 2 måneder etter tilberedning.
- Dagen før farging plasserer du dekkslipholderen i en ovn på 60 °C over natten.
- Neste dag legger du dekkprøven i en forvarmet dekselholder i en ovn på 60 °C. Etter steking i 30 min, kontroller at parafinen har smeltet bort fra vevet.
- Plasser dekselholderen/prøven raskt i følgende løsningsserie: to runder med smøremiddel i 6 minutter hver; to runder med 100% etanol i 5 min hver; en runde med 90% etanol i 5 minutter; en runde med 70% etanol i 5 minutter; en runde med 50% etanol i 5 minutter; en runde med 30% etanol i 5 minutter; og to runder dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet ultrarent vann i 5 minutter hver.
MERK: Alle fortynninger av etanol fremstilles med DEPC-behandlet ultrarent vann. Hvis xylen brukes til avvoksing, bør den brukes i en hette. - Gjør følgende mens du utsetter dekselholderen/prøven for løsningsserien:
- Forbered et fuktighetskammer ved å plassere en tom pipettespissboks med et vannfuktet papirhåndkle nederst.
- Fyll en trykkoker med nok vann til halvveis å dekke et 50 ml beger.
- Legg 5 ml metanol per prøve i begeret ved 4 °C.
- Fortynn AR9-bufferen med DEPC-behandlet ultrarent vann til 1x; Omtrent 50 ml av den fortynnede bufferen er nødvendig per dekselholder.
- Etter at løsningsserien er fullført, fyll et 50 ml glassbeger med ca. 40 ml 1x AR9-buffer, senk dekselholderen/prøven i begeret og dekk beger-/dekkslipholderen helt med aluminiumsfolie.
- Plasser aluminiumsfoliedekket beger/dekselholder i den vannfylte trykkokeren, og stek ved høyt trykk (ca. 15 psi) i 20 minutter.
- Etter tilberedning, fjern begeret/dekkslipholderen, pakk forsiktig ut aluminiumsfolien og la begeret/coverslipholderen avkjøles ved RT i ca. 10 min.
- Fjern dekselholderen/prøven fra 1x AR9-bufferen, og senk den i to runder med DEPC-behandlet ultrarent vann, og utfør en inkubasjon av prøvene i begge runder i 2 minutter hver.
- Under inkubasjonen, hent hydratiseringsbufferen, blokkeringen N, blokkering G, blokkering av J og blokkering av S-løsninger, og antistofffortynningsmiddelet / blokken fra det multipleksede bildefargingssettet. For to coverslip-prøver, merk 6-brønnsplater for løsningene ved hjelp av konfigurasjonene vist i figur 2.
- Plasser dekselprøven i to runder på 5 ml av hydreringsbufferen i 2 minutter hver.
- Etter begge plasseringsrundene i hydreringsbufferen, plasser dekkslipprøven i 5 ml av det multipleksede bildeantistofffortynningsmiddelet/blokken, og inkuber i 20-30 minutter ved RT (ikke overskrid 30 min).
- Under inkubasjonen, lag en antistoffcocktail ved å lage en 200 μL masterblanding av multiplekset bildeantistofffortynningsmiddel / blokk, N-blokkering, G-blokkering, J-blokkering og S-blokkeringsløsninger.
MERK: Beregn total antistoffmengde basert på antall markører og hver markørs validerte titrering, og trekk den totale antistoffmengden fra masterblandingen. For eksempel, for seks markører, hver med en titrering på 1:200, vil ligningen være 200 μL masterblanding − 6 μL antistoffcocktail = 194 μL masterblanding.
- Etter inkubering i det multipleksede bildeantistofffortynningsmiddelet/blokken, plasser dekkslipprøven i fuktighetskammeret fremstilt i trinn 5.5.1, pipette 190 μL av antistoffcocktailen på dekkprøven, og inkuber dekkslipprøven ved RT i 3 timer.
- Etter inkubering vaskes dekkslipprøven i to runder med 5 ml av det multipleksede bildeantistoffet fortynningsvæske/blokk i 2 minutter hver.
- For å fikse de bundne antistoffene mot vevet på dekselet, utfør trinn 5.7.3-5.7.5 i fuktighetskammeret.
- Inkuber dekslene i 10 minutter med 16% formaldehyd fortynnet til 1,6% med lagringsløsning, og vask deretter dekslene tre ganger med 1x PBS.
- Inkuber dekslene i 5 min med 4 °C metanol, og vask deretter dekslene tre ganger med 1x PBS.
- Inkuber dekslene i 20 minutter med 5 ml av fikseringsreagenset fortynnet med 1x PBS, og vask deretter dekslene tre ganger med 1x PBS.
- Oppbevar de fargede dekkprøvene i lagringsbufferen ved 4 °C i opptil 2 uker
6. Multiplekset bildereporterplate
MERK: En 96-brønnsplate, referert til som en reporterplate, som inneholder strekkodede fluoroforer i individuelle brønner, fremstilles i henhold til spesialdesignede multipleksede bildeeksperimenter og korrelerer med hver farget coverslip-prøve. Følgende trinn er for klargjøring av reporterplaten.
- Forbered en reportermasterblanding ved å kombinere 4,880 μL nukleasefritt vann, 600 μL 10x multiplekset bildebuffer, 500 μL av et analysereagens og 20 μL kjernefysisk flekkløsning. Dette vil være nok for 20 sykluser av alle brønnene.
- I hver syklus av det spesialdesignede multipleksede bildeeksperimentet, fyll en brønn med 245 μL av en løsning som inneholder reportermasterblandingen og de spesifikke strekkodede fluoroforene for den syklusen.
MERK: Se figur 3 for reporterplatekonfigurasjonen som brukes i denne protokollen for et karsinompanel. - For å beskytte de strekkodede fluoroforene, fest et folieplatedeksel over reporterplaten og plasser platen i det multipleksede bildebehandlingsinstrumentet.
- Oppbevar reportertallerkenen i en mørk boks ved 4 °C i opptil 2 uker.
7. Kalibrere og kjøre den multipleksede bildemaskinen
MERK: Det høyoppløselige bildefluorescensmikroskopet fanger fire forskjellige fluorescenskanaler i hver multiplekset bildebehandlingssyklus ved 20x, 100% eksitasjonslys og med lav fotobleking.
- Kalibrer fokuset på avbildningen ved hjelp av DAPI-kanalen ved å plassere et prøvedeksel på mikroskoptrinnet, og pipettere manuelt 700 μL av en 1: 1,500 titrering av nukleær flekkløsning på vevet.
MERK: Dekselet beholdes på mikroskopstadiet under prøvevask og avbildning. - For å klargjøre det multipleksede bildebehandlingsinstrumentet, fortynn 10x multiplekset bildebehandlingsbuffer til 1x ved bruk av DEPC-behandlet ultrarent vann, og fyll reagensflasker med passende løsninger / løsningsmidler, inkludert den fortynnede 1x multipleksede bildebufferen, DEPC-behandlet ultrarent vann og dimetylsulfoksid (DMSO).
- Når reagensflaskene er fylt på riktig måte, skriv inn eksperimentell design i multiplekset bildebehandlingsinstrumentbehandlingsprogramvare; angi riktig syklus, brønnnummer, z-stack-steder, markørnavn, klasse og eksponeringstid for hver syklus (figur 4); sett alle mikroskopparametrene; og velg områdene av interesse på prøveomslaget som skal avbildes.
- Klikk på Eksperiment-knappen i kontrollprogramvaren (figur 4A). I vinduet Oppsett og administrasjon av eksperiment klikker du på Ny mal-knappen (figur 4B).
- Skriv inn prosjektnavnet i feltet ved siden av Prosjekt-knappen (figur 4C). Skriv inn eller velg totalt antall sykluser (figur 4D).
- Klikk på Kanaltilordning-knappen , skriv inn informasjonen for hver syklus i kolonnene (figur 4E), og klikk på Lagre mal-knappen . Start eksperimentet ved å klikke på Start eksperiment-knappen .
MERK: Under et multiplekset bildeeksperiment henter instrumentet de strekkodede fluoroforene fra en brønn på reporterplaten (maksimalt fire fluoroforer per brønn, inkludert DAPI), dispenserer dem direkte på prøvedekselet og avbilder interesseområdene for hver fluorescenskanal. Etter all avbildning for den syklusen, vasker instrumentet de strekkodede fluoroforene av og dispenserer neste syklus av reportere (fra neste brønn på reporterplaten). Avbildningen fortsetter til alle syklusene med 26 markører er fullført.
8. Bildesamling
MERK: Multipleksede bilder kan samles inn ved hjelp av et hvilket som helst tilpasset invertert fluorescensmikroskop konfigurert med fire fluorescenskanaler (DAPI, Cy3, Cy5 og Cy7) og utstyrt med et Plan Fluor 20x-objektiv. Avbildning og vasking av dekkprøvene utføres iterativt automatisk ved hjelp av et spesialutviklet fluidikkoppsett. Bildene er anskaffet ved hjelp av prosessorprogramvare (v1.8.0.7) i QPTIFF-format.
- I prosessorvinduet klikker du på Input-knappen og velger eksperimentnavnet.
- I delen Behandlingsalternativer velger og merker du av for Bakgrunnssubtraksjon, Dekonvolusjon, Utvidet dybdeskarphet og Skyggekorrigering. Klikk på Start-knappen .
9. Bildeanalyse
MERK: De anskaffede bildene kan lastes opp til et patentert automatisert bildeanalyseprogram eller åpen kildekode-program (figur 5) for nedstrømsanalyse.
- Klikk på QuPath-ikonet på datamaskinen, og åpne programvaren. Dra QPTIFF-filen til visningsvinduet .
- Klikk på Lysstyrke & Kontrast-knappen, som åpner vinduet Lysstyrke & Kontrast . Merk av eller fjern merket for markøren i kolonnen Valgt for å vise eller lukke markørsignalet.
- Klikk på Zoom for å tilpasse knappen for å zoome inn eller ut av interesseområdet.
MERK: Multiplekset bildedatavisualisering gir brukeren et dypt innblikk i vevets mikromiljø. Individuelle markører i FFPE-prøver kan visualiseres i fluorescensformat (figur 6 og figur 7) eller i patologivisning. Flere beregningsplattformer kan brukes til å behandle sammensatte bilder og analysere multipleksede vevsbildedata. Ved hjelp av denne programvaren kan romlig fenotyping, samt sjeldne cellefunn og beregning av cellenabolag, oppnås med hellysbildebilder av ultrahøyt multiplekset vev generert via multiplekset bildeteknologi. Se figur 6 for de 26 antistoffene i karsinompanel og tonsilleprøve (tilleggsfigur 1).
Representative Results
Vi brukte FFPE-mandelprøver for å utvikle et 26-markørs immunonkologisk panel for å illustrere immunstatusen til FFPE-vev ved hjelp av et strekkodende bildeanalysesystem. Totalt brukes 19 antistoffer for tiden i andre multipleksede bildebehandlingsstudier i laboratoriet vårt. Alle markørene er testet med FFPE-vev med kromogen IHC. Alle antistoffene ble konjugert til unike DNA-oligonukleotider. Når du setter opp dekksedlene ved hjelp av den nettbaserte instrumentbehandleren (figur 4) for denne strekkodende bildeanalyseteknologien, bør det bemerkes at den første og siste syklusen alltid er "tom" (figur 2 og figur 4), som gir bakgrunnsfluorescenssignalene som skal trekkes fra de spesifikke signalene fra antistoffene. Etter at bilder i QPTIFF-format er samlet inn med fluorescensmikroskopet, kan de visualiseres ved hjelp av flere patenterte automatiserte bildeanalyseprogrammer eller åpen kildekode-programmer. Sammensatte bilder kan vise alle markørene eller de valgte markørene for å få en bedre oversikt over signalene (figur 5). Videre kan hvert antistoff evalueres visuelt for kjernefysisk, cytoplasmatisk eller membranøs lokalisering. Immun-, tumor- og stromale celler kan lett identifiseres. Deretter kan bildeanalyse gi informasjon om signalintensitet, dynamisk område og romlig fordeling av alle markørene (figur 6). Denne teknikken tillot oss å analysere alle 26 markører på subcellulært nivå i en enkelt vevsseksjon (figur 7). Ved å analysere markørenes samlokalisering kunne vi identifisere de cellulære fenotypene, lokalisere den romlige celleposisjonen, beregne avstanden mellom cellene og finne fordelingen av cellene. Den avgjørende effekten av denne teknologien er presentasjonen av et robust 26 markørpanel fokusert på immunstatusen til vevsmikromiljøet.
Figur 1: Bilde av validering av tilpasset konjugert antistoff ved bruk av Bis-Tris proteingel. Lane 1 av gelen viser proteinstandarden. Lane 2 og Lane 4 viser strekkodekonjugerte antistoffer (piler). Lane 3 og Lane 5 viser de tunge og lette kjedebåndene fra et ukonjugert antistoff (pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konfigurasjonskart for fargeplate for to coverslip-prøver. Forkortelser: HB = hydreringsbuffer; B = antistoff fortynningsmiddel/blokk; PSFS = post-farging fiksativ løsning; PBS = fosfatbufret saltvann; MeOH = metanol; S = lagringsløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Konfigurasjon av reporterplate. Hvert konjugert antistoff har en strekkode som er komplementær til en bestemt reporter. For å sette opp reporterplaten, bør hvert konjugert antistoff og tilhørende reporter være oppført. Deretter tildeles hvert antistoff et syklusnummer. Ytelsen til to tomme sykluser (C1 og C18) brukes til å evaluere nivået av autofluorescens i de tre fluorescenskanalene og for post-imaging bakgrunnssubtraksjon ved hjelp av programvaren for bildeoppkjøpskontroll. En programvareveiviser kontrollerer instrumentet på dette stadiet for å sikre at alle innstillingene er riktige (figur 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bildeopptak ved hjelp av kontrollprogramvaren for eksperimentoppsettet. (A) Velg kategorien Eksperiment nederst til venstre i kontrollprogramvaren for å klargjøre og starte oppsettet. (B,C) Velg Ny mal for å angi eksperimentelle innstillinger med et nytt prosjekt- og eksperimentnavn. (D) Endre startsyklusbrønnen og antall sykluser for å gjenspeile reporterens plassering i reporterplaten med 96 brønner. (E) Tilordne de riktige fluorescenskanalene til de fire kanalene som er utpekt for eksperimentell kjøring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bildevisualisering ved hjelp av nettbasert programvare (QuPath). Visningsvinduet viser 26 markører i FFPE-delen med farget mandelvev. Vinduet Lysstyrke og kontrast viser markørene med hakene. Til slutt viser visningsvinduet FFPE-eksemplet med de valgte markørene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bildevisualisering ved hjelp av nettbasert programvare. (A) Tonsillevevseksjoner ble farget for de 26 markørene, og bildene av seksjonene i QPTIFF-format ble visualisert ved hjelp av kommersiell digital lysbildefremvisningsprogramvare eller åpen kildekode-programvare (QuPath) for merknad og gjennomgang. (VG Nett) Seks markører ble vist i samme merknad for å få en bedre oversikt over signalene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Visninger av de 26 individuelle markørene som brukes med nettbasert programvare. Markøruttrykket i tonsillevevet vises via immunfluorescensfarging med et immunonkologisk panel (øverst til venstre). Individuelle markører i to små områder (røde rektangler) vises. Det zoomede innstikket viser celler som er positive for disse markørene (hvite piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sammendrag av arbeidsflyten for multiplekset bildeopptak. FFPE-vevssnitt ble farget med 26 antistoffpanel, etterfulgt av en flersyklusreaksjon. Råbilder av de fargede seksjonene ble beregningsmessig behandlet, og en celletetthet og romlig analyse ble utført ved hjelp av sammensatte bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: IHC-validering i tonsillevev. FFPE-vevssnitt ble farget med et individuelt antistoff. Markøruttrykket i mandelvevet vises ved lav forstørrelse, og den innzoomede innsatsen viser celler som er positive for markøren (røde rektangler). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
TME spiller en viktig rolle i kreftutvikling, progresjon og behandlingsrespons. I tillegg kan tettheten av spesifikke tumorinfiltrerende lymfocyttundergrupper i TME tjene som en prognostisk biomarkør for visse typer kreft. Bemerkelsesverdig, i tillegg til TMEs cellulære sammensetning, kan de romlige egenskapene til en svulst gi en oversikt for å forstå svulstens biologi og identifisere potensielle prognostiske biomarkører12,17.
Siden mange immuncellepopulasjoner er involvert i procancer- eller kreftrespons, vil en bedre forståelse av disse cellene og deres romlige forhold til hverandre og med kreftceller bidra til å identifisere nye immunterapeutiske strategier. Tidligere studier har stratifisert plasseringen og romlig fordeling av TME-celler basert på vevstrukturen i de intratumorale og peritumorale områdene og de invasive marginene til tumorcellene18,19. I løpet av de siste 15 årene har teknologiske fremskritt gjort fenotypisk analyse av individuelle celler basert på deres romlige spredning til et nytt, innflytelsesrikt verktøy for å studere TME og kategorisere potensielle biomarkører for tumorimmunterapi. Multiplex IF histokjemi kan samtidig estimere flere biologiske markører20.
I likhet med oligonukleotid-konjugert antistoffstrategi, brukes fire typer proteinbaserte multiplexplattformer for å studere TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-strekkode- og metallisotopmerkede antistoffdeteksjonssystemer. De kostnadseffektive kromogene IHC-plattformene muliggjør visualisering av hele lysbildet og patologisk vurdering ved bruk av konvensjonell lysfeltmikroskopi. I multiplekset IF og IHC brukes antistoffer konjugert med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-plattformen oppdager antistoffer med høy spesifisitet og kan kvantifisere målrettede antistoffer selv på subcellulært nivå 6,21. I tillegg, på grunn av naturen til kromogener og fluoroforer, kan bruken av ett antistoffpanel fange uttrykket av opptil 10 biomarkører på et enkelt lysbilde. På metallisotopbaserte plattformer brukes metallmerkede antistoffer til å utføre multiplekset avbildning med encelle- og romlig oppløsning, og høy sensitivitet for individuelle vevssnitt22. Teoretisk sett muliggjør disse metallkonjugerte antistofftilnærmingene samtidig påvisning av mer enn 100 biomarkører på en enkelt vevsseksjon. En utfordring med isotopmerkingsteknikken er isobarisk interferens, som forhindrer at 100% renhet av anrikning nås23. Videre øker interferensen etter hvert som antall markører øker. DNA-konjugerte antistoffdeteksjonsplattformer gjenkjenner antistoffer merket med unike DNA-strekkoder. Mer enn 40 biomarkører kan fanges samtidig med høy spesifisitet på disse plattformene6.
Multiplexed imaging er en kommersielt tilgjengelig DNA-strekkodemerket antistoffdeteksjonsplattform for påføring av DNA-konjugerte antistoffer til et enkelt vevslysbilde i ett trinn (figur 8). For vevpreparasjonstrinnet, i motsetning til den multipleksede ionstråleavbildningsplattformen, som krever bruk av gullbelagte lysbilder oppnådd fra produsenter, krever den multipleksede bildebehandlingsplattformen bare vanlige deksler eller lysbilder belagt med 0,1% poly-L-lysin for å hjelpe vevet til å feste seg til det og holde vevet intakt under farge- og avbildningsprosessen. Bruk av vevssnitt på dekksedler innen 4 uker etter snitting anbefales, da langvarig lagring av ufargede lysbilder resulterer i reduksjon av antigenisitet. En farget dekkprøven kan oppbevares i lagringsbuffer ved 4 °C i opptil 2 uker uten å miste fargesignalet. Det kreves ikke noe spesielt utstyr for oppbevaring av dekkprøvene. Det multipleksede bildebehandlingssystemet har blitt oppgradert til å bruke vanlige lysbilder i stedet for dekkslips, noe som muliggjør farging av større vev og enkel håndtering. Ved bruk av en reduksjonsløsning for antistoffkonjugering (trinn 3.2.3), bør reaksjonen begrenses til ikke mer enn 30 minutter for å forhindre skade på antistoffer. Blokkeringsbufferne i trinn 5.6.6 bør tilberedes på nytt, og blokkeringsbufferne må ikke brukes på nytt.
Sammenlignet med kromogen-, fluorescens- og metallisotopmerkede multipleksantistoffdeteksjonsplattformer, har den multipleksede bildeteknologien visse fordeler. For eksempel er mer enn 60 forhåndsdesignede antistoffpaneler for multiplekset avbildning kommersielt tilgjengelige, noe som bidrar til å spare tid og kostnader ved antistoffkonjugering og validering, og antall forhåndsdesignede antistoffpaneler vokser. Disse antistoffene, som inkluderer karsinommarkøren pan-cytokeratin, melanommarkøren SOX10, vaskulær markør CD31, stromalmarkøren SMA og mange immuncellemarkører, er validert og eksperimentklar. For antistoffer som ikke er forhåndsdesignet, er det kommersielt tilgjengelige konjugasjonssettet designet for bruk med multiplekset avbildning grei og brukervennlig. Kundekonjugerte antistoffer er gode i 1 år når de oppbevares ved 4 °C. I tillegg er maskinoppvarming ikke nødvendig for å ta bildene. I denne multipleksede bildeteknologien resulterer de iterative vaske-, hybridiserings- og strippetrinnene i bildeopptaket sjelden i redusert markørintensitet eller degradert vevsmorfologi 5,24,25. Videre er sammensatte bilder tatt i QPTIFF-format med et enkelt trefarget fluorescensmikroskop og kan lastes opp og analyseres ved hjelp av tredjeparts digital analyseprogramvare. Fargemarkørene kan visualiseres ved encelleoppløsning, og cellefenotyper kan karakteriseres ved samlokalisering av markørene (figur 6 og figur 7). Den omfattende analysen av et multiplekset bilde avslører videre vevsrommene, enkeltcellemarkørkvantifisering og nærmeste nabo- og nærhetsdata (figur 8).
En utfordring i multiplekset bildeanalyse er identifisering av celletype. Vanligvis, når flere enkeltobjektklassifiserere brukes på et bilde, vil mer uvanlige fenotyper bli kommentert. Derfor anbefales det å bruke kjente markører som ikke uttrykkes samtidig i samme klassifikator og bare bruke den fenotyperelaterte klassifikatoren til annotasjonen av enkeltceller. Variasjoner i celletypeannotasjon vil resultere i vesentlig forskjellige romlige resultater, for eksempel forskjeller i celleromlig fordeling og cellulær nabolagsanalyse26,27.
Multiplekset bildeanalyse har vist seg å være vellykket i farging og avbildning av mange prøvetyper, inkludert FFPE-vev, ferskt frosset vev, arkiverte hele lysbilder og vevsmikromatriser. Multipleksede bilder av bryst-, hjerne-, lunge-, milt-, nyre-, lymfeknute- og hudvevsseksjoner kan anskaffes med dype enkeltcellede romlige fenotypingsdata 5,16,25,28.
I fremtiden forventes flere forhåndsdesignede antistoffer for multiplekset avbildning. I tillegg er det stort behov for utvikling av spesifikk programvare for multiplekset bildeanalyse. For tiden finnes det mange kommersielt tilgjengelige og åpen kildekode-programmer for Hi-Plex bildeanalyse29, men forskere trenger fortsatt hjelp til å lage en standard arbeidsflyt for disse analysene30,31. Selv om sammensatte bilder tatt med denne protokollen er kompatible med tredjeparts programvare, kan dette føre til ekstra kostnader for brukeren. En annen ulempe med den multipleksede bildebehandlingsteknologien er signalreduksjonen i nukleær proteindeteksjon etter iterativ vasking, hybridisering og stripping med store paneler av antistoffer. Heldigvis kan dette minimeres ved å hente de strekkodede fluoroforene i tidlige sykluser når du designer reporterplatene. Nylig ble denne plattformen oppgradert med et nytt høyhastighets skanningssystem, noe som dramatisk har redusert tiden for å skaffe komposittbilder32. I tillegg har en ny strategi som bruker tyramidkonjugerte strekkoder blitt rapportert for å forbedre oligonukleotid-konjugert antistoff strekkodingsbasert avbildning. Denne teknologien tar sikte på å forsterke fargesignaler der strekkodekonjugerte antistoffer er vanskelig å oppnå33.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Donald R. Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering av denne artikkelen og multiplex IF og bildeanalyselaboratorium ved Institutt for translasjonell molekylær patologi ved MD Anderson. Dette prosjektet ble støttet delvis av Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform ved Institutt for translasjonell molekylær patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center og NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (til MD Anderson Cancer Center CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
| 1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
| Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| Ethanol, 200 proof | |||
| G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
| Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
| Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses. Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).
- Jin, M. Z., Jin, W. L. The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).
- Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
- Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology. Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).
- Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease. Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).
- Phillips, D., et al. Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma. Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).
- Jhaveri, N., et al. Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues. Cancer Research. 82, 3877 (2022).
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Yuan, Y.
- Bruck, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).
- Tsujikawa, T., et al. Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers. Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).
- Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).
- Parra, E. R., et al. Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues. Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).
- Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).
- Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).
- Schurch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).
- Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging. Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).
- Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data. Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999 (2022).
- Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays. Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).
- Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry. Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- DeRosa, J. Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture. Genetic Engineering & Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).
- Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging. Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).
