Summary
Publizierte Daten zu Calcitonin-Gen-Related Peptide (CGRP)-Konzentrationen im menschlichen Plasma sind widersprüchlich. Diese Inkonsistenzen könnten auf das Fehlen einer standardisierten, validierten Methodik zur Quantifizierung dieses Neuropeptids zurückzuführen sein. In dieser Arbeit beschreiben wir ein validiertes ELISA-Protokoll (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) zur Aufreinigung und Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma.
Abstract
Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) ist ein vasoaktives Neuropeptid, das vermutlich eine Rolle in der Pathophysiologie von Migränekopfschmerzen spielt und ein Kandidat für den Biomarkerstatus sein könnte. CGRP wird bei der Aktivierung aus neuronalen Fasern freigesetzt und induziert eine sterile neurogene Entzündung und arterielle Vasodilatation im Gefäßsystem, das eine trigeminale efferente Innervation erhält. Das Vorhandensein von CGRP im peripheren Gefäßsystem hat Untersuchungen zum Nachweis und zur Quantifizierung dieses Neuropeptids im menschlichen Plasma mit Hilfe von Proteom-Assays, wie dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), angeregt. Die Halbwertszeit von 6,9 min und die Variabilität in den technischen Details der Assay-Protokolle, die oft nicht vollständig beschrieben sind, haben jedoch zu inkonsistenten CGRP-ELISA-Daten in der Literatur geführt. In dieser Arbeit wird ein modifiziertes ELISA-Protokoll zur Aufreinigung und Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma vorgestellt. Die Verfahrensschritte umfassen die Probenentnahme und -vorbereitung, die Extraktion mit einem polaren Sorptionsmittel als Reinigungsmittel, zusätzliche Schritte zur Blockierung unspezifischer Bindungen und die Quantifizierung mittels ELISA. Darüber hinaus wurde das Protokoll mit Spike- und Recovery- und Linearitätsexperimenten validiert. Dieses validierte Protokoll kann theoretisch verwendet werden, um CGRP-Konzentrationen im Plasma von Personen mit Migräne, aber auch mit anderen Erkrankungen, bei denen CGRP eine Rolle spielen könnte, zu quantifizieren.
Introduction
Das Calcitonin-Gen-Related Peptide (CGRP) ist ein Neuropeptid mit 37 Aminosäuren, das sowohl in neuronalen Fasern mit perivaskulärer Lokalisation als auch in nicht-neuronalen Geweben vorkommt. Die beiden Formen von CGRP, α- und β-CGRP, haben eine Homologie von mehr als 90 % und gemeinsame physiologische Funktionen. αCGRP kommt jedoch im zentralen und peripheren Nervensystem vor, während βCGRP im enterischen Nervensystem vorkommt 1,2. Bei Nozizeptoraktivierung und kalziumabhängiger Exozytose wird CGRP aus Neuronen freigesetzt, was zu einer sterilen neurogenen Entzündung mit arterieller Vasodilatation und Plasmaproteinextravasation führt 3,4,5,6,7. Von hier aus erscheint CGRP in den postkapillaren Gefäßen und kann ein Biomarker für Krankheiten sein, die eine afferente nozizeptive Aktivierung verursachen, wie z. B. Migräne 8,9,10,11. Bemerkenswert ist, dass CGRP aufgrund seiner Rolle bei der Angiogenese und Immunmodulation auch mit COVID-19 in Verbindung gebracht wird und eine ungünstige Krankheitsentwicklung vorhersagen kann12,13. Daher könnte ein Protokoll zur genauen Quantifizierung von CGRP in menschlichem Plasma einen breiten Wert haben.
Die meiste Aufmerksamkeit wurde vielleicht der Rolle von CGRP bei Migräne geschenkt. Basierend auf präklinischen und klinischen Studien wurde CGRP als möglicher Biomarker für Migräne und als Ziel für die Behandlung vorgeschlagen 3,4,5,6,7,8,9,10. Einige Studien haben eine Erhöhung des CGRP in Kohorten mit episodischer Migräne im Vergleich zu Kontrollteilnehmern festgestellt10,14,15. Der Erfolg von CGRP-Inhibitoren in klinischen Studien zur Behandlung von Migränekopfschmerzen scheint darauf hinzudeuten, dass ein erhöhter CGRP ein ursächlicher Faktor für Migränekopfschmerzen ist. Allerdings haben nicht alle Forscher diese Ergebnisse bestätigt16,17,18,19. Darüber hinaus muss die Rolle von CGRP bei den nicht-kopfschmerzbedingten Symptomen der Migräne noch geklärt werden. Die aktuelle Arbeit wurde durch den Wunsch motiviert, die Rolle von CGRP bei vestibulären Symptomen der Migräne zu verstehen.
Widersprüchliche CGRP-Immunoassay-Daten in der Literatur können mehrere Gründe haben. Erstens beträgt die Halbwertszeit von CGRP in den peripheren Gefäßen 6,9 min 20, was auf die Aktivität der Serinproteasen 21, der insulinabbauenden Enzyme und anderer Metalloproteasen 22, der neutralen Endopeptidasen 23 und des Endothelin-konvertierenden Enzyms-1 24 zurückzuführen ist. Zweitens werden die unterschiedlichen technischen Details der Immunoassays, die zur Quantifizierung von CGRP verwendet werden, in solchen Studien nicht vollständig beschrieben. Schließlich macht die mangelnde Standardisierung der Immunoassay-Methodik das Bild noch komplizierter.
Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes ELISA-Protokoll (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), das die Aufreinigung und genaue Quantifizierung von α- und βCGRP in humanem Plasma ermöglicht. Die Antikörper des Kits sind nicht kreuzreaktiv mit Amylin, Calcitonin oder Substanz P. Dieses Protokoll wurde den notwendigen Validierungsexperimenten unterzogen, wie z. B. Spike und Recovery und Linearität der Verdünnung, deren Daten hier vorgestellt werden. Ein solches CGRP-ELISA-Protokoll, das einer Validierung unterzogen wurde, ist in der Literatur bisher nicht vollständig beschrieben worden. Dieses Protokoll kann zur Quantifizierung von CGRP im menschlichen Plasma im Zusammenhang mit Migräne sowie kardiologisch 2,25, dermatologisch 26, geburtshilflich 27, rheumatologisch28,29, muskuloskelettal 30,31, endokrin 32,33 und Viruserkrankungen 12,13 verwendet werden, an denen CGRP beteiligt ist.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde unter Verwendung menschlicher Plasmaproben von Personen entwickelt, die mit Genehmigung des Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491) ausgewählt wurden.
1. Probenentnahme und -vorbereitung
- Sammeln Sie 5 ml Vollblut aus der Vena antecubitalis über Standard-Venenpunktionsmethoden34 in ein 6-ml-Vacutainer-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Sammelröhrchen.
- Nach der Entnahme werden 0,5 ml Aprotinin (10.000 KIU/ml) kompetitiver Serinprotease-Inhibitor in das Röhrchen gegeben, um die Lyse des Zielpeptids zu blockieren. Drehen Sie den Schlauch 10 Mal um, damit sich das Aprotinin ausreichend mit dem Blut vermischen kann. Lagern Sie die Röhrchen anschließend bis zum nächsten Schritt auf Eis.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 604 x g für 4 min bei 4 °C innerhalb von 60 min nach der Blutentnahme.
- Die Plasmafraktion wird mit einer Pipette entnommen und in sterile Kryoflaschen mit rundem Boden von 2 ml überführt.
- Lagern Sie die Kryoflaschen sofort bei -80 °C für bis zu 2 Wochen.
2. Extraktion der Plasmaproben
- Setzen Sie eine Extraktionskartusche in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen ein, wobei die äußeren Rippen der Kartusche von den äußeren Rippen des Röhrchens gestützt werden.
- Aktivieren Sie die Kartusche, indem Sie zuerst 5 ml 100%iges Methanol und dann 10 ml Reinstwasser durch die Kartusche leiten.
- Wenn die Flüssigkeit durch die Kartusche durch die Schwerkraft geleitet wird, sammelt sie sich im Rohr.
- Schütten Sie überschüssige Flüssigkeit aus, wenn sie sich ansammelt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit die Kartusche nicht verschlingt.
- Stellen Sie sicher, dass die Kartusche während des Experiments nicht austrocknet.
- 250 μl Plasma mit 750 μl 4%iger Essigsäure verdünnen.
- 1 ml Plasma und Essigsäurelösung langsam durch die Kartusche geben.
Anmerkungen: Dieser Schritt sollte für jeden durchgelassenen Milliliter ca. 30 s dauern . - Waschen Sie die Kartusche mit 10 ml 4%iger Essigsäure. Werfen Sie wie zuvor die überschüssige Flüssigkeit weg, wenn sie sich ansammelt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit die Kartusche nicht verschlingt.
- Nachdem der letzte Tropfen Essigsäure aus der Kartusche abgelassen wurde, nehmen Sie die Kartusche aus dem Röhrchen und legen Sie sie in ein neues konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Bereiten Sie eine 10:1-Lösung aus 100 % Methanol und 4 % Essigsäure vor, indem Sie 2,7 ml 4 % Essigsäure und 0,3 ml 100 % Methanol mischen. Verwenden Sie dies, um das CGRP zu eluieren, indem Sie diese Lösung jeweils 1 ml durch die Kartusche leiten. Zwischen jedem Milliliter der ausgetretenen Lösung eine Pause von 25 Minuten einlegen. Werfen Sie den Eluenten NICHT weg.
- Das Röhrchen enthält 3 ml der eluierten Flüssigkeit 25 Minuten, nachdem der letzte Milliliter der Methanol- und Essigsäurelösung abgelaufen ist. Geben Sie jeweils 1 ml des Eluenten in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Dies sollte drei Mikrozentrifugenröhrchen aus jeder Kartusche ergeben. - Legen Sie jedes Röhrchen für 1 s in eine Minizentrifuge, um sicherzustellen, dass sich der gesamte Eluent am Boden jedes Röhrchens befindet.
- Trocknen Sie alle Proben durch Vakuumzentrifugation bei 4 °C (bei wässrigen Lösungen auf Konzentratorfunktion bei 1.400 U/min; die g-Kraft variiert je nach Position der Röhrchen und liegt daher zwischen 130 und 250 x g).
HINWEIS: Die Zeit, die die Vakuumzentrifuge zum Trocknen der Proben benötigt, hängt von der Art des verwendeten Mikrozentrifugenröhrchens ab. - Unmittelbar vor dem Fortfahren mit dem Assay-Verfahren (Schritt 4.1) wird die zuvor getrocknete Probe mit einem auf Raumtemperatur (RT) oder 20 °C aufgetauten Enzymimmunoassay-Puffer (EIA) (siehe Materialtabelle) rekonstituiert.
Anmerkungen: Das Volumen des EIA-Puffers, der zur Rekonstitution der getrockneten Probe verwendet wird, sollte dem ursprünglichen Probenvolumen oder 250 μl entsprechen.
3. Vorbereitung der ELISA-Platte - Blockierung zur Begrenzung der unspezifischen Bindung
- Geben Sie 250 μl Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)/Fischgelatine-Blockierungspuffer in jede Vertiefung auf der Platte.
- Ein Deckblatt über die Platte legen und 2 h bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie das Deckblatt und entleeren Sie die Platte durch Inversion oder Aspiration mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie dann den Teller auf ein Papiertuch, um alle Spuren von Flüssigkeit zu entfernen.
- Trocknen Sie die Platte, indem Sie die Platte 10 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube belassen.
- Nachdem die Platte sichtbar trocken ist, legen Sie sie in einen griffversiegelten Folienbeutel mit einem Kieselgel-Trockenmittelbeutel und lagern Sie den Beutel 24 h bei -20 °C.
Anmerkungen: Die Platten sollten innerhalb von 4 Wochen nach der Inkubation der Platten verwendet werden.
4. Vor dem Testverfahren
- Bereiten Sie die Reagenzien (EIA-Puffer, CGRP-Standard, CGRP-Qualitätskontrolle, CGRP-Tracer, Waschpuffer) gemäß den Anweisungen des Kits vor. Bereiten Sie das Ellman-Reagenz erst nach Ablauf der Inkubationszeit von 16-20 Stunden vor.
- Tauen Sie alle Proben und Reagenzien auf RT auf, bevor Sie den Rest des Protokolls durchführen.
5. Ablauf des Assays
- Spülen Sie jede Vertiefung fünfmal in der verstopften Platte mit einem im Kit enthaltenen Waschpuffer (300 μL/Well). Halten Sie für jede Spülung 30 Sekunden an, nachdem Sie den Waschpuffer in die Vertiefungen gegeben haben, und schütten Sie dann die Flüssigkeit aus oder saugen Sie sie mit einer Mehrkanalpipette ab.
- Entfernen Sie nach der letzten Spülung den gesamten Puffer aus den Vertiefungen durch Inversion (Umdrehen der Platte, um die Flüssigkeit in den Vertiefungen auszustoßen) oder durch Absaugen mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie die letzten Tropfen auf ein Papiertuch und klopfen Sie auf die umgedrehte Platte, bis die gesamte Flüssigkeit sichtbar aus den Vertiefungen entfernt ist.
- Stellen Sie mindestens zwei Vertiefungen ohne Reagenzien oder Puffer beiseite, die als "leere" Vertiefungen bezeichnet werden. Legen Sie dann mindestens zwei weitere Vertiefungen für die unspezifische Bindung (NSB) beiseite.
- Geben Sie 100 μl EIA-Puffer in jede NSB-Vertiefung.
- Geben Sie 100 μl der CGRP-Standards in zweifacher Ausführung in geeignete Vertiefungen ab.
- 100 μl Proben (rekonstituiert im EIA-Puffer) und Qualitätskontrolle in doppelter Ausführung in geeignete Vertiefungen dosieren.
- Geben Sie 100 μl CGRP-Tracer (Anti-CGRP-Antikörper, der an die Acetylcholinesterase gebunden ist) in jede Vertiefung, die NSB, CGRP-Standards, Proben und Qualitätskontrollen enthält. Geben Sie Tracer nicht in die "Blank"-Vertiefungen ab.
- Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Deckfolie ab und versiegeln Sie jede Vertiefung so, dass die Proben und Reagenzien in jeder Vertiefung nicht wesentlich verdunsten. Die Platte 16-20 h bei 4 °C inkubieren.
- Rekonstituieren Sie nach Abschluss der Inkubation das Ellman-Reagenz gemäß den Anweisungen des Kits.
- Drehen Sie die Platte um, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Spülen Sie jede Vertiefung (wie oben beschrieben) dreimal mit 300 μl Waschpuffer aus.
- Entfernen Sie nach dem dritten Spülgang die Flüssigkeit von den Tellern, legen Sie die Platte auf eine Schüttelplatte und schütteln Sie sie 2 Minuten lang bei 120 U/min.
- Waschen Sie den Teller weitere dreimal. Entfernen Sie nach der letzten Spülung den gesamten Puffer aus den Vertiefungen durch Inversion oder Aspiration mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie die letzten Tropfen Flüssigkeit auf ein Papiertuch und klopfen Sie auf die umgedrehte Platte, bis die gesamte Flüssigkeit sichtbar aus den Vertiefungen entfernt ist.
HINWEIS: Die zusätzlichen drei Waschgänge, die in diesem Schritt beschrieben werden, sind möglicherweise nicht erforderlich, wenn Sie einen ELISA-Mikrotiterplatten-Washer verwenden. - Geben Sie 200 μl des Ellman-Reagenzes in jede Vertiefung (ohne die "leeren" Vertiefungen).
- Decken Sie die Platte mit einem neuen Abdeckblech ab und wickeln Sie sie in Alufolie ein, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei RT für 1 h.
- Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeit auf der Rückseite der Platte befindet, die den Messwert des Spektralphotometers verfälschen könnte, indem Sie die Rückseite mit einem trockenen Papiertuch abwischen.
- Lesen Sie die Platte für die Absorption bei 405 nm (gelbe Farbe) ab.
6. Datenanalyse
- Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption für jede "Leer-", NSB-, Standard-, Qualitätskontrolle und die Proben.
- Subtrahieren Sie die durchschnittlichen NSB-Absorptionswerte von den Standard-, Qualitätskontroll- und Probenabsorptionswerten.
- Zeichnen Sie die Absorption auf der y-Achse und die Konzentration auf der x-Achse auf. Konstruieren Sie eine Standardkurve mithilfe eines logistischen Regressionsmodells mit vier Parametern.
- Sobald die Kurve konstruiert ist, verwenden Sie die Gleichung der Kurve, um die interpolierten Konzentrationen für die Qualitätskontrolle und die Proben zu bestimmen, die auf der x-Achse abgelesen werden können.
HINWEIS: Die Standardkurve wird nur validiert, wenn die berechnete interpolierte Konzentration für die Qualitätskontrolle innerhalb von 25 % der erwarteten Konzentration liegt (normalerweise 125 pg/ml, siehe Etikett des Qualitätskontrollfläschchens).
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Representative Results
Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, die hervorgehoben werden sollten. Erstens muss Aprotinin, ein Serinproteasehemmer, den Vollblutproben sofort nach der Entnahme zugesetzt werden, um einen weiteren enzymatischen Abbau von CGRP zu verhindern. Es wurde gezeigt, dass Serinproteasen eine Rolle im CGRP-Stoffwechsel spielen, und in einer früheren Studie wurde auch Aprotinin zur Quantifizierung von CGRP beim Menschen verwendet21,35. Wenn keine Proteasehemmer verwendet werden und die Probenvorbereitung länger als 60 Minuten dauert, kann man bei der Durchführung von ELISA mit erniedrigten CGRP-Spiegeln rechnen. Zweitens konzentriert die Festphasenextraktion vor dem ELISA CGRP im Eluenten und eliminiert potenziell störende Moleküle aus der Plasmamatrix. Dieser Extraktionsschritt erhöht die Ausbeute an CGRP in Spike- und Recovery-Experimenten (weitere Erläuterungen im nächsten Abschnitt). Die Vakuumzentrifugation in einem Kühlraum nach der Extraktion begrenzt den Verlust von CGRP weiter. Drittens müssen die Mikrotiterplatten vor dem ELISA mit einem Blockierpuffer blockiert werden. Dies ermöglicht die passive Adsorption unspezifischer Proteine im Puffer an die verbleibenden Bindungsstellen in den Platten, wodurch das Hintergrundsignal reduziert wird. Das Blockieren trägt dazu bei, unrealistisch hohe CGRP-Erträge zu reduzieren.
Spike- und Wiederfindungsexperimente bestimmen, ob die CGRP-Detektion durch die Unterschiede zwischen dem Standardkurvenverdünnungsmittel (hier EIA-Puffer) und der experimentellen Probenmatrix (hier Plasma) beeinflusst wird. Plasma und/oder Serum können Moleküle enthalten, die die Bindung von Antikörpern an CGRP blockieren oder das Peptid abbauen, wodurch die Fähigkeit des Assays, die Ausgangskonzentration von CGRP genau zu erkennen und zu quantifizieren, beeinträchtigt wird. Zu diesem Zweck fügten wir bekannte Mengen an CGRP zu Plasmaproben hinzu - der "Spiking"-Schritt - und berechneten, wie viel CGRP nach Extraktion und ELISA "gewonnen" wurde. Der CGRP-Vorrat wurde vom Hersteller bezogen und bis zur Verwendung in einem -20 °C Gefrierschrank gelagert.
Bei der Linearitätsprüfung der Verdünnung wird eine Probe seriell verdünnt, und für jede Verdünnung werden die CGRP-Konzentrationen berechnet. Wenn die verdünnten Proben keine angemessenen linearen Abnahmen der CGRP-Konzentration aufweisen, würde dies darauf hindeuten, dass der UVP-Puffer oder das Plasma den Nachweis von CGRP bei bestimmten Konzentrationen beeinträchtigt oder dass die Standardkurve in dem betroffenen Bereich nicht genau ist. Bei der Durchführung des oben beschriebenen Spike- und Recovery-Experiments haben wir die "Spike"-Proben seriell verdünnt; Wir versetzten eine Plasmaprobe auf eine CGRP-Konzentration von 200 pg/ml und verdünnten die Probe anschließend auf 100 pg/ml und dann auf 50 pg/ml.
Plasmaproben von drei Teilnehmern, die in der Vorgeschichte keine kardiovaskulären, respiratorischen oder kürzlich aufgetretenen Kopfschmerzen oder neurologischen Symptome hatten, wurden mit unterschiedlichen CGRP-Konzentrationen versetzt. Das Protokoll wurde für diese Proben zusätzlich zu den Kontrollproben ohne Spikes durchgeführt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Plattenkarte für Spike und Erholung sowie Linearität von Verdünnungsexperimenten. Es wurde eine logistische Anpassung mit vier Parametern durchgeführt, um eine Standardkurve zu erstellen, die eine Anpassung über den linearen Bereich hinaus ermöglichte (Tabelle 1 und Abbildung 2). Die Wiederfindungsraten wurden für jede Probe mit Spitzen berechnet und lagen innerhalb des akzeptablen Bereichs (Tabelle 2). Die Linearität der Verdünnung wurde in den Proben mit Spikes demonstriert (Abbildung 3). Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse eines erfolglosen Spike- und Recovery-Experiments, das gemäß den Anweisungen des Herstellers und vor der Aufnahme der zusätzlichen Schritte zum Blockieren der unspezifischen Bindung durchgeführt wurde. Diese Daten zeigen Wiederfindungsraten, die die Obergrenze von 125 % überschreiten, was auf das Vorhandensein einer unspezifischen Bindung hinweist. Nachdem wir die Schritte im Protokoll hinzugefügt hatten, um die Platte mit einem Blockierungspuffer zu blockieren (Schritte 3.1-3.5), konnten wir diesen Effekt reduzieren und akzeptable Wiederherstellungswerte erzielen (Tabelle 2). Bei drei Patienten ohne Migräne oder vestibuläre Symptome fanden wir eine durchschnittliche CGRP-Konzentration im Plasma von 1,68 ± 0,13 pg/ml. Zukünftige Experimente sollten darauf abzielen, die derzeitige Methodik in einem größeren Maßstab von Kontrollpatienten anzuwenden.
Abbildung 1: Beispiel für eine Plattenkarte. Jede Platte sollte Standards, Proben, Leerproben und NSB-Wells enthalten, alle in doppelter oder dreifacher Form. Blank-Wells sollten keine Flüssigkeit enthalten, und NSB-Wells sollten proprietären Enzym-Immunoassay-Puffer, enzymgebundene Sekundärantikörper und Ellman-Reagenz enthalten. Die durchschnittlichen Absorptionswerte für die NSB-Bohrungen sollten vor der Erstellung der Standardkurve von den Absorptionswerten des Standards subtrahiert werden. Die durchschnittlichen Absorptionswerte für die NSB-Bohrungen sollten ebenfalls von den Absorptionswerten der Proben subtrahiert werden, bevor der prozentuale Anteil der Gewinnungsrate berechnet wird. Es gibt keinen Einfluss auf die Plattenposition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiel für eine logistische Regressionsstandardkurve mit vier Parametern (4PL). Diese Standardkurve wird mathematisch durch eine Gleichung beschrieben, die in ähnlicher Form wie in Tabelle 1 dargestellt ist. Eine 4PL-Regressionskurve ist im Vergleich zu linearen Kurven besser an biologische Systeme angepasst. Diese Kurve und Gleichung werden verwendet, um Qualitätskontrollen und Proben auf derselben Platte zu interpolieren, auf der die Norm erstellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Linearitätsdiagramm der Verdünnungslinie mit Proben, die mit 200 pg/ml versetzt und dann seriell 1:2 und 1:4 verdünnt wurden. Diese Daten zeigen die Linearität über einen weiten Verdünnungsbereich, was darauf hindeutet, dass die Analysemethode über einen weiten Bereich von CGRP-Konzentrationen genau ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Parameter | Wert |
| X50 | 294.75 |
| Gleichung |  |
| Form der Gleichung |  |
Tabelle 1: Beispiel für eine logistische Regressionsgleichung mit vier Parametern (4PL) und den Titern X50. Eine 4PL-Regressionskurve trägt der Komplexität biologischer Systeme Rechnung. Diese Kurve wurde verwendet, um die Ergebnisse des ELISA zu analysieren, da sie besser geeignet ist als die lineare Regression.
| Absorption (OD) | Interpolierte Konzentration (pg/ml) | Prozentuale Ausbeute | |
| Steuerung ohne Spikes | -0.0434 | Fällt nicht auf die Kurve (dh ~0) | |
| Erhöht auf 200 pg/ml | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Erhöht auf 100 pg/ml | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Erhöht auf 50 pg/ml | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabelle 2: Ergebnisse eines erfolgreichen Spike- und Recovery-Experiments von drei Kontrollteilnehmern aufgrund fehlender Festphasenextraktion und Plattenblockierung. Der prozentuale Anteil der Ausbeute für Proben mit Spikes lag alle innerhalb von 20 % der idealen Ausbeute von 100 %, was darauf hindeutet, dass die CGRP-Detektion nicht durch die experimentelle Probenmatrix des Plasmas beeinflusst wird.
| Absorption (OD) | Interpolierte Konzentration (pg/ml) | Prozentuale Ausbeute | |
| Steuerung ohne Spikes | -0.2087 | Fällt nicht auf die Kurve (dh ~0) | |
| Erhöht auf 200 pg/ml | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Erhöht auf 100 pg/ml | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Erhöht auf 50 pg/ml | 0.3218 | 80.55 ± 4.54 | 161.10% |
Tabelle 3: Ergebnisse eines erfolglosen Spike- und Recovery-Experiments von drei Kontrollteilnehmern aufgrund fehlender Plattenblockierung. Der prozentuale Anteil der Ausbeute für Proben mit Spitzen lag deutlich über der Obergrenze von 120 %, was darauf hindeutet, dass der Assay durch NSB verfälscht sein könnte. Nachdem wir diese Ergebnisse erhalten hatten, fügten wir dem Protokoll die Schritte 3.1-3.5 hinzu, um NSB auf der Platte vor dem Assay zu blockieren.
| Absorption (OD) | Interpolierte Konzentration (pg/ml) | Prozentuale Ausbeute | |
| Steuerung ohne Spikes | 0.0401 | 12.93 | |
| Erhöht auf 100 pg/ml | 0.0315 | 10.17±2.31 Uhr | 10.17% |
| Erhöht auf 50 pg/ml | 0.0152 | 4.895±15,4 | 9.79% |
| Erhöht auf 25 pg/ml | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabelle 4: Ergebnisse eines erfolglosen Spike- und Recovery-Experiments von drei Kontrollteilnehmern. Der prozentuale Anteil der Ausbeute für Proben mit Spikes fiel alle deutlich unter die untere Grenze von 80 % Ausbeute, was darauf hindeutet, dass weitere Optimierungen erforderlich waren, um mögliche Degradations- und Wettbewerbsbindungsprozesse zu berücksichtigen. Diese Ergebnisse stammen aus dem wettbewerbsfähigen ELISA-Assay eines anderen Herstellers mit einer unteren Nachweisgrenze von 2,23 pg/ml und einem Intra-Assay-CV < 10 % und einem Inter-Assay-CV < 12 %.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt ein validiertes Protokoll, das den Nachweis und die Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma ermöglicht. Dieses Protokoll wurde synthetisiert, nachdem sich herausgestellt hatte, dass kommerzielle CGRP-ELISA-Kits dieses Molekül nicht genau quantifizieren konnten. Nach der Erstellung eines Probenvorbereitungsprotokolls und einer gültigen Standardkurve zeigten die Experimente zur Spitzen- und Ausbeute sowie zur Linearität der Verdünnung, dass der Prozentsatz der Gewinnungsraten viel geringer war als erwartet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem anderen kommerziellen CGRP-ELISA-Kit gefunden (Tabelle 4). Zum Vergleich: Die weithin akzeptierte Standardrückgewinnung liegt bei 80-120 %36. Diese Ergebnisse könnten auf das Vorhandensein von Proteaseaktivität hindeuten, die CGRP21,22,23,24 und andere Moleküle abbaut, die an CGRP binden, wodurch seine Verfügbarkeit für die Bindung an die Antikörper der Platte oder die kompetitive Bindung von Nicht-Zielproteinen an die Antikörper der Platte eingeschränkt wird.
Um diese möglichen Störfaktoren zu kontrollieren, wurde ein Extraktionsprotokoll optimiert, um das Plasma durch Extraktion mit einem proprietären Sorptionsmittel vor dem ELISA zu reinigen. Dieses Sorptionsmittel isoliert angeblich polare Moleküle wie CGRP. Um die Wirksamkeit der Extraktion vor dem ELISA zu bestimmen, wurden humane Plasmaproben mit bekannten CGRP-Konzentrationen als Positivkontrollen extrahiert und anschließend ELISA extrahiert. Diese mit Stacheln versehenen Proben ergaben nur eine Ausbeute von ~50%-60%. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass exogen zugesetztes CGRP nicht im Plasma nachgewiesen wird, wie man erwarten würde.
Verschiedene andere Schritte des Protokolls wurden optimiert: die Zugabe von Serinprotease-Inhibitor zu Vollblutproben vor der Zentrifugation, um den Abbauzu hemmen 21, die Absenkung der Temperatur der Vakuumzentrifugation nach der Extraktion und die Anpassung der Resuspensionsmethoden nach der Zentrifugation. Ein Spike- und Recovery-Experiment nach diesen Veränderungen ergab unrealistisch hohe CGRP-Konzentrationen, eine Ausbeute von mehr als 120 % (Tabelle 3). Beruhigenderweise wurden kürzlich auch nach der Extraktion mit einem ähnlichen Assay von Messlinger et al.37 höhere Werte als erwartet gemeldet, was darauf hindeutet, dass dies nach wie vor ein Problem darstellt. Messlinger et al. räumen ein, dass der Assay nach der Plasmaextraktion keine realistischen CGRP-Konzentrationen reproduziert, ohne einen Grund für dieses Phänomen anzugeben37.
Wir stellten die Hypothese auf, dass die verbleibende Bindungskapazität auf den ELISA-Mikrotiterplatten, die eine unspezifische Bindung verursacht, für die hohen Wiederfindungsraten verantwortlich sein könnte. Vor ELISA wurde die Platte mit einem Blockierungspuffer, TBS/Fischgelatinepuffer, inkubiert, um diese Bindungskapazität zu reduzieren. Dieser zusätzliche Schritt führte zu angemesseneren Rückgewinnungsraten (Tabelle 2). Daher bleiben die oben besprochenen Modifikationen und Optimierungen, einschließlich der Verwendung des Blockierungspuffers, kritische Schritte im Protokoll. Diese Schritte haben eine untere Nachweisgrenze von 1,05 pg/ml ermöglicht, verglichen mit der des Kits des Originalherstellers, das mit 2 pg/ml angegeben ist.
In Bezug auf die Fehlerbehebung erfordert Schritt 2.10 eine Vakuumzentrifugation, um den Eluenten zu trocknen. Es wurde beobachtet, dass die Länge dieses Schritts je nach Art des Mikrozentrifugenröhrchens, in dem sich die Proben befinden, variiert. Bei Verwendung der in der Materialtabelle beschriebenen Mikrozentrifugenröhrchen dauert dieser Schritt in der Regel 5 h. Bei Verwendung alternativer Mikrozentrifugenröhrchen mit größeren Volumina kann dieser Schritt jedoch bis zu 11 Stunden dauern. Eine Alternative zur Vakuumzentrifugation kann die Gefriertrocknung der Proben sein, bei der die Proben nach der Extraktion eingefroren werden müssen. Die Gefriertrocknung wurde bei der Erstellung dieses Protokolls jedoch nicht getestet. Wenn systematisch niedrigere als erwartete CGRP-Konzentrationen gefunden werden, sollte außerdem sichergestellt werden, dass alle Reagenzien, insbesondere die Antikörper, vor der Verwendung auf Raumtemperatur aufgetaut werden. Die Instabilität der Reagenzien, wie z. B. der Antikörper- und Tracerlösungen, könnte zu systematischen Fehlern bei der Bindung von CGRP beitragen. Wenn die Ausbeute weiterhin unzureichend ist, kann die Bindung der Antikörper an CGRP trotz Rekonstitution mit einem Puffer durch den relativen Säuregehalt des Eluenten (Methanol und Essigsäurelösung) beeinflusst werden. In diesem Fall wäre ein pH-Rektifikationsschritt nach der Rekonstitution mit Puffer eine logische Ergänzung.
Zu den Einschränkungen dieses Protokolls gehören die Einschränkungen, die mit jeder ELISA-Methodik verbunden sind, insbesondere die Instabilität von Antikörpern38. Antikörperreagenzien müssen vor der Verwendung im Assay auf Raumtemperatur aufgetaut werden. Eine Erwärmung über einen längeren Zeitraum kann jedoch zu einer Denaturierung und folglich zu einer verringerten Wirksamkeit bei der Bindung von CGRP führen. Darüber hinaus kann CGRP durch eine Vielzahl von Nicht-Serin-Proteasen abgebaut werden, was zu vermehrt falsch negativen Ergebnissen führt. Obwohl dieses Protokoll den Abbau durch Zugabe einer Serinprotease und die Begrenzung der Probenverarbeitungszeit auf weniger als 60 Minuten begrenzt, kann es dennoch zu einem Abbau kommen. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen von getesteten Frost-Tau-Zyklen. Lee et al.39 zeigten, dass Gefrier-Auftau-Zyklen die Serum- und Plasmaproteinmengen je nach Empfindlichkeit des Proteins erhöhen oder verringern können. Die Anfälligkeit von CGRP für Gefrier-Tau-Zyklen wurde in der Literatur nicht vollständig getestet, obwohl Messlinger et al. festgestellt haben, dass die CGRP-Spiegel nach einem Zyklus des Einfrierens und Auftauens abnehmen37. Darüber hinaus kann die Ausbeute dieses Protokolls von der Verwendung von Protein-LoBind-Röhrchen profitieren, die mit einer hydrophilen Oberfläche ausgestattet sind und so zu einer verbesserten Proteinrückgewinnung führen.
Wir stellen fest, dass diese Validierungsexperimente anscheinend nicht von Autoren neuerer Studien zur Quantifizierung von CGRP im menschlichen Plasma durchgeführt wurden 16,18,35,40,41. Eine Überprüfung der ELISA-Methodik von Messlinger et al.37 betont die Notwendigkeit solcher Kontrollen und stellt Studien in Frage, die sie nicht verwendet haben. Wir glauben, dass unsere Arbeit an der Validierung und Standardisierung eines Protokolls die zukünftige CGRP-Forschung auf eine bessere Grundlage stellen wird. Die Implikationen eines solchen Protokolls sind weitreichend und können theoretisch auf die Untersuchung des Biomarkerstatus von CGRP in neurologischen und nicht-neurologischen Krankheitsprozessen ausgeweitet werden 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
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Disclosures
Die Autoren haben keine weiteren Angaben hinzuzufügen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Robert N. Cole, Lauren R. DeVine und Marcos Iglesias für ihre hilfreichen Diskussionen zu diesem Protokoll. Dies wurde zum Teil durch Mittel der American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), der American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) und des National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), einer Komponente der National Institutes of Health (NIH), und der NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF) unterstützt. Der Inhalt der Veröffentlichung liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des Johns Hopkins ICTR, NCATS oder NIH dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
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