Sinapsi Presynaptically silenzioso studiato con microscopia ottica

Alcuni terminali presinaptici nel sistema nervoso centrale appaiono non funzionali o silenti. Qui presentiamo un protocollo per l'identificazione dei terminali presinaptici silenti. Questo protocollo può essere applicato all'identificazione di trattamenti e manipolazioni sospettati di silenziamento o risveglio dei terminali.

Il protocollo combina la marcatura del colorante vitale delle vescicole sinaptiche durante la depolarizzazione neuronale con la successiva marcatura delle cellule fissate con un anticorpo che etichetta tutti i terminali presinaptici, sia silenti che attivi. Sinapsi. Co marcato con colorante e anticorpi sono attivi. Le sinapsi marcate solo da anticorpi sono silenti.

Ciao, sono Amanda Taylor del laboratorio del Dr.Steve Minick nel Dipartimento di Psichiatria della Washington University School of Medicine. Sono Shahin, anch'io del Manic Lab. Oggi vorremmo mostrarvi la vostra procedura per visualizzare i terminali presinaptici silenti utilizzando neuroni ippocampali in coltura.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come l'attività elettrica e le altre singole vie di noling modulano il rilascio di neurotrasmettitori. Quindi iniziamo. In una cappa sterile a flusso laminare, l'uso HIPA non può acquistare dal giorno zero postnatale a tre ratti o topi per preparare colture cellulari dissociate.

Secondo il nostro protocollo pubblicato, le nostre colture sono misti gliali Le colture derivate dalle stesse cellule di dissezione devono essere piastrate in piastre sterili da 35 millimetri. Ciascuno contenente un vetrino coprioggetti numero zero rivestito con cinque milligrammi per millilitro di piastra di collagene. I neuroni a una densità approssimativa di 500 cellule per centimetro quadrato.

12 cuccioli di ratto produrranno in genere 30 piatti da 35 millimetri. Lascia che le colture crescano in un incubatore di colture per 10-14 giorni. Per lo sviluppo e la maturazione sinaptica, aggiungere l'anti-mitotico a C per arrestare la crescita gliale al quarto giorno in vitro.

Sempre al quinto giorno in vitro, eseguire uno scambio mezzo medio con l'integratore neuro basal medium plus B 27 per migliorare la sopravvivenza neuronale durante questo periodo di maturazione. Introdurre trattamenti che alterano il numero di sinapsi presinapticamente silenti. Troviamo che un modo conveniente per silenziare una grande percentuale di sinapsi di glutammato è un trattamento di quattro ore con 30 millimolari di potassio.

Quando le colture sono mature, i neuroni dovrebbero avere una densità relativamente bassa con processi nevrotici ben separati ed estesi. Togliete le colture dall'incubatrice e portatele sul banco. Sostituire il terreno di coltura con una soluzione salina tamponata contenente 45 millimolari di cloruro di potassio e 10 monconi micromolari FM 1 43 FX.

Questa soluzione dovrebbe contenere anche NBQX e A PV per evitare segnali ricorrenti. È importante che la soluzione madre FM 1 43 FX e gli esperimenti siano tenuti al buio per prevenire il fotosbiancamento. Quindi copri i piatti di coltura con un foglio di alluminio per tutte le successive fasi di incubazione.

Incubare per due minuti esatti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione colorante e lavare per soli tre-cinque secondi in cumuli di soluzione salina tamponata con 500 avversa micromolare. Sette. Per rimuovere i tempi di tintura non specifici in questo passaggio è fondamentale.

Poiché l'esposizione prolungata a F sette avversi rimuoverà tutta l'etichettatura FM 43 FX. Quindi lavare le celle e accumulare soluzione salina tamponata senza avversità. Sette per cinque intervalli di due minuti in una cappa chimica.

Fissare le colture in 4% di paraldeide e 0,2% di glutaraldeide in PBS per 10 minuti. Lavare brevemente le celle con PBS. Le celle possono ora essere spostate fuori dalla cappa aspirante.

Aggiungere una soluzione bloccante contenente il 4% di siero di capra normale e lo 0,04% di tritton X per ridurre il fondo e permeare le cellule per la colorazione immunologica. Incubare per 15 minuti. Colorare le cellule con l'anticorpo vlu T one diluito a uno a 2000 in soluzione bloccante.

Incubare le colture in anticorpi con un leggero dondolio per tre ore. Lavare le celle quattro volte con PBS. Incuba le cellule con Alexa.

6 47 coniugati anticorpi anti cavia diluiti a uno a 500 in soluzione bloccante. Mantenere le colture nell'anticorpo secondario con un leggero oscillazione per 30 minuti. Lavare le celle altre quattro volte con PBS.

Posizionare una piccola goccia di quantità di pavimento su un vetrino pulito usando una pinza. Raccogliere un vetrino coprioggetti e abbassarlo delicatamente sulla goccia di celle del pavimento rivolte verso il vetrino. Lasciare asciugare lo scivolo per una notte.

Preparare un obiettivo a olio 60 x su un microscopio a scansione laser confocale. Posizionare un vetrino sul tavolino in modo che il vetrino coprioggetto sia rivolto verso l'obiettivo. Trova un campo di neuriti che non sia eccessivamente denso e che sia lontano dal soma che può trattenere il colorante residuo.

Ingrandisci fino a una dimensione del campo di 51 x 51 micron. Utilizzo di software di acquisizione immagini. Acquisisci uno stack ZS che copre una profondità di 7,8 micron su 27 passi di 0,3 micron per ogni passo.

Eseguire prima la scansione dell'anticorpo VLU T one per identificare tutte le sinapsi glutammatergiche sul campo. Quindi eseguire nuovamente la scansione per la fluorescenza FM 1 43 FX per analizzare le immagini dopo l'acquisizione. Utilizza il software di analisi per convertire la virata Z in un'immagine composita su un singolo piano in base alla lettura dell'intensità massima da qualsiasi piano a ciascuna soglia impostata di pixel.

Per ridurre lo sfondo, identificare i terminali VG glu T one senza riferimento alla macchia di effetti FM 1 43. E contrassegna questi puncta come regioni di interesse. In genere selezioniamo 10 PUNTA per campo.

Ripeti la selezione della soglia e del punto sull'immagine degli effetti FM 1 43 e sovrapponi le immagini per identificare le sinapsi silenziose. Un criterio di pixel assoluti, o un criterio di pixel percentuali, può essere utilizzato per distinguere le sinapsi FM 1 43 positive da quelle negative FM 1 43 inattive. Nelle nostre colture, troviamo che dal 70 all'80% delle sinapsi di glutammato definite dalla colorazione V glut one mostrano una colorazione FM 1 43 rilevabile nelle immagini sovrapposte di fluorescenza verde FM 1 43 e colorazione rossa V glut one.

Ciò è evidente come un'abbondanza di sinapsi puntiformi gialle con marcatori colocalizzati. Questi sono indicati dalle frecce. Circa il 20-30% dei punti rossi V glut one positivi non avrà una fluorescenza verde FM 1 43 sopra la linea di base.

Questi sono i terminali presinaptici inattivi e un esempio è indicato dalla punta della freccia. Sarà osservata anche una terza popolazione di sinapsi. Questi sono positivi per la fluorescenza verde FM 1 43, ma privi di colorazione rossa B glut one.

Si tratta di sinapsi GABAergiche attive e un esempio è indicato dall'asterisco. Questi sono esclusi dalla maggior parte delle nostre analisi, ma possono essere studiati esplicitamente utilizzando un anticorpo trasportatore vescicolare GABA. Al posto dell'anticorpo VLU T one, vi abbiamo appena mostrato come visualizzare sinapsi presinapticamente silenti utilizzando la colorazione immuno FM 1 43 e VLU one.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che FM 1 43 FX è sensibile sia al tempo nel lavaggio adver sub seven che alla concentrazione del trattamento X 100 incluso nella soluzione bloccante. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.