Encyclopedia of Experiments: Biology
È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo Contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Først forberede agarose ved at tilføje E3 medium, som leverer calcium til dechorionerede embryoner til smeltet agarose. Næste, tilsæt MS222 til bedøve embryoner.
Derefter skal du indsætte et stempel i en glaskapillær og udarbejde et foster og sørge for, at det kommer ind i hovedet først. Når agarose størkner, skal du bruge tape til at holde kapillæren oprejst i et bægerglas indeholdende E3-medium. Den åbne kapillærbund fremmer gasudveksling til embryoprøven.
Placer kapillæren i prøveholderen på et lysarks fluorescensmikroskop.
Begynd med at forberede agarose. Smelt en forberedt 1 milliliter aliquot af 1% lavt smeltepunkt agarose i E3 medium ved 70 grader Celsius. Efter ca. 15 minutter overføres 600 mikroliter smeltet agarose til et friskt, 1,5 milliliter rør, og der tilsættes 250 mikroliter E3-medium, 50 mikroliter på 0,4% MS222 og 25 mikroliter hvirvelstofrør.
Placer røret i en varmeblok på omkring 39 grader Celsius, for at lade agarose nærmer sig sin jelling punkt. Næste, skubbe Teflon-tippet stemplet ned til bunden af 1 millimeter indre diameter glas kapillærer.
Nu, kort vortex agarose blandingen og derefter overføre fem embryoner med en minimal mængde væske i det. Derefter indsætte en kapillær og indsugning et foster, hovedet først.
Hovedet skal komme ind før halen, og der kan ikke være nogen luftbobler. Tegn nok opløsning, så der er omkring to centimeter agarose over embryoet og 1 centimeter agarose under det.
Tegn et foster ind i hver kapillær, før du fortsætter. Dette trin kræver en vis praksis at mestre. Forbered dig på det ved hjælp af ikke-værdifulde embryoner.
Når agarose størkner fuldstændigt, skal prøverne opbevares i E3-medium ved at støtte kapillærerne til en bægervæg med plasticin, med bundåbningen i opløsning.
Slidserne på ærmerne skal vende udad. Derefter fastgøres en klemmeskrue og sættes kapillæren gennem holderen, indtil det sorte farvebånd bliver synligt på den anden side. Undgå at røre stemplet.
Derefter strammes klemmeskruen. Derefter skubbes en centimeter agarose ud fra kapillæren og trimmes af. Sæt derefter stilken ind i prøveholderskiven.
Før du indlæser prøveskiven, skal du kontrollere, at fasen er i øverste position i kontrolsoftwaren. Brug derefter styreskinner til at glide holderen og prøve ned i mikroskopet. Forestil dig nu den valgte prøve som beskrevet i tekstprotokollen.
