Encyclopedia of Experiments: Biology
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- In primo luogo, preparare l'agarosio aggiungendo il mezzo E3, che fornisce calcio agli embrioni dechorionati all'agarosio fuso. Successivamente, aggiungere MS222 agli embrioni anestetizzati. Raffreddare il mix di agarosio a 38 gradi Celsius, vicino alla solidificazione. Selezionare alcuni embrioni dechorionati che esprimono proteine fluorescenti e trasferirli nel mix di agarosio.
Successivamente, inserire completamente uno stantuffo in un capillare di vetro e disegnare un embrione, assicurandosi che entri prima in testa. Una volta solidificato l'agarosio, utilizzare il nastro adesivo per tenere il capillare in posizione verticale in un becher contenente mezzo E3. Il fondo capillare aperto favorisce lo scambio di gas per il campione di embrione.
Posizionare il capillare nel portacampioni di un microscopio a fluorescenza del foglio luminoso. Il laser forma un foglio luminoso sottile, consentendo a un obiettivo di rilevamento, posizionato perpendicolarmente al campione, di catturare un'immagine di sezione trasversale. Nel protocollo di esempio, monteremo embrioni di zebrafish per l'immagine dell'occhio in via di sviluppo.
Iniziare con la preparazione dell'agarosio. Sciogliere un'aliquota preparata di 1 millilitro dell'1% di agarosio a basso punto di fusione in mezzo E3 a 70 gradi Celsius. Dopo circa 15 minuti, trasferire 600 microlitri di agarosio fuso in un tubo fresco da 1,5 millilitri e aggiungere 250 microlitri di mezzo E3, 50 microlitri dello 0,4% MS222 e 25 microlitri di soluzione di calcio di perline fluorescenti vorticose.
Ora, vortice brevemente la miscela di agarosio e poi, trasferire cinque embrioni con una quantità minima di liquido in esso. Quindi, inserire un capillare e aspirare prima un embrione, testa prima.
La testa deve entrare prima della coda e non possono esserci bolle d'aria. Redigere una soluzione sufficiente, quindi ci sono circa due centimetri di agarosio sopra l'embrione e 1 centimetro di agarosio sotto di esso.
Disegnare un embrione in ogni capillare prima di procedere. Questo passaggio richiede una certa pratica da padroneggiare. Prepararsi utilizzando embrioni non preziosi.
Quando l'agarosio si solidifica completamente, conservare i campioni in mezzo E3 supportando i capillari su una parete di becher con plastilina, con lapertura inferiore in soluzione. Ora assemblate il portacampioni. In primo luogo, inserite due maniche di plastica della giusta dimensione luna contro laltra nello stelo.
Le fessure sulle maniche devono essere affiancate verso lesterno. Successivamente, fissare una vite del morsetto e inserire il capillare attraverso il supporto, fino a quando la fascia di colore nera diventa visibile sullaltro lato. Evitare di toccare lo stantuffo.
Quindi stringere la vite del morsetto. Successivamente, spingere un centimetro di agarosio dal capillare e tagliarlo. Quindi, inserire lo stelo nel disco portacampioni.
Prima di caricare il disco di esempio, verificare che lo stage si trova nella posizione più in alto nel software di controllo. Utilizzare le guide guida per far scivolare il supporto e campionare al microscopio. Ora, immagine del campione scelto come descritto nel protocollo di testo.
