Light Sheet Microscopie Monstervoorbereiding: Montage van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

- Bereid eerst agarose voor door E3-medium toe te voegen, dat calcium levert aan de gedechorioneerde embryo's om agarose te gesmolten. Voeg vervolgens MS222 toe om embryo's te verdoven. Koel de agarosemix af tot 38 graden Celsius, dicht bij het stollen. Selecteer een paar gedechorioneerde embryo's die fluorescerende eiwitten uitdrukken en breng ze over in de agarosemix.

Plaats vervolgens een zuiger volledig in een glazen capillair en maak één embryo op, zorg ervoor dat het eerst in het hoofd komt. Zodra de agarose stolt, gebruikt u tape om het capillair rechtop te houden in een bekerglas met E3-medium. De open capillaire bodem bevordert de gasuitwisseling voor het embryomonster.

Plaats het capillair in de monsterhouder van een lichtplaatfluorescentiemicroscoop. De laser vormt een dun lichtblad, waardoor een detectiedoelstelling-- loodrecht op het monster geplaatst-- een dwarsdoorsnedebeeld kan vastleggen. In het voorbeeldprotocol zullen we zebravisembryo's monteren om het zich ontwikkelende oog in beeld te brengen.

Begin met het bereiden van de agarose. Smelt een bereide 1 milliliter aliquot van 1% laag smeltpunt agarose in E3 medium op 70 graden Celsius. Breng na ongeveer 15 minuten 600 microliter gesmolten agarose over in een verse buis van 1,5 milliliter en voeg 250 microliter E3 medium, 50 microliters van 0,4% MS222 en 2.

Plaats de buis in een verwarmingsblok op ongeveer 39 graden Celsius, om de agarose zijn jelling point te laten naderen. Duw vervolgens teflon-getipte plunjers naar de bodem van glazen haarvaten met een binnendiameter van 1 millimeter. Bereid er vijf voor.

Draai nu kort het agarosemengsel en breng vervolgens vijf embryo's met een minimale hoeveelheid vloeistof erin over. Plaats vervolgens een capillair en aspireer eerst één embryo.

Het hoofd moet vóór de staart binnenkomen en er kunnen geen luchtbellen zijn. Maak voldoende oplossing zodat er ongeveer twee centimeter agarose boven het embryo en 1 centimeter agarose eronder zit.

Trek één embryo in elk capillair voordat u verder gaat. Deze stap vereist enige oefening om het onder de knie te krijgen. Bereid u voor met niet-waardevolle embryo's.

Wanneer de agarose volledig stolt, bergt u de monsters op in E3-medium door de haarvaten te ondersteunen aan een bekerwand met plasticine, met de onderste opening in oplossing. Monteer nu de monsterhouder. Plaats eerst twee plastic hulzen van de juiste grootte tegen elkaar in de steel.

De spleten op de hulzen moeten naar buiten gericht zijn. Bevestig vervolgens een klemschroef en steek het capillair door de houder, totdat de zwarte kleurband aan de andere kant zichtbaar wordt. Raak de zuiger niet aan.

Draai vervolgens de klemschroef vast. Duw vervolgens een centimeter agarose uit het capillair en knip deze af. Steek vervolgens de steel in de schijf van de monsterhouder.

Voordat u de monsterschijf laadt, controleert u of het werkgebied zich in de bovenste positie van de besturingssoftware bevindt. Gebruik vervolgens geleiderails om de houder en het monster in de microscoop te glijden. Bekijk nu het gekozen monster zoals beschreven in het tekstprotocol.