Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

Ciao, sono Raja Ti e sto facendo il mio dottorato di ricerca presso il Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Vi guiderò attraverso i passaggi coinvolti nell'illustrazione 3D della modifica orientale che ha marcato il danno al DNA e la condensazione cromatica in una nuova cellula cardiaca. Il DNA è avvolto intorno alle zone nucleari.

Ogni nucleosoma è composto da quattro diversi tipi di istoni, H due A, H due b, H tre e H quattro radi. La formazione di DNA si rompe e questo è marcato da PHO di H due X. Questo pho di H due X si verifica principalmente nella creatina che è caratterizzata dalla metilazione di H tre K quattro. Ora esamineremo l'illustrazione 3D delle modifiche nell'etichetta immunologica della tua cellula con lo strato pho H due X e l'H metilato tre K quattro.

Iniziamo. Iniziamo posizionando il corso E della sospensione cellulare in 15 mil. I tubi Falcon S vengono lavati due volte con profumazione PB a uno da 50 G e Resus.

Sospendi in nuovi terreni per vedere l'effetto immediato delle radiazioni sugli eventi cellulari. Tenere le cellule sugli occhi per 5-10 minuti prima e durante la radiazione. Esporre le cellule alle radiazioni gamma o ai raggi X Dopo la radiazione, erogare tre millilitri di sospensione cellulare in ciascuna GU di sei.

La piastra a pozzetti per il picco gamma H due X incubano le cellule tra 30 minuti e un'ora a 37 gradi centigradi. Utilizziamo la missione Cytosine per posizionare le cellule non aderenti su vetrini. Quando si monta la clip per citosina, assicurarsi che l'intero cavo del filtro coincida con l'imbuto.

Erogare un 50 microlitro, tamponare questa sospensione cellulare in ogni collocamento finale di citosina la citosina in missione Cytosine e farla girare a 500 giri/min per cinque minuti. Rimuovere le clip per citosina e separare i vetrini dalla scheda del filtro. Non lasciare che le cellule si asciughino all'aria troppo a lungo in quanto potrebbe influenzare il fondo nella colorazione con fluoresceina.

Usando il perno di blocco del liquido disegna dei cerchi Attorno a ogni striscio, fissiamo le celle con la testa paraform al 4% a temperatura ambiente per cinque minuti. Rispetto all'etanolo o all'olo, è stata osservata una migliore fissazione con la testa paraform al 4%. Scivola a vento con celle di permeazione PPS con Triton X 100 a temperatura ambiente per cinque minuti.

Rispetto al gemello 80, abbiamo osservato un segnale migliore nelle cellule per Triton X 100. Osservare le celle con PP S3 volte ciascuna per cinque minuti. Bloccare le cellule in una persona BSA per 10 minuti a temperatura ambiente e ripetere l'operazione tre volte rispetto ad altri agenti bloccanti e volte.

La BSA è risultata la più efficiente nel minimizzare il legame non specifico degli anticorpi primari, abbiamo utilizzato due anticorpi primari diluiti uno su 500 con l'1% di BSA a circa 50 microlitri di anticorpi primari per ogni vetrino. L'incubazione dell'anticorpo primario a temperatura ambiente per 60 minuti riduce la colorazione di fondo rispetto all'incubazione notturna a quattro gradi centigradi. Lavare le celle tre volte con PBS per cinque minuti.

Alexa piano 4 88, buon anti mouse e Alexa piano 5 46 parole anti coniglio. Gli anticorpi secondari sono stati utilizzati per mantenere diversi marcatori contemporaneamente. Utilizzare anticorpi allevati in specie diverse.

Aggiungere circa 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti a ciascun vetrino. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 90 minuti. Si consiglia di incubare le cellule nella camera umida in quanto impedirà alle cellule e agli anticorpi di asciugare i vetrini con PB S3 volte ciascuno per cinque minuti.

A ciascun vetrino sono stati aggiunti 50 microlitri di una diluizione su 500 del topo tre in PBS. Lavare i vetrini con PBS per tre volte ciascuno per cinque minuti. Rimuovere l'umidità in eccesso dai vetrini e aggiungere la soluzione Antifa.

Si raccomanda di non asciugare completamente le cellule prima di aggiungere la soluzione Antifa. Posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino. K deve essere assunto per evitare la formazione di bolle d'aria.

Lasciare i vetrini per una notte in una camera buia e umida. Sigillare il vetrino con smalto per unghie per evitare l'essiccazione delle cellule. Le immagini acquisite e un microscopio confocale rivelano.

Una migliore risoluzione spaziale è scomparsa e il laser ad elio è stato utilizzato per l'acquisizione delle immagini. Un oggetto a 63 emissioni di olio due lenti preferite a lenti di ingrandimento più alto o più basso. Un fattore di zoom di tre o quattro produrrà un'immagine con una risoluzione migliore.

Per la contabilizzazione FO da molte celle, è preferibile utilizzare una velocità di scansione di otto, una dimensione dell'immagine di 1024 in celle di 1024 pixel. Quando si esegue l'imaging per più canali, si consiglia un'acquisizione sequenziale a scansione lineare rispetto alla scansione dei fotogrammi. Per evitare lo sbiancamento del campione, il guadagno del rivelatore e l'offset dell'amplificatore vengono regolati per ridurre i mouse e la saturazione del segnale.

Poiché le dimensioni di Kama HX X four possono essere inferiori a 0,5 micrometri, si consiglia di acquisire immagini con almeno 0,5 micrometri. Le immagini della dimensione del passo lungo l'asse del getto sono necessarie in un modello di serie a getto utilizzando il modello Segna prima e Segna perso. Per illustrare la relazione spaziale tra diverse proteine, si consiglia di utilizzare una velocità di scansione di sei con una dimensione dell'immagine di 2048 e 2 48 pixel utilizzando prima il metamor.

Il secondo può essere contato dalle immagini acquisite su vari microscopi confocali. Apri i tag immagine gamma hgx direttamente dal menu file o utilizzando i numeri di banconota. Tag. Vai al menu di processo e scegli Stack aritmatico.

Scegli la proiezione massima e seleziona i piani da includere. E fai clic su OK. Ora scegli il cappello a cilindro e seleziona Gamma H due immagini X come immagine sorgente applica.

Il filtro Top Hat e l'immagine risultante saranno un'immagine binaria con meno rumore e una variazione ridotta nell'intensità dei fuochi. Vai alle regioni e seleziona lo strumento di disegno della regione e disegna le regioni attorno ai nuclei. Vai all'immagine del processo, del menu e della soglia di vendita.

Scegliere la soglia di inclusione e impostare i valori di soglia inferiore e superiore. Di solito sono i valori di soglia che influenzano il numero quattro. Il valore di soglia ottimale è quello che minimizza l'inclusione dello sfondo e massimizza l'inclusione dell'incursione.

Ciò può essere ottenuto al meglio contando il numero di incursioni utilizzando diversi valori di soglia. E poi confronta il numero di incursioni con il conteggio ad occhio nudo. Seleziona l'immagine DPI e vai al menu delle regioni e seleziona l'opzione di trasferimento delle regioni.

Ora abbiamo le corrispondenti incursioni e immagini nucleari pronte per il conteggio. La maggior parte delle regioni nucleari vengono trasferite a cilindro . Vai su misura, menu e seleziona analisi aria integrata o IMA seleziona Misura tutte le regioni e fai clic su misura per ottenere il numero FTE.

Ora i numeri FTE di ciascuna regione possono essere esportati in un foglio di calcolo utilizzando l'opzione Log data. Aprire le immagini del proiettore jet create in precedenza per ciascun canale. Vai su display e seleziona l'allineamento del colore.

Selezionare le rispettive immagini sorgente per ciascun canale per creare un'immagine immagine per tutti e tre i canali. L'analisi a scansione lineare viene eseguita per illustrare il posizionamento spaziale di diversi marcatori nel nucleo. Vai al comando delle barre degli strumenti di misurazione e seleziona l'analisi della scansione lineare, la linea secca attraverso la cella.

Questo creerà un grafico che mostra l'intensità fluorescente di ciascun canale lungo la linea e rappresenta la distanza di diversi marcatori l'uno rispetto all'altro. Per creare un'immagine 3D da una pila, vai al menu A una pila e scegli Ricostruzione 3D. Selezionare il tipo di ricostruzione 3D massimo.

Scegli il piano di rotazione, scegli la distanza di calibrazione del getto. Di solito l'utente specifica che fa clic su OK per creare una ricostruzione 3D. E questo conclude il nostro protocollo per l'immunofluorismo, la colorazione e l'analisi delle immagini.

In sintesi, il microscopio confocale a immunofluorescenza è due tecniche per la visualizzazione tridimensionale di diversi marcatori C e gamma H due X foy nel nucleo cellulare. Grazie per l'attenzione.