Rilevamento di patogeni pesci tramite analisi a ripetizione tandem a numero variabile (VNTR)

Inizia con una piastra PCR contenente una soluzione denaturante a base di formamide.

Aggiungere gli amplicon PCR diluiti derivati da un batterio patogeno dei pesci in ogni pozzo.

Questi ampliconi contengono ripetizioni tandem a numero variabile marcate fluorescenti (VNTR), sequenze brevi e ripetitive utilizzate come marcatori genetici per l'identificazione batterica.

Sigilla la piastra e la centrifuga per eliminare le bolle d'aria.

Riscalda la piastra in un termociclatore per denaturare i VNTR a doppio filo.

La formamide migliora la separazione dei filamenti e inibisce il ricotturatura.

Raffreddare rapidamente la piastra per stabilizzare il DNA a singolo filamento.

Centrifuga per raccogliere il volume del campione.

Rimuovi la guarnizione e fissa la piastra con un telaio.

Posizionare il tubo capillare ed eseguire l'elettroforesi capillare.

Durante l'elettroforesi, i frammenti di VNTR migrano attraverso il capillare sotto un campo elettrico e si separano per dimensione.

Un laser eccita i tag fluorescenti su ogni frammento, generando segnali codificati a colori.

L'elettroferogramma risultante mostra i modelli di picco VNTR che corrispondono al batterio patogeno.

Dopo la conferma degli amplificatori PCR, utilizzare nuove strisce o piastre PCR per diluire i prodotti PCR da 1 a 10 in acqua purificata. Vortice e centrifuga per un breve periodo. Durante il lavoro in una camera fumi, preparare un master mix in un tubo centrifuga composto da formamide e soluzione standard di dimensione di riferimento.

A seconda del numero di prodotti PCR da analizzare, si utilizzano i volumi di reagenti come descritto nel manoscritto. Prevedi un volume di surplus del 10%. Vortice brevemente e distribuire 9,5 microlitri in singoli pozzi su una piastra PCR adatta al sistema di elettroforesi capillare disponibile.

Poi, aggiungi 0,5 microlitri di prodotto PCR diluito. Sigilla e centrifuga brevemente. Poi, carica la piastra contenente i campioni in un termociclatore PCR e denatura i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti prima di raffreddare a 4 gradi Celsius indefinitamente.

Centrifugare a 1000 g per un minuto, rimuovere con cura la guarnizione e caricare la piastra su un sistema di elettroforesi capillare calibrato secondo le istruzioni del produttore. Eseguire l'analisi dei frammenti di elettroforesi capillare, utilizzando i reagenti appropriati per l'apparecchio scelto, e regolare le condizioni di funzionamento secondo la descrizione nel manoscritto.