JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:01 min • November 28th, 2025
Inizia con una piastra PCR contenente una soluzione denaturante a base di formamide.
Aggiungere gli amplicon PCR diluiti derivati da un batterio patogeno dei pesci in ogni pozzo.
Questi ampliconi contengono ripetizioni tandem a numero variabile marcate fluorescenti (VNTR), sequenze brevi e ripetitive utilizzate come marcatori genetici per l'identificazione batterica.
Sigilla la piastra e la centrifuga per eliminare le bolle d'aria.
Riscalda la piastra in un termociclatore per denaturare i VNTR a doppio filo.
La formamide migliora la separazione dei filamenti e inibisce il ricotturatura.
Raffreddare rapidamente la piastra per stabilizzare il DNA a singolo filamento.
Centrifuga per raccogliere il volume del campione.
Rimuovi la guarnizione e fissa la piastra con un telaio.
Posizionare il tubo capillare ed eseguire l'elettroforesi capillare.
Durante l'elettroforesi, i frammenti di VNTR migrano attraverso il capillare sotto un campo elettrico e si separano per dimensione.
Un laser eccita i tag fluorescenti su ogni frammento, generando segnali codificati a colori.
L'elettroferogramma risultante mostra i modelli di picco VNTR che corrispondono al batterio patogeno.
Dopo la conferma degli amplificatori PCR, utilizzare nuove strisce o piastre PCR per diluire i prodotti PCR da 1 a 10 in acqua purificata. Vortice e centrifuga per un breve periodo. Durante il lavoro in una camera fumi, preparare un master mix in un tubo centrifuga composto da formamide e soluzione standard di dimensione di riferimento.
A seconda del numero di prodotti PCR da analizzare, si utilizzano i volumi di reagenti come descritto nel manoscritto. Prevedi un volume di surplus del 10%. Vortice brevemente e distribuire 9,5 microlitri in singoli pozzi su una piastra PCR adatta al sistema di elettroforesi capillare disponibile.
Poi, aggiungi 0,5 microlitri di prodotto PCR diluito. Sigilla e centrifuga brevemente. Poi, carica la piastra contenente i campioni in un termociclatore PCR e denatura i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti prima di raffreddare a 4 gradi Celsius indefinitamente.
Centrifugare a 1000 g per un minuto, rimuovere con cura la guarnizione e caricare la piastra su un sistema di elettroforesi capillare calibrato secondo le istruzioni del produttore. Eseguire l'analisi dei frammenti di elettroforesi capillare, utilizzando i reagenti appropriati per l'apparecchio scelto, e regolare le condizioni di funzionamento secondo la descrizione nel manoscritto.
In questo articolo viene descritto un metodo per l'analisi delle ripetizioni in tandem a numero variabile (VNTR) in ampliconi PCR derivati da batteri patogeni per i pesci. Il processo prevede l'elettroforesi capillare per separare e identificare questi marcatori genetici.
L'analisi multilocus VNTR mediante elettroforesi capillare consente un profilo genetico preciso di batteri patogeni per i pesci, supportando l'identificazione precoce dei patogeni e la valutazione del rischio nella ricerca e sviluppo biotecnologica. Questo flusso di lavoro aumenta la sicurezza predittiva nel tracciamento della fonte microbica e orienta le decisioni di portafoglio per lo sviluppo di vaccini o terapie mirate ai patogeni acquatici. La riproducibilità del metodo e i suoi risultati quantitativi lo posizionano come strumento solido per la ricerca traslazionale e i percorsi di sviluppo di saggi.
L'analisi VNTR mediante elettroforesi capillare si integra nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, fornendo una capacità di impronta genetica per la validazione del bersaglio microbico e la preparazione del saggio.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026