Preparazione del tessuto della vescica del topo per la visualizzazione di infezioni batteriche

Si inizia con un topo soppresso con la vescica esposta, pre-infettata da batteri patogeni.

I batteri invadono l'urotelio e formano colonie. Al momento della maturazione, questi batteri rompono la cellula epiteliale e infettano le cellule circostanti.

Inserire un catetere collegato a una siringa piena di fissativo. Instilla lentamente il fissativo per gonfiare la vescica e preservarne l'architettura.

Clampa l'uretra per mantenere il fissativo e mantenere la forma della vescica.

Rimuovi il catetere, poi taglia l'uretra. Trasferisci la vescica in un nuovo fissativo e incuba per preservare la struttura.

Dividere la vescica in due coppe a mezza vescica per esporre l'urotelio, e risciacquare con un tampone.

Tingi con un reagente a base metallica per aumentare il contrasto, poi lava con acqua ultrapura.

Disidratare le sezioni utilizzando un gradiente di etanolo, seguito da un essiccamento a punto critico.

Taglia a metà ogni coppetto della vescica secca.

Il campione è ora pronto per il processamento a valle per visualizzare le interazioni ospite-patogeno.

Una volta con la siringa a punta scorrevole della tubercolina con il fissatore, fissare un catetere all'estremità, bisellato rivolto in direzione opposta alle marcature della siringa.

Taglia il tubo in eccesso da 1 a 2 millimetri dalla punta dell'ago, facendo attenzione a non esporre la punta. Fai un colpo con la siringa per rimuovere le bolle e spingi lo stantuffo per far uscire aria. Poi riempi il catetere con un fissativo sopra un tubo per microcentrifuga. Dopo aver anestetizzato e sacrificato il topo, una volta fissate le gambe, si apri l'area pelvica del topo con una pinza e un paio di forbici chirurgiche per esporre la vescica. Sposta con attenzione il grasso adiacente, ma lascia la vescica al suo posto.

Tieni la siringa con la mano dominante con l'ago rivolto verso il basso. Immergi la punta del catetere in un lubrificante sterile e posiziona la punta del catetere all'apertura uretrale, tenendo il barile della siringa a un angolo di 30-45 gradi sopra il corpo del topo.

Applica pressione verso il basso con un leggero movimento orario e inserisci delicatamente il catetere nell'uretra. Quando la punta del catetere entra, si inclina la siringa verso la coda del topo continuando a far scorrere il catetere più all'interno dell'uretra finché la canna della siringa non è parallela alla superficie di lavoro. L'intero fusto dell'ago del catetere dovrebbe entrare nel topo, posizionando la punta del catetere all'interno del lumen della vescica. Somministra lentamente da 50 a 80 microlitri di fissativo, facendo gonfiare la vescica come un palloncino.

Mantieni il catetere in posizione e solleva leggermente la siringa, inclinando la punta verso l'alto. Con l'altra mano, apri un emostato e infila una punta sotto l'ago del catetere all'incrocio dell'uretra. Chiudi parzialmente l'emostato finché non tocca appena l'ago.

Fai scivolare delicatamente l'ago del catetere fuori dalla vescica mentre contemporaneamente si blocca e si blocca completamente l'emostat per evitare la perdita del fissativo. Impugna l'emostatico in modo che sia parallelo alla superficie di lavoro con la vescica appoggiata sopra. Solleva delicatamente e taglia con attenzione sotto l'emostato per rimuovere la vescica con l'emostato ancora attaccato.

Inserisci la vescica e l'emostato attaccato in un tubo Falcon contenente il fissatore riscaldato. Assicurati che la vescica sia completamente immersa nel liquido e non premuta contro le pareti del tubo.

Per visualizzare la vescica tramite microscopia elettronica a scansione, si taglia sagittalmente in due con una lametta o bisturi pulita e a doppia faccia, e si effettua un secondo taglio tangenziale all'emostato per rilasciare la vescica. Questo porta a due coppe a mezza vescica. Se ci sono residui di cuscinetti grassi all'esterno della vescica, rimuovili delicatamente.

Risciacqua le metà della vescica tre volte con un tampone di cacodilato di sodio. Tingere il tessuto con tetrossido osmio all'1% in un tampone cacodilato a 0,15 molari per 1 ora a temperatura ambiente. Esegui questo passaggio con il recipiente di tinta avvolto in stagnola per mantenere un ambiente buio. Dopo la macchia, risciacqua le metà della vescica tre volte con acqua ultra-pura.

Se si vede olio osmicato sulla superficie dell'acqua, aspirarlo o rimuvigliarlo per evitare contaminazioni durante le fasi di asciugatura. Dopo aver disidratato il tessuto, taglia a metà le due con un rasoio pulito e a doppio lato per ottenere un totale di quattro pezzi.