Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

L'obiettivo generale della seguente procedura è ottenere cristalli di alta qualità di una proteina di membrana per la determinazione strutturale mediante cristallografia a raggi X. Questo risultato si ottiene ricostituendo la proteina nella membrana di una fase cubica lipidica e incubandola con una soluzione precipitante, che induce la nucleazione e la crescita dei cristalli grazie all'ampio spazio di cristallizzazione e al limitato riscontro sperimentale derivante dai test di cristallizzazione. Il saggio di recupero della fluorescenza della fase cubica lipidica dopo fotobleaching o LCP Frap Prec è stato sviluppato per selezionare le condizioni di cristallizzazione più promettenti.

Questo saggio riduce la quantità di screening e aumenta le probabilità di ottenere i primi risultati di cristallizzazione. Una volta individuati i primi risultati, vengono impostati esperimenti di ottimizzazione per migliorare la crescita dei cristalli. Infine, i cristalli ottimizzati vengono raccolti e congelati in azoto liquido per la raccolta dei dati presso una sorgente di sincrotrone.

I risultati mostrano l'efficace utilizzo del saggio LCP FRA per ottenere cristalli iniziali del recettore beta-2 adrenergico in LCP, la cui ulteriore ottimizzazione ha portato a cristalli di qualità adatta alla diffrazione. Questa tecnica sfrutta un ambiente membranoso simile a quello nativo fornito dalla fase cubica ripetuta e produce tipicamente cristalli con contenuto di soluzione ridotto e un migliore ordine rispetto alla cristallizzazione in soluzioni detergenti. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà a causa dell'elevata viscosità e delle proprietà reologiche della fase lipidica, che rendono questi materiali difficili da manipolare.

Tuttavia, quando si utilizzano gli strumenti appropriati e si padroneggia la tecnica, questa procedura non è più difficile di qualsiasi altra tecnica di cristallizzazione proteica ed è adatta all'automazione e all'elaborazione ad alto rendimento. Cominciamo dunque. Purificare la proteina di membrana di interesse in una soluzione di detergente e concentrare i complessi proteina-detergente a circa 10-20 milligrammi per millilitro.

Trasferire circa 25 milligrammi di un lipide ospite LCP A o di una miscela lipidica in un tubo di plastica e incubare a 40 gradi Celsius per alcuni minuti fino a quando il lipide non si sarà fuso. Successivamente, fissare un connettore per siringa a una siringa gastight da 100 microlitri. Caricare la siringa con il lipide fuso utilizzando una pipetta a volume regolabile.

Registrare il volume del lipide nella siringa e caricare un'altra siringa da 100 microlitri con una quantità sufficiente di soluzione proteica da ottenere un rapporto tra soluzione proteica e lipide di due a tre in volume su volume. Collegare entrambe le siringhe tramite il connettore per siringhe. Spingere alternativamente gli stantuffi delle siringhe per far passare il lipide e la proteina attraverso l'ago interno del connettore avanti e indietro finché la fase mesomorfica lipidica non diventa omogenea.

LCP si forma spontaneamente mediante miscelazione meccanica e la proteina viene reincorporata nel doppio strato lipidico di LCP. La formazione di LCP può essere verificata dall'aspetto trasparente e gelatinoso e dall'assenza di birifrangenza quando viene osservato al microscopio dotato di polarizzatori incrociati oppure, se possibile, mediante diffrazione a raggi X a piccolo angolo. Per iniziare i saggi di frap su LCP, etichettare la proteina con un colorante fluorescente in un rapporto proteina/colorante di circa 100 a 1 come descritto nel protocollo scritto.

Rimuovere il colorante non reattivo e concentrare la proteina a circa un milligrammo per millilitro. Successivamente, ricostituire la proteina marcata in LCP nello stesso modo utilizzato per la proteina non marcata. Preparare le piastre per il saggio.

Utilizzo di soluzioni di screening LCP wrap. Trasferire innanzitutto l'LCP contenente la proteina in una siringa ermetica da 10 microlitri collegata a un dispenser per siringhe ripetitive, quindi applicare un ago corto rimovibile alla siringa da 10 microlitri. Dispensare boli di 200 nanolitri di LCP sulla superficie di quattro pozzetti adiacenti, formando una sovrapposizione quadrata due per due; aggiungere a ciascun bolo di LCP un microlitro della corrispondente soluzione di screening LCP FRA.

Dopo aver dispensato la soluzione di screening, sigillare le quattro pozzette caricate con un coprivetro quadrato da 18 millimetri. Applicare una leggera pressione sul coprivetro per sigillare le pozzette. Ripetere questa procedura per il successivo gruppo di quattro pozzette fino a quando l'intera piastra sarà riempita.

Dopo averlo riempito, coprire la piastra con della pellicola. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius per almeno 12 ore. Per raggiungere uno stato di equilibrio, posizionare una delle piastre sulla stazione LCP Frap e mettere a fuoco il primo pozzetto utilizzando un obiettivo da 10 volte.

L'acquisizione dei dati FRAP viene eseguita automaticamente utilizzando uno script Image Pro in cui l'utente inserisce innanzitutto tutti i parametri di acquisizione e successivamente preme il pulsante di avvio. Una sequenza tipica di acquisizione inizia registrando cinque immagini pre-bleach, quindi attiva il laser di bleaching sincronizzato con l'acquisizione in streaming di una sequenza rapida di recupero di circa 200 immagini alla velocità massima possibile, seguita dall'acquisizione di una sequenza lenta di recupero di 50 immagini con intervalli da uno a 20 secondi tra un'immagine e l'altra, a seconda della velocità di diffusione della proteina. Al termine della raccolta dati, integrare l'intensità all'interno della zona di bleaching e in punti di riferimento posizionati al di fuori dell'area trattata dal laser di bleaching in tutti i fotogrammi corretti.

La curva dell'intensità integrata per le deviazioni causate dalle fluttuazioni della luce e dal fotoblesciamento durante l'acquisizione dei dati normalizza l'intensità corretta in modo che l'intensità pre-bleaching sia pari a uno e l'intensità iniziale post-bleaching sia pari a zero; si adatta quindi la curva dell'intensità normalizzata in funzione del tempo come descritto nel protocollo scritto, al fine di ottenere la frazione mobile e il coefficiente di diffusione. Ripetere questa procedura per il successivo punto, confrontare le frazioni mobili e i coefficienti di diffusione ottenuti per le diverse condizioni di screening. Progettare schermate di cristallizzazione nuove basate sui componenti che hanno facilitato la diffusione della proteina ed escludendo le condizioni per cui non è stata osservata diffusione proteica, al fine di impostare prove di cristallizzazione in LCP.

Ricostituire la proteina in LCP come in precedenza, quindi preparare le piastre per la cristallizzazione come per la frap in LCP, ma utilizzando soluzioni di screening per la cristallizzazione. In alternativa, una volta preparate le piastre per la cristallizzazione, è possibile impostare le prove di cristallizzazione in modo robotizzato, incubarle a temperatura costante e controllare periodicamente la formazione e la crescita dei cristalli. Una volta cresciuti i cristalli proteici, posizionare una piastra contenente i cristalli sotto un microscopio stereoscopico con ingrandimento variabile, dotato di polarizzatore e analizzatore lineari rotanti.

Concentrarsi sul pozzetto di interesse utilizzando un ingrandimento a bassa potenza in modo che l'intero pozzetto sia compreso nel campo visivo. Incidere il vetrino coprioggetto con quattro passate, creando un quadrato all'interno dei limiti del pozzetto, usando un angolo appuntito di una pietra abrasiva per tagliare i capillari in ceramica. Premere lungo il perimetro inciso con pinzette dotate di punta robusta e affilata per propagare le incisioni attraverso tutto lo spessore del vetrino.

Praticare con un punzone per vetrini due piccoli fori agli angoli opposti del quadrato segnato. Iniettare alcune microlitro di soluzione precipitante attraverso uno dei fori per ridurre la disidratazione durante i passaggi successivi. Utilizzando una sonda a ago affilata e inclinata, rompere il vetro lungo uno o due lati per staccare il quadrato ritagliato.

Sollevare con attenzione il quadrato di vetro osservando il bolo in fase cubica. Aggiungere qualche microlitro aggiuntivo di soluzione precipitante, integrata con un crioprotettante se necessario, sulla sommità del bolo in fase cubica esposto nel pozzetto. Aumentare l'ingrandimento del microscopio e mettere a fuoco un cristallo. Regolare l'angolo tra polarizzatore e analizzatore per aumentare il contrasto tra il cristallo frt e lo sfondo, mantenendo sufficiente luce per vedere il loop di raccolta.

Quindi rimuovere l'eccesso di lipidi ed estrarre il cristallo direttamente dal LCP prelevandolo con un supporto micro Mighty Gen scelto in modo che il diametro corrisponda alle dimensioni del cristallo. Congelare il supporto micro con il cristallo raccolto in azoto liquido e spedirlo a una linea di fascio di sincrotrone per la raccolta di dati a raggi X. Il recettore beta-2 adrenergico ingegnerizzato è stato marcato con l'estere NHS del S SI tre e utilizzato in saggi di cristallizzazione LCP Frep prec in modalità automatica ad alto rendimento, in cui ogni campione di una piastra a 96 pozzetti viene sbiancato in sequenza e il recupero della fluorescenza viene misurato dopo un'incubazione di 30 minuti. I recuperi di fluorescenza ottenuti, che rappresentano la frazione mobile in ciascun campione, vengono riportati in grafico per tutti e 96 i campioni.

Le soluzioni di screening contengono tris 0,1 molare a pH 8, PEG 400 al 30% in volume, combinati con 48 diversi sali a due concentrazioni differenti. Vengono mostrati i profili di recupero della fluorescenza per diverse condizioni rappresentative. Le curve continue rappresentano gli adattamenti dell'intensità normalizzata rispetto al tempo; il rapido recupero inferiore al 10% nel campione contenente cloruro di sodio è dovuto ai lipidi marcati fluorescentemente.

Co purificati con la proteina, i primi cristalli ottenuti del recettore beta-2 adrenergico in complesso con olol sono stati ottenuti mediante uno screening su griglia grossolana attorno alle condizioni più promettenti identificate da LCP Frap contenente solfato di sodio e formiato di sodio. Un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni del precipitante ha prodotto cristalli di qualità adatta alla diffrazione. Qui, le immagini dei cristalli cresciuti in presenza di solfato di sodio e formiato di potassio sono state acquisite in modalità campo chiaro.

Gli stessi cristalli possono essere osservati anche utilizzando polarizzatori incrociati. Una volta acquisita padronanza, la ricostituzione della proteina in fasi cubiche lipidiche può essere completata in 10-15 minuti, e l'allestimento manuale di una piastra di cristallizzazione a 96 pozzetti richiede circa un'ora. Il saggio L three B wrap in modalità alta richiede circa due ore per piastra a 96 pozzetti, mentre il cristallo H richiede approssimativamente da 10 a 20 minuti per pozzetto. Le procedure mostrate in questo video forniscono una guida di base per affrontare prove di cristallizzazione di proteine.

Tuttavia, come in ogni esperimento di cristallizzazione, è necessaria una schermatura ampia e un'ottimizzazione approfondita, e un esito positivo non è necessariamente garantito.