Murino pancreatica isolamento Islet

Ciao, sono Greg Zott. Sono con l'UCSF Diabetes Center nel Bluestone Laboratory, e oggi vi mostrerò il processo per isolare gli occhielli dei topi. La procedura prevede l'iniezione di una soluzione di collagenasi nel pancreas di un topo donatore C3 H, dove poi rimuoveremo quel pancreas, lo digeriremo, purificheremo gli occhielli su un gradiente fiale, e poi li raccoglieremo a mano per il trapianto finale nella capsula renale di un topo NOD diabetico, che sarà il nostro ricevente.

Prima di iniziare questa procedura, abbiamo diluito la nostra soluzione ATE in un tampone Hanks modificato e abbiamo regolato la concentrazione specifica per il ceppo di topo che stiamo usando il C3 H. Abbiamo trovato che si digerisce meglio con una soluzione di collagenasi di 0,8 mg per mil, e la useremo per iniettare nel dotto biliare comune per distendere il pancreas. Eseguire. La procedura di oggi sarà Pavo codre del centro diabetologico. Inietterà, aprirà il topo, esporrà l'intestino e poi inietterà nel dotto biliare comune.

Spruzzeremo il topo con etanolo per mantenere i capelli sciolti, e poi verificheremo anche che il topo sia stato sacrificato correttamente con un pizzico di dita. Pavo ora aprirà il topo ed esporrà l'intestino e il pancreas con un'incisione sulla linea mediana. Anche il diaframma verrà tagliato per verificare che il mouse verrà sacrificato.

Prima di iniziare, vorrei sottolineare alcune delle strutture importanti. Lo stomaco è sdraiato proprio qui con il pancreas attaccato sotto nel duodeno e sopra. Questo è il fegato dove troveremo la cistifellea e il dotto biliare comune, che puoi vedere proprio qui.

Quindi quello che Pavo farà dopo è isolare l'intestino tenue, trovare dove il dotto biliare comune entra nell'intestino tenue. Una volta che l'intestino è esposto, mordiamo su entrambi i lati del dotto biliare comune con pinze per zanzare. Scopriamo che questo consente a più collagenati di entrare nel pancreas mentre altri gruppi cercano di dirigere il morsetto sopra il dotto biliare comune.

Scopriamo che questa è una tecnica migliore per consentire all'enzima di entrare nel pancreas. Questa è una procedura delicata. Non vuoi strappare l'intestino.

Si desidera consentire alle pinze di appoggiarsi delicatamente su entrambi i lati del dotto biliare comune. Ora troveremo una cistifellea e, una volta che la cistifellea è esposta, la useremo come guida per iniettare la collagenasi nel dotto biliare comune. Powell utilizza un ago calibro 30 con una siringa da cinque cc contenente tre macinazioni di soluzione di collagenasi.

Mentre entra nel dotto biliare comune, sta dilatando quel dotto con una soluzione di collagenasi e poi viaggia lungo il dotto biliare comune fino a raggiungere vicino all'intestino. E mentre sta scendendo, le soluzioni enzimatiche vengono pompate nel pancreas iniettato. Ora che il pancreas è stato gonfiato con una soluzione di collagenasi, Powell rimuoverà gli emostatici e poi rimuoverà il pancreas dal topo strappandolo via con cura dall'intestino.

Lo rimuove dallo stomaco. Ok, e poi usando la milza come maniglia, solleva il pancreas e poi lo taglia lentamente nel dotto biliare comune, e basta. Il pancreas viene steso e poi la milza viene rimossa, e lì si rimuove il tessuto mesoenterico, e poi il pancreas viene posto in una soluzione di collagenasi a due macinatori e una fiala di vetro sterilizzata e viene rimesso sul ghiaccio.

Il pancreas isolato che abbiamo messo nelle fiale di vetro sarà ora posto in un bagno d'acqua a 37 gradi per circa 17 minuti. Li abbiamo messi in una rastrelliera conica da 50 mil in modo che non galleggino. Una volta durante il bagno, il timer si avvia e inizia la digestione.

Una volta completato il tempo di digestione, le fiale vengono rimosse e quindi agitate e interrotte delicatamente. E una volta che il tessuto inizia a sfaldarsi, la fiala viene quindi posta sul ghiaccio. Un vaglio sterile viene posizionato su un becher da 400 mil che contiene un tampone di lavaggio.

Il digestato del pancreas viene quindi versato con cura sullo schermo nel tampone di lavaggio. A scopo dimostrativo, la cappa è stata spenta e il vetro della cappa è stato sollevato in modo da poter vedere cosa stiamo facendo. Una volta versato il digestato del pancreas nel becher, le fiale vengono risciacquate con lo stesso tampone di lavaggio e il tampone di lavaggio viene posizionato sopra lo schermo.

Abbiamo una siringa riempita con tampone di lavaggio. Lo useremo per lavare con forza il fazzoletto attraverso lo schermo. L'idea è quella di rilasciare eventuali occhielli allentati che non sono attaccati alla matrice, ma lasciando le membrane e il tessuto non digerito sullo schermo.

E quando hai finito di lavare un fazzoletto, questo è ciò che di solito vedi alla fine della procedura. Il tessuto del pancreas che si trova sul fondo del tubo verrà ora trasferito in due coniche da 50 mil e il tessuto verrà lavato, il tessuto verrà miscelato uniformemente e quindi distribuito uniformemente in modo da avere un volume di pellet uguale in ogni tubo. Il becher viene ora risciacquato con più tampone di lavaggio.

I lati vengono risciacquati in modo da far entrare nuovamente tutto il tessuto che è entrato nel becher. Quindi è equamente distribuito tra i due, entrambi 50 mil. I conici sono poi completati con tampone di lavaggio.

Il tessuto viene capovolto più volte e poi posto in una centrifuga. Questo è un giro veloce. La centrifuga viene lasciata raggiungere un migliaio di giri/min e poi viene spenta.

Il tessuto in questo momento è molto S gli occhielli sono molto sensibili e non si vuole compattarli eccessivamente. I tubi vengono rimossi e faremo questa fase di lavaggio altre tre volte. Questa è la fine del terzo lavaggio.

I componenti della provetta conica da 50 mil vengono trasferiti nella provetta conica da 15 e centrifugati per mille RP M e poi fermati. Il supernat verrà rimosso e verrà avviata la prima parte della chiamata FI. Siamo al punto in cui abbiamo il nostro pancreas pellettato digerito.

Rimetteremo in sospensione quel tessuto in modo che sia bello e sciolto per i pellet. Aggiungeremo il primo gradiente di densità, che è 1 1 0 8. Aggiungeremo cinque mil a ciascun tubo.

Il pellet viene quindi miscelato accuratamente in ciascuna delle sfumature. È importante ottenere una buona distribuzione dei tessuti nel gradiente più pesante. Ora sovrapporremo due mil di densità 1 0 9 6.

Quindi, oltre a ciò, sovrapporremo due mil di densità 1 0 6 9 e poi sopra quella densità 1 0 3 7. È importante mentre si stratificano le densità che non si mescolano. Quindi tutti gli strati sono stati aggiunti al tubo.

E potete vedere che questo è il massimo di 1 1 0 8, il massimo di 9 1 0 9 6, il massimo di 1 0 6 9 e il massimo di 1 0 3 7. E si può vedere che il tessuto sta già iniziando a muoversi verso la sua giusta densità anche senza la fusione dei centri. Le pendenze fiali vengono portate a velocità a 1800 giri/min per 15 minuti e ricordarsi di tenere il freno spento dopo aver rimosso le provette dalla centrifuga.

Puoi vedere tra lo strato 0 0 9 6 e 0 0 7, c'è una bella fascia di tessuto occhiello Pablo's. Ora rimuovendo lo strato 0, 3, 7 per rimuovere eventuali detriti di tessuto e DNA che potrebbero essere stati rilasciati durante l'elaborazione. Utilizzando una pipetta sterile di plastica per pascoli, rimuoverà ora lo strato di isole e le trasferirà in un conico da 50 mil contenente 25 mil di tampone di lavaggio.

Vuoi fare questo passaggio rapidamente perché fol è tossico per gli occhielli. In realtà abbiamo rimosso l'intero strato 0 6 9 e 0 9 6. Pavo taglia la parte superiore della pipetta di plastica per pascoli e la risciacqua con un tampone di lavaggio.

Gli occhielli vengono quindi centrifugati come centrifugavamo in precedenza. La centrifuga viene portata fino a mille giri/min e poi la fermiamo e aspiriamo. Gli occhielli surnatanti verranno lavati tre volte con mezzi di lavaggio.

Quindi abbiamo appena completato il processo di isolamento delle palpebre che abbiamo prelevato dal digest al gradiente di seguito agli occhielli purificati dopo il nostro terzo lavaggio con tampone di lavaggio, abbiamo risospeso gli occhielli nel nostro terreno RPMI e li abbiamo riprodotti in una piastra di coltura tissutale. Questi occhielli sono ora pronti per i saggi in vitro o per le preparazioni in vivo come il trapianto di occhielli.