Name: Murino pancreatica isolamento Islet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Impara l'isolamento delle isole pancreatiche murine mediante iniezione di collagenasi, digestione enzimatica e purificazione su gradiente Ficoll. Questo metodo consente di ottenere isole vitali per trapianti nel trattamento del diabete.

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Collagenasi Preparazione <ol><li> Pesare la collagenasi in un buffer 50 isolamento ml e aggiungere per rendere la concentrazione finale, come indicato nella tabella sottostante. Sciogliere il collagenasi vortexando. (12 + 2 topi topi topi in più = 14 x 5 ml / mouse = 70 ml di soluzione di collagenasi totale) (70 ml x 0,5 mg / ml o 0,3 mg / ml = 35 mg o 21 mg del totale collagenasi P) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tensione </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Età </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Collagenasi P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Tempo (min) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 settimane </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 settimane </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NON </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 settimane </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR, NON </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 settimane </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Dispensare 2 ml di soluzione di collagenasi in ogni fiala di vetro e posto sul ghiaccio. Caricare ogni siringa da 5 ml con 3 ml di aghi 30g collagenasi aggiungere e mettere in ghiaccio (la preparazione in cappa). </li></ol> Dilatazione <ol><li> Poco prima dissezione, sacrificio animale per dislocazione cervicale. Spruzzare tutto il corpo con il 70% dei ETOH, rendendolo completamente bagnato. Fare un V-Insision a partire dalla zona genitale. Ruotare il mouse in modo la coda è rivolto verso di voi. </li><li> Rimuovere l&#39;intestino verso il lato sinistro del mouse aperta. Questo esporrà il pancreas e del dotto biliare comune. </li><li> Posizionare una pinza emostatica su entrambi i lati del piccolo-intestinale, dove il dotto biliare fognature, lasciando una piccola tasca per soluzione collagenasi entrare l&#39;intestino. </li><li> Gonfiare il pancreas attraverso il dotto biliare con un ago 30g e siringa da 5 ml contenente 3 ml di soluzione di collagenasi a freddo, a partire dalla cistifellea. </li><li> Rimuovere il pancreas dal corpo e posizionarlo in un flaconcino siliconata contenente 2 ml di soluzione di collagenasi. Questo passo dovrebbe essere fatto rapidamente e in modo pulito possibile, riducendo al minimo la raccolta di grasso e tessuto connettivo. </li><li> Posizionare il flaconcino su ghiaccio e ripetere il passo 3 con il mouse successiva. </li></ol> Digestione <ol><li> Sigillare ogni fiala e collocarlo in un 37 ° C bagnomaria. Incubare per 13-17 minuti (il tempo varia con sforzo e l&#39;età dell&#39;animale). </li><li> Dopo il tempo è trascorso, agitare il flacone energicamente. Il pancreas dovrebbe cadere a pezzi. </li><li> Versare ogni digestione attraverso un colino grande dissipatore di sterile in un bicchiere da 1000 ml, sterile e con forza pipetta fuori dallo schermo con il tampone di lavaggio. Erogare il digerisce in 50 ml provette conicals (3 pancreata/50 tubo ml: se n = 12, basta utilizzare il tampone di lavaggio per rendere il volume finale 200 ml e dispensare a tubi 4x50 ml). La diluizione deve essere fatta rapidamente e in ghiaccio per evitare indesiderate digestione isolotto. </li><li> Spin down: Avviare la centrifuga. Quando raggiunge 1300 rpm, spegnerlo. </li><li> Aspirare il sopranatante, lasciando ~ 5 ml. Essere molto cauti a non aspirare il pellet. </li><li> Risospendere le sfere toccando vigorosamente con la mano, poi aggiungere 50 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Spin down: Avviare la centrifuga. Quando raggiunge 1300 rpm, spegnerlo. </li><li> Risospendere il pellet e lavare con 5 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Trasferire il 5 ml a 15 ml e spin down, come sopra. </li><li> Aspirare il surnatante modo più completo possibile. (Buffer rimanente potrebbe causare la variazione della densità del Ficoll). </li></ol> Ficoll Eseguire rapidamente. Esposizione a lungo termine Ficoll è tossico per gli isolotti. <ol><li> Assicurarsi pellet è completamente rotto prima di aggiungere Ficoll (tessuto ininterrotta è difficile da risospendere in Ficoll). </li><li> Risospendere il pellet in 7 ml di Ficoll, densità 1,108, vortexando vigorosamente. </li><li> Strati l&#39;uno sopra l&#39;densità di Ficoll 2 ml di ciascuna delle densità rimanenti in questo ordine: 1,096, 1,069, quindi 1,037. </li><li> Spin per 15 minuti a 1800 rpm a 4 gradi, con pausa OFF! </li><li> Scegli isolotti del secondo livello utilizzando spoid (sterili pcontagocce Lastic). Trasferire tutte le collezioni ad una conica da 50 ml contenente circa 25 ml di tampone a freddo. </li><li> Lavare, come sopra, 3 volte con tampone di lavaggio (ripetendo il passaggio 12-15). </li><li> Isolotti Risospendere in 20 ml di RPMI-1640 (contenente 10% FCS e la penicillina e la streptomicina, HEPES, MEM-NEAA) e mescolare delicatamente. Rimuovere 100 ul di campione per il conteggio. </li><li> Trasferire 100 ul a 35 mm Griglia piastra contenente 1 ml di media e 1 ditizone ml. </li><li> Incubare isolotti rimanenti in RPMI 1640, a 37 ° C, 7% di CO 2 incubatore, in 160 piastre mm con un totale di 30 ml di media / piastra. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="220" height="194" /></li></ol>

murino pancreatica isolamento islet

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murino pancreatica isolamento Islet

Ciao, sono Greg Zott. Lavoro presso il Centro per il Diabete dell'UCSF, nel laboratorio di Bluestone, e oggi vi mostrerò il procedimento per isolare le isole pancreatiche di topo. Il protocollo prevede l'iniezione di una soluzione di collaghenasi nel pancreas di un topo donatore C3H, quindi l'asportazione del pancreas, la sua digestione, la purificazione delle isole su un gradiente di Ficoll, e infine la selezione manuale delle isole per il trapianto finale nella capsula renale di un topo NOD diabetico, che fungerà da ricevente.Prima di iniziare questa procedura, abbiamo diluito la nostra soluzione ATE in un buffer di Hanks modificato e abbiamo aggiustato la concentrazione specifica per la linea di topo che stiamo utilizzando, la C3 H. Abbiamo riscontrato un migliore digestione con una soluzione di collaghenasi a 0,8 mg per ml, e utilizzeremo questa per iniettare nel dotto biliare comune al fine di distendere il pancreas. La procedura di oggi sarà eseguita da Pavo Codre del centro per il diabete. Egli effettuerà l'iniezione, aprirà il topo, esporrà l'intestino e quindi inietterà nel dotto biliare comune.Tratteremo il topo con etanolo per appiattirne il pelo, quindi verificheremo anche che il topo sia stato sacrificato correttamente mediante una compressione del dito del piede. Pavo ora aprirà il topo ed esporrà l'intestino e il pancreas mediante un'incisione mediana. Il diaframma verrà inoltre reciso per confermare che il topo sia stato sacrificato.Prima di iniziare, vorrei evidenziare alcune delle strutture importanti. Lo stomaco si trova proprio qui, con il pancreas attaccato al di sotto e al di sopra del duodeno. Questo è il fegato, dove troveremo la cistifellea e il dotto biliare comune, che potete vedere proprio qui.Quello che Pavo farà successivamente è isolare l'intestino tenue e individuare il punto in cui il dotto biliare comune entra nell'intestino tenue. Una volta esposto l'intestino, applichiamo clampi a forbice da entrambi i lati del dotto biliare comune. Abbiamo riscontrato che questo metodo permette a un maggior numero di collagenasi di entrare nel pancreas, mentre altri gruppi cercano di posizionare il clamp direttamente sul dotto biliare comune.Abbiamo constatato che questa è una tecnica migliore per consentire all'enzima di entrare nel pancreas. Si tratta di una procedura delicata. Non si deve lacerare l'intestino.Si desidera posizionare delicatamente le pinze su entrambi i lati del dotto biliare comune. Ora individueremo la cistifellea e, una volta esposta, la utilizzeremo come guida per iniettare la collagenasi nel dotto biliare comune. Powell utilizza un ago da 30 gauge con una siringa da cinque cc contenente tre millilitri di soluzione di collagenasi.Mentre entra nel dotto biliare comune, dilata tale dotto con soluzione di collaghenasi, quindi procede lungo il dotto biliare comune finché non raggiunge la zona vicina all'intestino. E mentre procede in basso, la soluzione enzimatica viene pompata e iniettata nel pancreas. Ora che il pancreas è gonfio con la soluzione di collaghenasi, Powell rimuoverà i forceps emostatici e quindi asporterà il pancreas dal topo, staccandolo con cura dall'intestino.Lo rimuove dallo stomaco. Ok, quindi utilizzando la milza come maniglia, solleva il pancreas e poi lo stacca lentamente dal dotto biliare comune, e questo è tutto. Il pancreas viene disteso, quindi la milza viene rimossa; ora sta eliminando il tessuto mesenterico, dopodiché il pancreas viene posto in una soluzione di collagenasi 2 mill e in un vial di vetro sterilizzato, e infine rimesso sul ghiaccio.Il pancreas isolato che abbiamo inserito nei vial di vetro verrà ora posto in un bagno d'acqua a 37 gradi per circa 17 minuti. Li abbiamo posizionati su un supporto conico da 50 ml in modo che non galleggino. Non appena inizia il bagno, si attiva il timer e inizia la digestione.Una volta terminato il tempo di digestione, i vialli vengono rimossi, quindi agitati e sottoposti a una leggera disgregazione. E una volta che il tessuto inizia a disfarsi, il viallo viene quindi posto sul ghiaccio. Viene posizionata una rete sterile sopra un becher da 400 mil che contiene il buffer di lavaggio.Il digestato del pancreas viene quindi versato con attenzione sul setaccio nel buffer di lavaggio. A scopo dimostrativo, la cappa è stata spenta e il vetro della cappa è stato alzato in modo da poter vedere ciò che stiamo facendo. Una volta versato il digestato del pancreas nel becher, le provette vengono risciacquate con lo stesso buffer di lavaggio e il buffer di lavaggio viene posto sul setaccio.Abbiamo una siringa riempita con tampone di lavaggio. Useremo questa per lavare energeticamente il tessuto attraverso il setaccio. L'idea è quella di rilasciare eventuali anelli liberi non attaccati alla matrice, lasciando invece sul setaccio le membrane e il tessuto non digerito.E quando hai terminato di lavare un tessuto, questo è ciò che di solito si osserva alla fine della procedura. Il tessuto pancreatico presente sul fondo del tubo verrà ora trasferito in due conici da 50 ml, il tessuto verrà lavato, mescolato uniformemente e quindi distribuito in modo omogeneo in modo da ottenere un volume di pellet uguale in ciascun tubo. Il becher viene ora risciacquato con ulteriore tampone di lavaggio.I lati vengono risciacquati in modo da recuperare tutto il tessuto finito nuovamente nel becher. Successivamente, il campione viene distribuito equamente tra due provette, entrambe da 50 ml. Le provette vengono quindi portate a volume con buffer di lavaggio.Il tessuto viene capovolto più volte e quindi inserito in una centrifuga. Si tratta di una breve centrifugazione. Si permette alla centrifuga di raggiungere mille giri al minuto, dopodiché viene spenta.In questo momento il tessuto è molto sensibile e gli occhielli sono molto delicati, quindi è importante non compattarli eccessivamente. I tubi vengono rimossi e si ripete questo passaggio di lavaggio altre tre volte. Questo è il termine del terzo lavaggio.I componenti del tubo conico da 50 ml vengono trasferiti nel tubo conico da 15 ml e centrifugati a mille giri al minuto, quindi fermati. Il soprannatante verrà rimosso e si inizierà la prima parte della FI Call. Siamo arrivati al passaggio in cui abbiamo il pellet del digestato di pancreas.Risospenderemo il tessuto in modo che risulti ben sciolto rispetto ai pellet. Aggiungeremo il primo gradiente di densità, ovvero 1 1 0 8. Aggiungeremo cinque mil a ogni provetta.Il pellet viene quindi mescolato accuratamente in ciascuno dei gradienti. È importante ottenere una buona distribuzione del tessuto nel gradiente più denso. Ora stratificheremo due millilitri di densità 1 0 9 6.Successivamente, aggiungeremo uno strato di due mils di densità 1 0 6 9, e sopra a questo uno strato di densità 1 0 3 7. È importante che, durante l'aggiunta delle densità, non si verifichi mescolamento. A questo punto, tutti gli strati sono stati aggiunti al tubo.E si può notare che questa è la parte superiore di 1 1 0 8, la parte superiore di 9 1 0 9 6, la parte superiore di 1 0 6 9 e la parte superiore di 1 0 3 7. Si può osservare che il tessuto ha già iniziato a migrare verso la propria densità corretta, anche senza la centrifugazione. I gradienti in fiala vengono portati a regime a 1800 giri/min per 15 minuti e ricordare di mantenere il freno disattivato dopo aver rimosso le provette dalla centrifuga.Si può osservare tra il livello 0 0 9 6 e il livello 0 0 7 una bella banda di tessuto degli isolotti di Pablo. Ora viene rimosso il livello 0 3 7 per eliminare eventuali detriti tessutali e DNA che potrebbero essere stati rilasciati durante l'elaborazione. Utilizzando una pipetta Pasteur in plastica sterile, provvederà ora a rimuovere il livello degli isolotti e a trasferirlo in un tubo conico da 50 ml contenente 25 ml di tampone di lavaggio.È necessario eseguire questo passaggio rapidamente perché il fol è tossico per gli occhielli. In realtà abbiamo rimosso l'intero strato 0 6 9 e 0 9 6. Pavo taglia la parte superiore della pipetta in plastica per pascolo e la risciacqua con il buffer di lavaggio.I capillari vengono quindi centrifugati come abbiamo fatto in precedenza. La centrifuga viene portata a mille giri al minuto, poi viene fermata ed eseguiamo l'aspirazione. I capillari del soprannatante verranno lavati tre volte con il mezzo di lavaggio.Abbiamo appena completato il processo di isolamento delle palpebre: siamo passati dalla digestione al gradiente di fol al campione purificato di occhielli, dopo il terzo lavaggio con tampone di lavaggio. Abbiamo quindi risospeso gli occhielli nel nostro mezzo RPMI e li abbiamo trasferiti in una piastra per colture cellulari. Questi occhielli sono ora pronti per saggi in vitro o preparazioni in vivo, come il trapianto di occhielli.

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Impara l'isolamento delle isole pancreatiche murine mediante iniezione di collagenasi, digestione enzimatica e purificazione su gradiente Ficoll. Questo metodo consente di ottenere isole vitali per trapianti nel trattamento del diabete.

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