PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

La tecnica di PCR digitale basata su chip suddivide una singola reazione nelle camere di un chip nanofluidico. L'amplificazione delle sequenze partizionate consente il rilevamento di rare varianti di trascritto, trascritti non canonici che si verificano a bassa frequenza.

Per iniziare, prelevare un campione contenente cDNA della variante rara del trascritto target e della variante comune. Aggiungere una soluzione contenente DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer.

Aggiungete sonde oligonucleotidiche specifiche per varianti di trascrizione comuni e rare, marcate con diversi reporter fluorescenti e molecole di quencher. Il quencher assorbe la fluorescenza del reporter quando si trova nelle immediate vicinanze.

Caricare la miscela sul chip nanofluidico. La soluzione è suddivisa in nanocamere di dimensioni uniformi. Ogni camera contenente un cDNA funge da recipiente di reazione indipendente.

Avviare il processo di ciclo termico. Un'elevata temperatura di denaturazione separa il DNA a doppio filamento in singoli filamenti. Abbassare la temperatura, consentendo ai primer e alle sonde oligonucleotidiche di ricuocere le regioni complementari sui singoli filamenti di DNA.

Aumentare la temperatura per raggiungere la fase di estensione, dove la DNA polimerasi estende il primer e fende la sonda. La distanza dal quencher consente l'emissione di fluorescenza del reporter. Leggi il segnale di fluorescenza.

Crea un grafico a dispersione che raffiguri le camere con il bersaglio della trascrizione rara amplificato e le camere prive del bersaglio. Segnali positivi per il target indicano la presenza della variante rara-trascrizione nel campione.

Per iniziare, lasciare scongelare la miscela master e il saggio a temperatura ambiente per almeno 20 minuti. Quindi, caricare provette da 0,5 millilitri con aliquote da 6 microlitri dei campioni di cDNA. Inoltre, crea un tubo di controllo senza modello. Quindi, agitare delicatamente la miscela master e aliquotare 8,7 microlitri per reazione in una provetta sterile.

Quindi, per ogni reazione, aggiungere 0,87 microlitri del primer per test personalizzato e aggiungere 1,83 microlitri di acqua priva di nucleasi. Mescolare delicatamente la combinazione e trasferire 11,4 microlitri in ciascuna provetta contenente cDNA e nel controllo senza stampo. Quindi, mescolare delicatamente le provette e raggruppare il contenuto delle provette utilizzando la centrifugazione a impulsi. Per risultati ottimali, caricare i chip il prima possibile.

Collegare il caricatore di trucioli e attendere che la spia diventi verde. Quindi, preparare la siringa del fluido da immersione tirando delicatamente lo stantuffo da 1 a 2 millimetri, quindi rimuovere il tappo e aggiungere la punta.

Successivamente, prendi nota del codice scritto sul coperchio di un nuovo chip, quindi, tieni con cura il coperchio di lato, stacca la pellicola protettiva e posizionalo nel nido del coperchio con il lato adesivo rivolto verso l'alto. Ora, premi la leva per aprire il morsetto e carica con cura il truciolo nel nido di trucioli.

Quindi, inserire una nuova lama di caricamento nel caricatore. Spingerlo delicatamente per assicurarsi che sia saldamente in posizione. A questo punto, trasferire 14,5 microlitri di miscela di reazione sulla lama di caricamento. Non creare bolle d'aria e non deviare la lama. Quindi, premi il pulsante nero "Caricamento" per distribuire il volume sul chip.

È importante verificare che la lama di caricamento sia in posizione. Quindi, durante il riempimento della lama, non premere la pipetta fino al secondo arresto per evitare di introdurre bolle. Inoltre, non deviare la lama con la punta.

Procedere con la siringa per trasferire circa 20 gocce di liquido di immersione sulla superficie del truciolo. Fare attenzione a non toccare la superficie con la punta, e coprire completamente la superficie senza traboccare. Quindi, ruotare il braccio del rotore per far entrare il coperchio in contatto con il chip e premere per 15 secondi. Quindi, premere il pulsante del coperchio per rilasciare il truciolo e riportare il braccio del caricatore in posizione di riposo. Ora, apri il morsetto e tieni il chip assemblato a un angolo di 45 gradi per erogare con cura il fluido di immersione attraverso la porta di riempimento tramite una siringa. Quindi, ruota leggermente il chip per rimuovere le bolle d'aria, quindi rimuovi il liquido in eccesso con la salvietta sterile.

Evitare di versare il liquido di immersione sul bordo della punta. In tal caso, rimuovere con cura l'eccesso prima di sigillare.

Infine, sigilla la custodia dei chip staccando delicatamente l'etichetta sul coperchio, quindi bloccando la porta di riempimento per almeno 5 secondi. Ora, usa il chip entro due ore e, fino ad allora, conservalo al buio.

Per impostare la reazione, aprire il coperchio e installare gli adattatori su entrambi i blocchi, anche quando si utilizza un singolo blocco. Quindi, posizionare un chip sui blocchi campione e orientare le sue porte di riempimento verso la parte anteriore del termociclatore e sollevare leggermente la porta. Usa le fiches vuote per bilanciare i due blocchi.

Quindi, appoggia il pad termico sulla configurazione per coprire completamente i chip. Quindi, programmare i cicli, chiudere il coperchio e avviare la reazione.

Al termine della reazione, spegnere il termociclatore, rimuovere i pad termici e quindi rimuovere i chip. Lasciate scongelare le patatine a temperatura ambiente per almeno 10 minuti al buio e analizzatele entro un'ora. Pulire la superficie del truciolo con isopropanolo mentre lo si ispeziona per verificare la presenza di perdite o altri problemi.

Per salvare i dati, inserire una chiavetta USB nel sistema di rilevamento dove è possibile salvare i dati. Quindi, aprire il vassoio dei trucioli del sistema di rilevamento e caricare il chip a faccia in su. Chiudere il vassoio e attendere 30 secondi per l'elaborazione dei dati. Quindi, rimuovere il chip e ripetere il processo per il chip successivo.

Quindi, sposta la chiavetta USB dal rilevatore a un computer e trasferisci i file. Apri il software basato su cloud, quindi crea un progetto e importa tutti i file di dati per i chip di interesse. Quindi, nella scheda "Chip definiti", selezionare il colorante e il test utilizzati. Determina se il chip è accettabile visualizzandolo nella scheda "Rivedi dati". Se il campione è stato caricato bene, dovrebbero essere utilizzabili almeno 13.000 punti.

Quindi, guarda il grafico a dispersione per la selezionata. Lì, applicare una soglia definita dal tipo di saggio. Per il segnale del colorante reporter fluoresceina amidite, utilizzare una soglia di 6.000. Ora, rimuovi tutti i segnali dubbi che potrebbero portare a falsi positivi. Selezionare il punto discutibile sul grafico a dispersione utilizzando lo strumento "Lazo" e selezionare l'opzione "Indeterminato".

Tutti i restanti punti positivi indicano la presenza di copie di cDNA del raro bersaglio analizzato.