PCR digitale basata su chip per rilevare rare varianti di trascritto utilizzando un chip nanofluidico

La tecnica di PCR digitale basata su chip suddivide una singola reazione nelle camere di un chip nanofluidico. L'amplificazione delle sequenze partizionate consente il rilevamento di rare varianti di trascritto, trascritti non canonici che si verificano a bassa frequenza.

Per iniziare, prelevare un campione contenente cDNA della variante rara del trascritto target e della variante comune. Aggiungere una soluzione contenente DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer.

Aggiungete sonde oligonucleotidiche specifiche per varianti di trascrizione comuni e rare, marcate con diversi reporter fluorescenti e molecole di quencher. Il quencher assorbe la fluorescenza del reporter quando si trova nelle immediate vicinanze.

Caricare la miscela sul chip nanofluidico. La soluzione è suddivisa in nanocamere di dimensioni uniformi. Ogni camera contenente un cDNA funge da recipiente di reazione indipendente.

Avviare il processo di ciclo termico. Un'elevata temperatura di denaturazione separa il DNA a doppio filamento in singoli filamenti. Abbassare la temperatura, consentendo ai primer e alle sonde oligonucleotidiche di ricuocere le regioni complementari sui singoli filamenti di DNA.

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