Generazione di particelle simili al virus Chikungunya utilizzando il sistema di espressione del baculovirus nelle cellule di insetti

Le particelle simili al virus Chikungunya, VLP, sono strutture non infettive composte da proteine dell'involucro virale incorporate all'interno di un doppio strato lipidico e prive di materiale genetico.

Per produrre VLP di Chikungunya, infettare le cellule di insetto Sf9 di Spodoptera frugiperda con baculovirus ricombinanti che esprimono una cassetta genica strutturale di Chikungunya. La cassetta è costituita da un promotore di baculovirus fuso con geni strutturali della chikungunya che codificano per il capside e proteine dell'involucro.

Durante l'incubazione, le glicoproteine dell'involucro del baculovirus si legano ai recettori di superficie sulle cellule dell'insetto. Ciò facilita l'ingresso e il rilascio del DNA virale nel citoplasma del baculovirus, generando poliproteine contenenti proteine del capside e dell'involucro della chikungunya.

Dopo la sintesi, la scissione autocatalitica della proteina del capside produce la poliproteina precursore che possiede proteine dell'involucro nel reticolo endoplasmatico, ER. Nel lume dell'ER, gli enzimi scindono la poliproteina precursore, generando singole proteine che entrano nel compartimento del Golgi per un'ulteriore elaborazione, formando eterotrimeri proteici.

Le proteasi residenti nel Golgi scindono gli eterotrimeri proteici, producendo proteine dell'involucro maturo con proteine E2 ed E1. Queste proteine dell'involucro traslocano sulla membrana, gemendo in VLP e rilasciando nel mezzo.

Trasferire la coltura infetta in una provetta e centrifugare per pellettare le cellule dell'insetto. Aspirare il surnatante contenente VLP e filtrarlo per rimuovere i detriti.

Il filtrato risultante, contenente VLP di chikungunya, è pronto per studi di immunopatologia.

Coltura di Spodoptera frugiperda, o cellule Sf9, precedentemente preparate in sospensione in palloni rotanti agitando continuamente a 130 giri/min su un sistema di piastre di agitazione multipunto. Mantenere i volumi di coltura a non più della metà del volume del pallone per una corretta aerazione. Successivamente, esprimere le VLP CHIK infettando 250 millilitri di cellule Sf9 in un pallone rotante a una densità di 2 x 10⁶ cellule per millilitro con baculovirus ricombinante precedentemente preparato e riportare le cellule in un incubatore a 28 gradi Celsius.

Utilizzare l'esclusione del blu di tripano per determinare se la vitalità cellulare è diminuita dal 70% all'80%. Dopo la conferma, trasferire le colture direttamente dalla sospensione in provette coniche da 50 millilitri e far girare le cellule verso il basso. Raccogli i surnatanti e filtrali attraverso una membrana porosa da 0,22 micron prima della sedimentazione.