Rilevamento del legame della vitronectina alle superfici batteriche mediante citometria a flusso

Prelevare provette per citometro a flusso contenenti ceppi wild-type e mutanti di Haemophilus influenzae, tipo f.

Pipettare un tampone contenente proteine bloccanti e vitronectina. Incubare.

Le proteine bloccanti riducono le interazioni non specifiche sulla superficie batterica, mentre le molecole di vitronectina si legano alla proteina H, una proteina legante la vitronectina, sulle superfici batteriche wild-type. Nel ceppo mutante, la vitronectina non si lega a causa dell'assenza della proteina H.

centrifuga. Rimuovere la vitronectina non legata e le proteine bloccanti.

Aggiungere un tampone contenente anticorpi primari anti-vitronectina, che si legano specificamente alla vitronectina attaccata alle superfici batteriche wild-type.

Successivamente, introdurre gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo, che si legano agli anticorpi primari sulla vitronectina e facilitano il rilevamento della vitronectina.

centrifuga. Rimuovere gli anticorpi secondari non legati. Risospendere i batteri nel tampone.

Eseguire la citometria a flusso per determinare il legame della vitronectina alla superficie batterica.

Confronta i segnali di fluorescenza dei ceppi wild-type e mutanti. Uno spostamento del segnale di fluorescenza nei batteri wild-type conferma il legame della vitronectina alla superficie batterica.

Per prepararsi alla citometria a flusso, risospendere i pellet batterici con 50 microlitri di tampone bloccante contenente 250 vitronectina nanomolare. Quindi, incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente senza agitare. Dopo l'incubazione, pellettare i batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 5 minuti. Quindi lavare i pellet tre volte utilizzando PBS e fasi di centrifugazione simili.

Dopo il lavaggio, aggiungere 50 microlitri di anticorpi policlonali anti-vitronectina umana primaria di pecora al pellet batterico, con una diluizione da 1 a 100 in PBS/BSA. Incubare la sospensione per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non legati.

Successivamente, aggiungere al pellet 50 microlitri di anticorpi policlonali anti-pecora d'asino coniugati con isotiocianato di fluoresceina. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Infine, dopo tre fasi di lavaggio, risospendere il pellet batterico con 300 microlitri di PBS e analizzare mediante citometria a flusso.