Rilevamento del legame della vitronectina alle superfici batteriche mediante citometria a flusso

Prelevare provette per citometro a flusso contenenti ceppi wild-type e mutanti di Haemophilus influenzae, tipo f.

Pipettare un tampone contenente proteine bloccanti e vitronectina. Incubare.

Le proteine bloccanti riducono le interazioni non specifiche sulla superficie batterica, mentre le molecole di vitronectina si legano alla proteina H, una proteina legante la vitronectina, sulle superfici batteriche wild-type. Nel ceppo mutante, la vitronectina non si lega a causa dell'assenza della proteina H.

centrifuga. Rimuovere la vitronectina non legata e le proteine bloccanti.

Aggiungere un tampone contenente anticorpi primari anti-vitronectina, che si legano specificamente alla vitronectina attaccata alle superfici batteriche wild-type.

Successivamente, introdurre gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo, che si legano agli anticorpi primari sulla vitronectina e facilitano il rilevamento della vitronectina.

centrifuga. Rimuovere gli anticorpi secondari non legati. Risospendere i batteri nel tampone.

Eseguire la citometria a flusso per determinare il legame della vitronectina alla superficie batterica.

Confronta i segnali di fluorescenza dei ceppi wild-type e mutanti. Uno spostam