JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:22 min. • July 8th, 2025
Prendi una miscela di un RNA CRISPR, o crRNA, e un crRNA o tracrRNA trans-attivante.
Scaldare la miscela e lasciarla raffreddare, facilitando l'accoppiamento di basi del tracrRNA con il crRNA per formare un RNA guida, o gRNA.
Aggiungi forbici molecolari chiamate enzimi Cas9 che si legano al gRNA, creando complessi.
Aggiungere i complessi Cas9-gRNA alle cellule Natural Killer o NK sospese in una soluzione di elettroporazione.
Introdurre molecole di DNA a filamento singolo che aiutano a trasportare i complessi Cas9-gRNA.
Trasferire la miscela in una cuvetta ed eseguire l'elettroporazione, creando pori temporanei nella membrana per consentire ai complessi di entrare nella cellula.
Il gRNA si lega al sito bersaglio nel genoma, consentendo a Cas9 di scindere il DNA.
Le proteine di riparazione si legano al sito di rottura e si uniscono al DNA, causando spesso errori di inserimento o delezione di coppie di basi. La modifica risultante interrompe il gene bersaglio, rendendolo non funzionale.
Trasferire le cellule geneticamente modificate in un terreno adatto per ulteriori analisi.
Il giorno dell'elettroporazione, riempire un pallone T25 con 8 millilitri di terreno di coltura fresco integra
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici