Una tecnica per l'editing genetico nelle cellule natural killer utilizzando CRISPR Cas9

Prendi una miscela di un RNA CRISPR, o crRNA, e un crRNA o tracrRNA trans-attivante.

Scaldare la miscela e lasciarla raffreddare, facilitando l'accoppiamento di basi del tracrRNA con il crRNA per formare un RNA guida, o gRNA.

Aggiungi forbici molecolari chiamate enzimi Cas9 che si legano al gRNA, creando complessi.

Aggiungere i complessi Cas9-gRNA alle cellule Natural Killer o NK sospese in una soluzione di elettroporazione.

Introdurre molecole di DNA a filamento singolo che aiutano a trasportare i complessi Cas9-gRNA.

Trasferire la miscela in una cuvetta ed eseguire l'elettroporazione, creando pori temporanei nella membrana per consentire ai complessi di entrare nella cellula.

Il gRNA si lega al sito bersaglio nel genoma, consentendo a Cas9 di scindere il DNA.

Le proteine di riparazione si legano al sito di rottura e si uniscono al DNA, causando spesso errori di inserimento o delezione di coppie di basi. La modifica risultante interrompe il gene bersaglio, rendendolo non funzionale.

Trasferire le cellule geneticamente modificate in un terreno adatto per ulteriori analisi.

Il giorno dell'elettroporazione, riempire un pallone T25 con 8 millilitri di terreno di coltura fresco integrato con 100 UI per millilitro di IL-2 per condizione di cella sperimentale e posizionare i palloni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂

Mentre il terreno è in equilibrio, aggiungere da 3 a 4 x 10⁶ cellule per condizione, per 26 microlitri di miscela di trasduzione in una provetta conica e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Quindi, lavare le cellule tre volte in 12 millilitri di PBS sterile per lavaggio per rimuovere tutto l'FBS dalle sospensioni cellulari.

Mentre le cellule vengono lavate, risospendere ciascun RNA CRISPR e RNA tracciante a concentrazioni finali di 200 micromolari. Mescolare 2,2 microlitri di ciascun RNA CRISPR con un volume di 200 micromolari di RNA tracciante per campione e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente e conservare i complessi RNA CRISPR - RNA tracciante a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al loro utilizzo.

Per formare i complessi ribonucleoproteici, aggiungere l'endonucleasi Cas9 al corrispondente complesso CRISPR RNA - RNA tracciante appropriato con vortice in 30-60 secondi e incubare i complessi ribonucleoproteici Cas9 risultanti a temperatura ambiente per 15-20 minuti.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere l'intero volume di integratore di elettroporazione del kit Nucleofector solution P3 e risospendere ogni pellet cellulare in 20 microlitri della soluzione primaria P3 4D-Nucleofector, facendo attenzione a evitare bolle d'aria.

Aggiungere immediatamente 5 microlitri di ciascun complesso ribonucleoproteico alla sospensione cellulare appropriata e aggiungere 1 microlitro di potenziatore di elettroporazione Cas9 da 100 micromolari alla miscela cellulare del complesso ribonucleoproteico Cas9. Trasferire 26 microlitri della soluzione di cellule ribonucleoproteiche Cas9 nei singoli pozzetti di una striscia di nucleocuvetta e picchiettare delicatamente la striscia per assicurarsi che i campioni coprano il fondo di ciascun pozzetto.

Quindi, avviare il programma EN-138 del sistema 4D-Nucleofector. Al termine della trasduzione, lasciare riposare le cellule per tre minuti. Quindi, aggiungere 80 microlitri di terreno di coltura pre-bilanciato a ciascuna cuvetta e trasferire delicatamente i campioni in un pallone per condizione a un'incubazione di 37 gradi Celsius.