Una tecnica per l'editing genetico nelle cellule natural killer utilizzando CRISPR Cas9
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 4:22 min • July 8th, 2025
Prendi una miscela di un RNA CRISPR, o crRNA, e un crRNA o tracrRNA trans-attivante.
Scaldare la miscela e lasciarla raffreddare, facilitando l'accoppiamento di basi del tracrRNA con il crRNA per formare un RNA guida, o gRNA.
Aggiungi forbici molecolari chiamate enzimi Cas9 che si legano al gRNA, creando complessi.
Aggiungere i complessi Cas9-gRNA alle cellule Natural Killer o NK sospese in una soluzione di elettroporazione.
Introdurre molecole di DNA a filamento singolo che aiutano a trasportare i complessi Cas9-gRNA.
Trasferire la miscela in una cuvetta ed eseguire l'elettroporazione, creando pori temporanei nella membrana per consentire ai complessi di entrare nella cellula.
Il gRNA si lega al sito bersaglio nel genoma, consentendo a Cas9 di scindere il DNA.
Le proteine di riparazione si legano al sito di rottura e si uniscono al DNA, causando spesso errori di inserimento o delezione di coppie di basi. La modifica risultante interrompe il gene bersaglio, rendendolo non funzionale.
Trasferire le cellule geneticamente modificate in un terreno adatto per ulteriori analisi.
Il giorno dell'elettroporazione, riempire un pallone T25 con 8 millilitri di terreno di coltura fresco integrato con 100 UI per millilitro di IL-2 per condizione di cella sperimentale e posizionare i palloni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di CO2
.Mentre il terreno è in equilibrio, aggiungere da 3 a 4 x 106 cellule per condizione, per 26 microlitri di miscela di trasduzione in una provetta conica e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Quindi, lavare le cellule tre volte in 12 millilitri di PBS sterile per lavaggio per rimuovere tutto l'FBS dalle sospensioni cellulari.
Mentre le cellule vengono lavate, risospendere ciascun RNA CRISPR e RNA tracciante a concentrazioni finali di 200 micromolari. Mescolare 2,2 microlitri di ciascun RNA CRISPR con un volume di 200 micromolari di RNA tracciante per campione e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente e conservare i complessi RNA CRISPR - RNA tracciante a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al loro utilizzo.
Per formare i complessi ribonucleoproteici, aggiungere l'endonucleasi Cas9 al corrispondente complesso CRISPR RNA - RNA tracciante appropriato con vortice in 30-60 secondi e incubare i complessi ribonucleoproteici Cas9 risultanti a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere l'intero volume di integratore di elettroporazione del kit Nucleofector solution P3 e risospendere ogni pellet cellulare in 20 microlitri della soluzione primaria P3 4D-Nucleofector, facendo attenzione a evitare bolle d'aria.
Aggiungere immediatamente 5 microlitri di ciascun complesso ribonucleoproteico alla sospensione cellulare appropriata e aggiungere 1 microlitro di potenziatore di elettroporazione Cas9 da 100 micromolari alla miscela cellulare del complesso ribonucleoproteico Cas9. Trasferire 26 microlitri della soluzione di cellule ribonucleoproteiche Cas9 nei singoli pozzetti di una striscia di nucleocuvetta e picchiettare delicatamente la striscia per assicurarsi che i campioni coprano il fondo di ciascun pozzetto.
Quindi, avviare il programma EN-138 del sistema 4D-Nucleofector. Al termine della trasduzione, lasciare riposare le cellule per tre minuti. Quindi, aggiungere 80 microlitri di terreno di coltura pre-bilanciato a ciascuna cuvetta e trasferire delicatamente i campioni in un pallone per condizione a un'incubazione di 37 gradi Celsius.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per modificare geneticamente le cellule Natural Killer (NK) mediante la tecnologia CRISPR. Il processo prevede la formazione di complessi di RNA guida e Cas9, seguita da elettroporazione per introdurre tali complessi nelle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria genetica
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- La tecnologia CRISPR consente una modifica precisa del genoma.
- Le cellule Natural Killer svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria.
- L'elettroporazione è una tecnica utilizzata per aumentare la permeabilità della membrana cellulare.
- L'RNA guida è essenziale per indirizzare Cas9 alla sequenza di DNA bersaglio.
Scopo dello studio
- Dimostrare il processo di modifica delle cellule NK mediante CRISPR.
- Esplorare l'efficienza dell'elettroporazione nel trasferire materiale genetico.
- Valutare l'impatto delle modifiche genetiche sulla funzionalità delle cellule NK.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'RNA CRISPR e dell'RNA tracr per formare l'RNA guida.
- Formazione di complessi Cas9-RNA guida per la modifica del genoma.
- Elettroporazione delle cellule NK per favorire l'assunzione del materiale genetico.
- Coltura e analisi delle cellule NK modificate geneticamente.
Risultati principali
- Formazione efficace di complessi Cas9-gRNA.
- Introduzione efficiente di materiale genetico in cellule NK mediante elettroporazione.
- Modifica di geni bersaglio che porta a risultati non funzionali.
- Migliore comprensione delle tecniche di modifica delle cellule NK.
Conclusioni
- Il metodo modifica efficacemente le cellule NK utilizzando la tecnologia CRISPR.
- L'elettroporazione si rivela una tecnica valida per la trasfezione cellulare.
- Studi futuri potranno basarsi su questi risultati per migliorare le terapie con cellule NK.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modifica genetica mediata da CRISPR Cas9 in cellule NK umane primarie consente un'analisi funzionale precisa delle vie delle cellule immunitarie, supportando la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta in immunooncologia. Questa tecnica fornisce una piattaforma solida per valutare la funzione genica e ottimizzare i modelli cellulari, influenzando direttamente la fiducia predittiva e la selezione del portafoglio nella ricerca e sviluppo di terapie cellulari. La sua riproducibilità e scalabilità la posizionano come capacità fondamentale per il progresso dei percorsi traslazionali e preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'eliminazione diretta di geni candidati in cellule NK primarie per la validazione funzionale.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando il ruolo dei geni nell'attività delle cellule immunitarie.
- Facilita la verifica rapida di ipotesi relative alla modulazione delle vie immunitarie.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione di bersagli nei programmi di immunoterapia.
Sviluppo di screening e saggi
- Genera modelli validati di cellule NK per saggi fenotipici e funzionali successivi.
- Standardizza i flussi di lavoro di editing genico per lo sviluppo di saggi riproducibili.
- Fornisce output quantitativi per confrontare gli effetti del knockout genico in diverse condizioni.
- Consente la preparazione scalabile di cellule modificate per schermature ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli di cellule NK ingegnerizzate a endpoint funzionali rilevanti per la malattia.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli immunitari.
- Riduce il rischio di traduzione facilitando la valutazione diretta della funzione genica in cellule umane primarie.
- Semplifica l'identificazione di biomarcatori associati a fenotipi da knockout genico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di editing genico si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica, consentendo una validazione iterativa del bersaglio e uno screening funzionale in cellule immunitarie primarie.
- Biologia della scoperta: Fornisce una piattaforma per il test dell'ipotesi nulla e la chiarificazione dei percorsi nelle cellule NK.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili e modificate geneticamente per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Supporta la misurazione quantitativa degli effetti dell'interruzione genica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte ai modelli preclinici utilizzando cellule immunitarie primarie umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato adattabile a diversi bersagli genici e tipi di cellule immunitarie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle cellule immunitarie.
- Valore operativo: Consente una modifica genetica standardizzata, scalabile e riproducibile nelle cellule NK primarie.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'allocazione del capitale nei percorsi di immunoterapia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la promozione di programmi terapeutici basati su cellule immunitarie, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di CRISPR, nell'elettroporazione e nella coltura di cellule primarie.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per elettroporazione e reagenti validati.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità.
- Adattabile ad altri tipi di cellule immunitarie con un'ottimizzazione del protocollo.
- Dipende da saggi analitici affidabili per la validazione successiva alla modifica genica.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026