Immunocolorazione a fluorescenza di fette di organoidi cerebellari

Prendiamo le sezioni fisse di organoidi cerebellari che comprendono tipi distinti di neuroni cerebellari.

Lavare le sezioni nel tampone per rimuovere i residui di materiale di inclusione.

Incubare in glicina per bloccare i siti reattivi residui dalla fissazione, riducendo il legame non specifico durante l'immunocolorazione.

Aggiungere un detergente non ionico per permeabilizzare le cellule.

Lavare con tampone, rimuovendo il detersivo in eccesso.

Ora, asciuga il vetrino. Trasferirlo in una capsula immunocolorante con carta imbevuta di tampone per evitare che i tessuti si secchino.

Applicare una soluzione bloccante che si lega a siti non specifici sui neuroni.

Rimuovere la soluzione bloccante. Incubare con anticorpi primari, che si legano agli antigeni bersaglio all'interno dei neuroni cerebellari.

Lavare con tampone, rimuovendo gli anticorpi non legati.

Incubare con anticorpi secondari legati al fluoroforo per legare gli anticorpi primari legati all'antigene.

Quindi, lavare con tampone, rimuovendo gli anticorpi non legati.

Aggiungi un colorante per colorare i nuclei cellulari.

Utilizzando la microscopia a fluorescenza, visualizza i marcatori espressi nei neuroni cerebellari, indicando la maturazione degli organoidi.

Lavare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni dell'organoide con 50 millilitri di PBS 1X per cinque minuti. Quindi, trasferisci i vetrini in un barattolo Coplin contenente 1X PBS fresco. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di glicina appena preparata e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente 50 millilitri di Triton allo 0,1% e permeabilizzare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini due volte con 1X PBS per cinque minuti ogni volta. Preparare il piatto di immunocolorazione con carta da tre millimetri imbevuta di PBS 1X.

Asciugare i vetrini con un fazzoletto tutto intorno alle fette e posizionarli sulla carta da 3 millimetri. Con una pipetta Pasteur, coprire ogni vetrino con 0,5 millilitri di soluzione bloccante. Dopo l'incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione bloccante in eccesso e asciugare i vetrini con un fazzoletto tutto intorno alle fette.

Posizionare 50 microlitri di anticorpo primario diluito su ogni vetrino e coprirli con vetrini. Posizionare i vetrini nella capsula di immunocolorazione precedentemente preparata e incubarli a 4 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione notturna, trasferire i vetrini in un barattolo Coplin con 50 millilitri di TBST, lasciando cadere i vetrini, quindi lavare i vetrini tre volte con TBST per cinque minuti ogni volta. Posizionare 50 microlitri di anticorpo secondario diluito su ciascun vetrino e coprirlo con i vetrini.

Posizionare i vetrini nella capsula di immunocolorazione precedentemente preparata. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Trasferisci nuovamente i vetrini in un barattolo Coplin e lavali tre volte con 50 millilitri di TBST per cinque minuti ogni volta. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione DAPI su tutta la superficie di ciascun vetrino e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.