Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo

Prendiamo un topo transgenico anestetizzato che esprime proteine fluorescenti in neuroni piramidali sparsi.

Al topo viene impiantata una cannula di imaging sopra l'ippocampo dorsale.

Posizionare il mouse sotto il microscopio a due fotoni su un termoforo, fissando la piastra della testa della cannula al supporto per immobilizzarne la testa.

Applicare un unguento per prevenire l'essiccazione corneale.

Pulire la cannula con acqua deionizzata e ispezionarla con un obiettivo a basso ingrandimento per verificare la presenza di detriti, danni o problemi di fluorescenza.

Allineare la cannula di imaging con l'asse ottico del microscopio per ottenere immagini precise.

Quindi, passa a un obiettivo ad alta risoluzione ad immersione in acqua.

Riempire la cannula con acqua deionizzata, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria per evitare distorsioni dell'immagine.

Esegui l'imaging longitudinale a due fotoni utilizzando la luce infrarossa per eccitare selettivamente i fluorofori sul piano focale, consentendo l'imaging dei tessuti profondi.

La cannula impiantata facilita l'accesso ripetuto all'ippocampo dorsale per monitorare i cambiamenti dendritici nel tempo.

Posizionare il mouse sotto il microscopio sopra il tappeto riscaldante e fissare la piastra della testa al supporto. Applicare un unguento per gli occhi sugli occhi dell'animale. Quindi pulire la cannula di imaging utilizzando una siringa e un ago sottile per far cadere l'acqua deionizzata nella cannula, seguita dalla rimozione con una pompa a vuoto.

Utilizzare obiettivi a basso ingrandimento e a lunga distanza per controllare visivamente la cannula per verificare la presenza di acqua residua, sporco, integrità e presenza di fluorescenza. Quindi allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci porta-testa.

Passa a un obiettivo 25x con un'apertura numerica di 1,0 e una distanza di lavoro di 4 millimetri. Quindi aggiungere abbastanza acqua deionizzata alla cannula per riempirla e mantenere l'acqua in eccesso sopra la cannula. Infine, utilizzare l'eccitazione di due fotoni e visualizzare i segnali fluorescenti.