FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di etichettare in modo innocuo e rapido le superfici delle cellule viventi o S con costrutti bioattivi. Ciò si ottiene preparando prima un distanziatore di funzioni, un lipide o una soluzione di costrutto FSL. Successivamente, una parte uguale della soluzione del costrutto viene mescolata con una parte uguale della soluzione di cellule o VIR.

Come terza fase, la miscela viene incubata per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Il passaggio finale consiste nel lavare le cellule o i citi modificati o i VIR o i VIR modificati e utilizzarli sperimentalmente come al solito. In definitiva, le cellule vive modificate in superficie o S possono essere visualizzate attraverso tutte le tecniche di analisi sperimentale di routine, tra cui citometria a flusso, microscopia e agglutinazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la marcatura covalente, è che è rapida, robusta, flessibile e non influisce sulla vitalità della cellula modificata o di Varian. Per preparare prima la soluzione madre del costrutto FSL, aggiungere un millilitro di diluente al file del prodotto per ricostituire il prodotto FSL secco, creando una soluzione madre di un milligrammo per millilitro. Sonicare la fiala per 30 secondi, aliquotare il brodo in contenitori sterili da 100 microlitri e conservare i contenitori a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Per preparare le soluzioni di costrutto FSL funzionanti per l'inserimento appena prima dell'uso, sonicare nuovamente la soluzione per 30 secondi per omogeneizzare eventuali cellule mis, quindi diluire il costrutto FSL e tamponare alla concentrazione richiesta. Conservare la soluzione di lavoro a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per un massimo di una settimana dopo la sospensione di Resus in terreni privi di lipidi privi di lipidi privi di lipidi PBS per la modifica dell'FSL. Quindi imballare le cellule in 100 microlitri di diluente, lavare le celle per i controlli nelle stesse condizioni a 100 microlitri di cellule non modificate.

Se lo si desidera, aggiungere 100 microlitri di una diluizione appropriata della soluzione FSL. In parallelo, creare anche controlli negativi con soluzioni FSL e/o PBS non correlate. Quindi incubare tutti i sottogruppi di cellule per un'ora a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione.

Lavare tutte le cellule due volte con terreno privo di lipidi o PBS per rimuovere eventuali costrutti FSL liberi e preparare una sospensione appropriata in terreno privo di lipidi. Una volta completato il processo di modifica dell'FSL, i coys possono essere conservati a una temperatura compresa tra quattro e otto gradi Celsius come un fiore. I costrutti FSL sono costituiti da tre componenti principali, la testa funzionale o F, che può essere una varietà di gruppi biologicamente funzionali.

Il distanziatore RS è progettato per indurre la spaziatura della testa funzionale lontano dalla membrana per migliorare la dispersione dell'acqua e per essere non reattivo con il siero umano e il lipide DAL o L, che consente al costrutto di incorporarsi spontaneamente nelle superfici quattro. I gruppi FSL rappresentativi sono mostrati nelle cinque immagini seguenti. Gli embrioni murini vivi sono stati marcati direttamente con fluoresceina FSL con il metodo di due ore a 37 gradi Celsius in terreni di coltura cellulare privi di siero lavati e quindi visualizzati al microscopio a fluorescenza.

In questa prima immagine, si può vedere un embrione a due cellule speculare libero da zop palita. L'intensa colorazione al centro dell'embrione è rappresentativa di una classica colorazione a corpo polare. Nelle prossime due immagini, vengono mostrati embrioni a quattro e otto cellule che mostrano una colorazione in ombra delle cellule che si trovano al di fuori del microscopio P di messa a fuoco.

Un'immagine di un embrione mirroring a 16 cellule libero da zop palita è mostrata in quest'ultima immagine di embrioni riflettenti vivi marcati con fluoresceina FSL di quattro o cinque giorni di vita con embrioni di blasti riflettenti intatti con embrione e zop LUCITA marcati sono mostrati in questa prossima serie di immagini. Viene mostrata l'etichettatura della fluoresceina FSL del pesce zebra. Questa prima immagine è di una micro angiografia di una larva di zebrafish 52 ore dopo la fecondazione a cui è stata iniettata direttamente in circolo la fluoresceina FSL.

Qui si può osservare una colorazione del sistema vascolare del pesce zebra. La fluoresceina FSL, le cellule eterogenee del tessuto renale di zebrafish o i citi ZK sono stati creati exvivo e poi microiniettati nella circolazione di un ricevente di zebrafish 52 ore dopo la fecondazione Le osservazioni in vivo dei citi ZK sono state effettuate due ore dopo l'iniezione mediante imaging del sistema vascolare sotto fluorescenza con microscopia time-lapse mostrata è un singolo fotogramma video con grandi cellule lente o immobili indicate con frecce arancioni e cellule in rapido movimento, che apparivano sfocati a causa del loro movimento indicato con frecce verdi. In questa immagine, viene mostrata la marcatura della fluoresceina FSL mediante assorbimento orale del costrutto ottenuto immergendo embrioni di zebrafish e terreni contenenti fluoresceina FSL per un massimo di cinque giorni.

La microscopia in campo chiaro del pesce zebra trattato con fluoresceina FSL a sinistra corrisponde all'immagine fluorescente adiacente a destra. La fluorescenza era localizzata preferenzialmente nel tratto intestinale. Non è stata osservata alcuna colorazione negli embrioni di controllo non trattati mostrati qui.

Qui il virus della stomatite vescicolare o VSV direttamente marcato con 10 microgrammi per millilitro di fluoresceina FSL per due ore a 37 gradi Celsius, seguito da fissazione con aldeide paraforme al 4%, e quindi l'analisi mediante scansione dei fatti non ha dimostrato alcuna purificazione del VSV vir. Era richiesta l'etichettatura post FSL. Questo istogramma mostra le cellule testicolari suine infettate con A Puerto Rico 8, 19, 34 o H, uno, N, un VIR marcate con fluoresceina FSL.

Le cellule non infette non fluorescenti sono rappresentate dalla linea nera, mentre la fusione del corone H one N one con le cellule suine, che ha portato alla fluorescenza, è indicata dalla linea rossa. In questa prossima serie di immagini, le cellule sono state prima etichettate con biotina FSL per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi lavate e reagite con Fluor four marcato avadon e quindi lavate e montate a umido per la microscopia a fluorescenza. La prima immagine mostra un'immagine confocale compilata di un embrione murino assistito dai blasti, e questa figura mostra una fetta confocale centrale dell'embrione dall'immagine precedente.

Qui ci sono esseri umani mobili vivi perm zoa. La sfocatura si verifica come conseguenza del loro movimento. Un'immagine rappresentativa più distinta degli spermatozoi umani fissati al 4% dopo l'inserimento dell'aldeide paraforme può essere vista in questa figura qui.

Gli eritrociti umani marcati con biotina FSL hanno mostrato che la fissazione con l'aldeide paraforme al 4% l'inserzione della pres non influisce sulla marcatura FSL come illustrato nelle due figure seguenti qui, si possono osservare cellule di carcinoma umano dell'endometrio RL 95 fissate al parmal. Mentre in questa immagine, le cellule del carcinoma umano dell'endometrio RL 95 non sono fisse. Non si osservano praticamente differenze nell'etichettatura tra le due immagini con o senza fissaggio.

I citi dei globuli rossi marcati con biotina FSL osservati in un campione di sangue prelevato due ore dopo l'infusione endovenosa dei citi sono mostrati qui a sinistra, le cellule sono state visualizzate al microscopio ottico a destra, lo stesso campo di cellule è stato visualizzato in fluorescenza e i due citi presenti possono essere identificati in verde. Il calcolo del rapporto tra i citi e le cellule non marcate può essere utilizzato come indicatore di sopravvivenza. Quest'ultima immagine della cellula marcata con biotina FSL mostra i citi di biotina endometriale umani vivi che sono stati visualizzati legandosi a perline abbattute.

Questa serie finale di immagini mostra le interazioni dei costrutti FSL con i marcatori dei gruppi sanguigni. La prima immagine è di citi GLI eritrocitari umani rivestiti con una concentrazione di 500 microgrammi per millilitro di FSLG testato contro le diluizioni del siero umano. I globuli rossi umani non reagiscono naturalmente con l'antigene Xena GALI.

Pertanto, i citi possono essere utilizzati per quantificare i livelli di anticorpi nel siero. In questo esempio, il paziente è stato determinato ad avere un titolo di antiga da uno a 32 creando citazioni con livelli decrescenti di FSL. Analogamente alla creazione di un titolo antigenico, è possibile determinare un livello ottimale di antigene per rilevare gli anticorpi, le cellule possono essere create per dare un risultato positivo solo quando il livello di anticorpi supera un titolo specifico.

Il livello di antigene FSL richiesto per dare un risultato positivo dipende dalla qualità e dal livello di anticorpi rilevati. Tipicamente per gli antigeni dei carboidrati, una soluzione FSL di 100 microgrammi per millilitro provocherà una forte reazione positiva. Globuli rossi umani del gruppo O modificati per avere un livello specifico di un antigene o cosiddetti standardizzati.

I citi A vengono utilizzati per quantificare in modo accurato e riproducibile gli antia nel siero umano. In questo esempio, i citi sono stati preparati dai globuli rossi del donatore e il livello di antia nel siero del gruppo O testato è risultato essere compreso tra uno e 32. Come mostrato qui, nella sesta provetta, gli antigeni del gruppo sanguigno A e B inseriti simultaneamente in un singolo campione di globuli rossi del gruppo O sono stati utilizzati per creare citi della settimana B di una settimana.

Questi citi possono essere utilizzati per scopi di controllo qualità VO. L'analisi dei cyte a week, settimana B specificamente formulati testati contro i reagenti antia e anti B fornisce le reazioni deboli attese come evidenziato in questa figura con le reazioni che si verificano nella zona inferiore centrale delle provette. Questa semplice tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.