Name: FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a modificare le superfici cellulari e virali con costrutti FSL senza comprometterne la vitalità. Questo metodo rapido e flessibile consente il marcaggio biologico per citometria a flusso e microscopia.

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Gli autori ringraziano Dan Bess di Sigma-Aldrich per presentare il video. Ringraziamo anche Don Branch, Evgenij Cherny, Scott Chesla, Elisabetta Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, e Eleanor Williams per i loro risultati e contributi per la sintesi di design, di costrutti FSL e determinare l&#39;attività biologica.

Il protocollo che segue descrive la procedura generica per l'inserimento di costrutti FSL (Figura 1) in membrane biologiche. Per semplicità il protocollo solo fare riferimento alle celle (kodecytes), che sono ad una concentrazione del 100%. Tuttavia, le cellule termine è intercambiabile con virioni (kodevirions) o organismi o strutture cellulari e la loro concentrazione nel diluente non è importante, a condizione che sia sempre coerente tra le prove, i controlli e gli esperimenti. Con globuli rossi l'ematocrito è tipicamente l'80%, ma con virioni, embrioni e cellule di altri è in genere inferiore all'1%. Il metodo è molto robusto e produrrà le membrane modificate quando viene utilizzato da una delle sue variazioni, ma la raffinatezza saranno richiesti per ottimizzare e standardizzare il grado di modifica necessaria per applicazioni specifiche. 1. Preparazione del FSL Costruisce <ol><li> Per preparare il brodo FSL costruire ricostituire prima soluzione del prodotto secco FSL (Tabella 1) con l'aggiunta di 1,0 ml di diluente (o come specificato nel foglietto illustrativo) al flaconcino del prodotto. Brevemente ultrasuoni (30 secondi). Questo preparerà una soluzione 1mg/mL, che può essere aliquotati in 100 microlitri contenitori sterili e conservati a 2-8 ° C per un massimo di una settimana, o congelati per un massimo di 3 mesi. </li><li> Per preparare il lavoro FSL costruire soluzioni per l'inserimento, al momento dell'uso brevemente ultrasuoni (30 secondi) della soluzione di riserva per omogeneizzare le micelle. Diluire il costrutto FSL nel buffer (preferibilmente non contenenti lipidi o materiale altamente idrofobi) alla concentrazione richiesta o in un intervallo se lo si desidera. </li></ol> Note: <ol><li> Costruisce FSL di solito inserire nelle cellule in mezzi contenenti lipidi, ma in genere richiedono tanto quanto un 50X concentrazioni più elevate FSL di lavoro che se in PBS o altri mezzi di lipidi liberi. </li><li> Le diluizioni campo di lavoro dipende l'applicazione, la sensibilità del metodo di rilevamento, il tipo di FSL costruire, e il grado di modifica necessaria. Tipicamente la gamma di diluizione sarà tra 10-500 mg di FSL per ml di diluente per carboidrati costruisce FSL e 100-100 mg / ml per altri costrutti FSL come fluorofori e biotina. </li><li> Se la preparazione diluenti inserimento contenente più FSL costruire, basta aggiungere i costrutti insieme nella stessa diluente alla loro concentrazione normale di lavoro. Se un costrutto è ad una concentrazione molto più alta rispetto ad un altro, qualche aggiustamento (aumento) in concentrazione possono essere richieste per la costruzione di minore. In alternativa i costrutti possono essere aggiunti in sequenza, preferibilmente con la più alta concentrazione di costruire per primo, seguito dai minori. </li><li> FSL costruire concentrazioni superiori a 1000 mg / ml possono introdurre notevoli quantità di lipidi in una membrana cellulare, e può cambiare la forma della cella o rendono più suscettibili alla lisi. </li><li> FSL costruire soluzioni di lavoro devono essere conservati a 2-8 ° C e utilizzata entro pochi giorni. </li><li> Costruisce FSL può essere diluito in acqua, ma hanno ridotto la stabilità e deve essere usato entro poche ore. Se il foglietto illustrativo indica l'acqua come diluente ricostituzione il prodotto nel flacone contiene anche sali (come specificato nel foglietto illustrativo). </li></ol> 2. L'inserimento del FSL Construct (s) in Membrane <ol><li> Lavare le cellule per FSL modifica senza lipidi legati mediante centrifugazione e usare PBS o lipidi mezzi cella libera come soluzione di lavaggio. </li><li> Pacco o sospendere le cellule in 100 ml di diluente. </li><li> Contemporaneamente preparare i controlli, che idealmente dovrebbero essere entrambe le celle non modificato (incubati con PBS, piuttosto che la soluzione FSL) e / o cellule modificate con un benigno, ma legati FSL costruire. </li><li> Aggiungere 100 ml di una diluizione appropriata di FSL soluzione (contenente 1 o più costrutti FSL) alle cellule e incubare per 1-2 ore a 37 ° C. Un risultato simile può essere ottenuto da 6 ore di incubazione a 25 ° C o durante la notte (18 ore) a 4 ° C - miscelazione è consigliato ogni poche ore se sospensioni cellulari pesanti vengono utilizzati. </li><li> Lavaggio (opzionale) due volte con PBS o supporto di togliere qualunque costruisce libero FSL e preparare una sospensione appropriato. </li></ol> Note: <ol><li> Il diluente utilizzato per sospendere le cellule possono essere terreni di coltura cellulare, PBS, soluzioni di storage cellulare, etc, ma preferibilmente senza lipidi (es. siero fetale di vitello) o detergenti (ad es TWEEN). </li><li> Diversi volumi (oltre 100 mL) rapporti (a 1:1 cellule / soluzione FSL) o condizioni di incubazione di tempo e temperatura possono essere utilizzati, purché lo stesso rapporto, la concentrazione, e il volume vengono utilizzati per ottenere risultati riproducibili. </li></ol> 3. Gestione e visualizzazione <ol><li> Una volta che il processo di modifica FSL è stato completato il kodecytes può essere conservata a 4-8 ° C in lipidi media liberi o utilizzato. </li><li> Kodecytes e kodevirions generalmente comportano allo stesso modo le cellule non modificate / virioni e può essere Handled e visualizzati con i sistemi di test normale (microscopia, sierologia, citometria a flusso, ecc.) Di solito non hanno esigenze particolari, tranne per evitare di solventi / detergenti / lipidi che possono eluire i costrutti lipidi dalle membrane. </li></ol> Note: <ol><li> Costruisce rimarrà nella membrana delle cellule inattive, come i globuli rossi, se conservato in lipidi media liberi per la vita della cellula. Nelle cellule con membrane attivi i costrutti verrà interiorizzato e metabolizzato, ad un tasso dipendente l'attività della membrana cellulare. </li><li> Le cellule morte di solito contengono alti livelli di costrutti FSL, questo può essere usato per separare le cellule non vitali da cellule vitali. </li><li> Se kodecytes sono conservati (o utilizzati in vivo) in lipidi contenenti media / gli ambienti, come ad esempio siero / plasma il costrutto lentamente eluire dalla membrana in un periodo di ore o giorni, a seconda della temperatura e le concentrazioni di lipidi / composizioni. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <ol><li> I risultati rappresentativi seguenti dipendono dal costrutto usato (Tabella 1), la sua concentrazione inserito e la sensibilità e specificità del sistema di rilevazione (s). In generale tutti i costrutti FSL inserisce nelle cellule dopo 1 ora, ma le condizioni ottimali dovrà essere stabilito per ogni situazione. </li><li> Costruisce FSL può essere usato per etichettare l'esterno di una varietà di cellule vive 3-9,11,14. Negli esempi mostrati in figura 2 embrioni a diversi stadi sono stati utilizzati (in quanto sono una cellula fragile), ma altre cellule (Figura 3) o virioni avvolto (Figura 4) possono anche essere etichettati. FSL-fluoresceina permette di etichettatura diretta delle superfici (Figure 2-4), mentre FSL-biotina e altri costrutti FSL può richiedere l'uso di un sistema di rilevamento secondario (di solito avidina / anticorpi / lectine) per mostrare la loro presenza (Fig. 5) . </li><li> Markers del gruppo sanguigno della specificità umana o animale può essere collegato alle cellule, comprese le cellule rosse 4-9 (Figura 6). Poiché la quantità di FSL costruire su un kodecyte è controllabile e riproducibile 4-6, kodecytes per la quantificazione degli anticorpi possono essere effettuate (Tabella 2 e Figura 6). La fonte reale di cellule non è importante, che può essere di qualsiasi specie, o addirittura della stessa origine come fonte di anticorpi, garantendo così il solo antigene incompatibili è quello adottato dalla FSL 7,8 (Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabella 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 2"> Tabella 2. Rappresentante reazioni sierologiche di tre diversi FSL-A (tri) kodecytes globuli rossi testati contro diluizioni di anticorpi monoclonali anti-A. La soluzione al 50 mM di FSL-A (tri) quando incubato con un uguale volume di gruppo O globuli rossi prodotta una forte cellule antigene positivo, che potrebbe essere rilevato da una diluizione 1:512 di anticorpi monoclonali anti-A. Il 5 - e 10 volte inferiore FSL-A (tri) soluzioni prodotte kodecytes con gruppo sanguigno A meno espressione dell'antigene. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="Panoramica dei costrutti FSL" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Panoramica dei costrutti FSL"> Figura 1. FSL costruire panoramica. Come un fiore costruisce FSL è costituito da tre componenti principali. La testa funzionale (F) nel caso del costrutto FSL può essere una varietà di diversi gruppi biologicamente funzionali, un distanziale (S) per indurre una distanza di F dalla membrana, migliorare disperdibilità acqua e non reattivi con il siero, mentre i lipidi diacyl permette la costruzione di incorporare spontaneamente in superficie. (I) FSL-GB3 con un gruppo sanguigno Gb 3 (o P k) trisaccaride Galα4Galβ4Glcβ epitopo. (II) FSL-A (tri) con un gruppo sanguigno A trisaccaride epitopo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceina. (IV) FSL-biotina con una singola porzione F biotina. Il gruppo funzionale di strutture in I-III sono coniugati con un derivato adipato attivata di dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), mentre il distanziale della struttura IV è carboxymethylglycine-adipato base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="Embrioni murini marcati con FSL-Fluoresceina" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Embrioni murini marcati con FSL-Fluoresceina"> Figura 2. FSL-fluoresceina etichettati embrioni murini. Tutte le immagini sono di embrioni vivi che sono stati etichettati quando la loro zona pellucida (ZP) era intatto (cioè la FSL costruire passato attraverso il ZP di etichettare l'embrione all'interno). Immagini I-IV sono di ZP-free embrioni liberati dalla loro ZP con etichettatura acido messaggio tyrodes con FSL-fluoresceina. Colorazione identica si verifica indipendentemente dal fatto che gli embrioni sono stati modificati con FSL ZP intatti o ZP libero. Gli embrioni sono direttamente etichettati con FSL-fluorescina, a ore 2 37 ° C Metodo di mezzi di comunicazione cellulare i livelli di free cultura, lavati e quindi visualizzati al microscopio a fluorescenza. (I) ZP libero due cellule embrionali murine, anche mostrando classica colorazione intensa globulo polare. (II-III) ZP libero quattro celle e otto embrioni di cellule murine, che mostra sia le macchie d'ombra delle cellule che sono outide microscopio il piano di messa a fuoco. (IV) ZP libero 16 embrionale delle cellule murine. (V) ZP embrioni intatto blastocisti murine (D4-D5), dove sono etichettati sia l'embrione e la zona. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluoresceina e pesce zebra" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="FSL-Fluoresceina e pesce zebra"> Figura 3. FSL-fluoresceina e zebrafish 14. (I) Microangiography su un HPF 52 (ore dopo la fecondazione) larve di zebrafish iniettato direttamente in circolo con FSL-fluoresceina. La vascolarizzazione zebrafish è macchiato. (II) FSL-fluoresceina eterogeneo Zebrafish cellule del tessuto renale (ZK kodecytes) sono stati creati ex vivo allora micro-iniettati nella circolazione di un Zebrafish 52 hpf destinatario. Nelle osservazioni in vivo del kodecytes ZK sono state fatte due ore dopo l'iniezione di imaging del vascolarizzazione in fluorescenza con microscopia time-lapse. Mostrato è un fotogramma video singola con grandi cellule si muovono lentamente o immobile (indicato con frecce arancioni) e le cellule in movimento veloce (immagini sfocate dovute al movimento - indicato con frecce verdi). Etichettatura permette in tempo reale in osservazione in vivo del comportamento e la biodistribuzione kodecytes ZK. (III) l'assorbimento orale di FSL-fluoresceina ottiene immergendo in embrioni di zebrafish FSL-fluoresceina contenente i media per un massimo di 5 giorni. Lavaggio è stato ottenuto con il trasferimento di embrioni in mezzi non contenenti costruisce FSL (almeno 6 ore è necessario ma può essere per alcuni giorni). (IIIa) microscopia a campo luminoso della FSL-fluoresceina zebrafish trattati corrispondente all'immagine adiacente fluorescenza (IIIb). Il fluoresence era preferenzialmente trova nel tratto intestinale. Nessuna colorazione è stata osservata negli embrioni di controllo non trattati (IVA e IVB). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="Marcatura FSL-Fluoresceina dei virioni" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Marcatura FSL-Fluoresceina dei virioni"> Figura 4. FSL-fluoresceina etichettatura dei virioni 10 VSV e H1N1. (I) del virus stomatite vescicolare (VSV) era direttamente marcato con 10 mcg / ml FSL-fluoresceina per 2 ore a 37 ° C, seguita da fissare con il 4% paraformaldeide e poi citometria a flusso. Nessun purificazione del kodevirion VSV messaggio FSL etichettatura è stato richiesto. (II) La citometria a flusso delle cellule testicolari suini infettati da A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions etichettati utilizzando FSL-fluoresceina. Cellule non infettate sono visti come la linea nera, mentre la fusione del kodevirion H1N1 con i risultati ST celle in una cella a fluorescenza (linea rossa). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="Cellule marcate con FSL-biotina" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Cellule marcate con FSL-biotina"> Figura 5. FSL-biotina cellule marcate e successiva visualizzazione tramite l'etichetta avidina 7,8. Tutte le cellule sono stati etichettati con FSL-biotina per 1 ora a 37 ° C, lavate poi reagito con fluoroforo etichettati avidina, lavato e bagnato montate per la microscopia a fluorescenza. (I) Compilato immagine confocale di una blastocisti dell'embrione murino. (II) Centrale fetta confocale dell'embrione dall'immagine precedente. (III) dal vivo mobili spermatozoi umani - sfocatura si verifica come conseguenza del loro moto. (IV) Fisso (4% inserimento post paraformaldeide) spermatozoi umani. (V) degli eritrociti umani. (VI) fisso (4% paraformaldeide pre-inserimento) RL95 carcinoma dell'endometrio umano. (VII) non fissato RL95 umane di carcinoma endometriale linea cellulare. (VIII) Biotina RBC kodecytes osservato in un campione di sangue prelevato 2 ore dopo l'infusione endovenosa di kodecytes con (VIII) che rappresenta un campo viste al microscopio ottico, mentre (VIII ter) è lo stesso campo visto in fluorescenza, identificando i due kodecytes presenti nel campo di vista. Calcolo del rapporto tra kodecytes alle cellule senza etichetta può essere utilizzata come un indicatore di sopravvivenza. (IX) dal vivo umano kodecytes biotina endometriale visualizzati legandosi a microsfere avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Carboidrato per aggiungere marcatori di gruppo sanguigno per il profilo sierologico" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="FSL-Carboidrato per aggiungere marcatori di gruppo sanguigno per il profilo sierologico"> Figura 6. FSL-carboidrati per aggiungere marcatori gruppo sanguigno per il profiling sierologici. (I) di globuli rossi umani kodecytes Galili sono stati creati con una concentrazione serie di FSL-Galili (500 mg / mL) e testato contro le diluizioni di siero umano. Eritrociti umani non si presentano in natura con l'antigene xenoantigen Galili. Kodecytes tale può essere usato per livelli quantitativi di anticorpi nel siero. In questo esempio, il donatore è stato determinato per avere un anti-Galili titolo di 1:32. (II) Con la creazione di kodecytes con livelli decrescenti di FSL ("titoli antigenici"), un livello ottimale di rilevare l'antigene anticorpo può essere determinato (in questo esempio Le a). Le celle possono essere creati per dare solo un risultato positivo quando supera il livello di anticorpi un titolo specifico. Il livello di antigene FSL necessario per fornire un risultato positivo dipende dalla qualità e il livello di anticorpi essere rilevato. Per gli antigeni carboidrati, una soluzione FSL di 100 mg / ml avrà come risultato una forte reazione positiva. (III) Umani gruppo O globuli rossi sono stati modificati per avere un livello specifico di una formicaigen (standardizzato A kodecytes), e utilizzato per quantificare con precisione e riproducibile anti-A nel siero umano. In questo esempio l'anti-A titolo nel gruppo O siero testato è 1:32 e le kodecytes sono stati preparati dalle stesse cellule rossi del donatore. (IV) Gruppo sanguigno antigeni A e B contemporaneamente inserita in un unico gruppo cella campione O rosso sono utilizzati per creare un kodecytes B debole debole. Questi kodecytes possono essere utilizzate per scopi ABO controllo della qualità. Questo risultato mostra l'analisi di un specificamente formulato A kodecyte B debole debole testato contro i reagenti anti-A e anti-B e dà previsto reazioni deboli.

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Deborah A. Blank e Stephen M. Henry sono i dipendenti e azionisti di Kode Biotech limitata il titolare del brevetto della tecnologia Kode. Dan Bess è un dipendente di Sigma-Aldrich, che ha sponsorizzato la produzione di questo video-articolo.

Cellule modifica e virioni con costrutti FSL è una tecnica molto semplice e robusto 3-11. Per descrivere e distinguere FSL costruire cellule modificate e virioni dalle cellule non modificate, sono chiamati kodecytes e kodevirions rispettivamente 6-10, ma solo quando il gruppo ha introdotto funzionale può dimostrare di essere presenti sulla loro membrana. Quando kodecytes sono realizzati con diverse concentrazioni di costrutti FSL, possono essere a cui si riferisce la concentrazione della soluzione FSL costrutto usato per crearli, ad esempio 15 mg / ml A kodecytes, o se più di un FSL è un termine usato poi combinati, ad esempio A + biotina kodecytes 7,8. Quando le cellule sono diverse da confrontare, tra cui il tipo di cellula nella descrizione si consiglia, per esempio globuli rossi kodecytes biotina o kodecytes biotina endometriale 7,8. Sebbene il processo di inserimento è molto robusto e l&#39;inserimento (anche se con tassi differenti) si verifica in un intervallo di temperatura 4-37 ° C e in pochi minuti ad ore, per ottenere il controllo riproducibile inserimento stretto tempo di contatto, temperatura, concentrazione FSL ( compresa la formulazione diluente) e, in misura minore concentrazione di cellule sono obbligatori. Ad oggi, tutti i costrutti FSL può essere usato per modificare le cellule con la stessa tecnica 4-11, tuttavia si prevede che alcune condizioni saranno più favorevoli per flusso di lavoro e / o le esigenze di gestione ottimale delle cellule / dei virioni da modificare . La concentrazione esatta FSL per ottenere l&#39;effetto desiderato deve essere determinato dal 4 utente. La risultante FSL costruire cellule modificate / virioni di solito può essere utilizzato nello stesso modo come una cellula non modificato / virione nei sistemi biologici o analitica 4-11. Come i costrutti FSL lentamente eluire dalle superfici modificate, a contatto con soluzioni di lipidi 7,8, o essere consumati da cellule attive 11, questi temi devono essere considerati in relazione al livello di segnale o attività ottenuti in periodi di tempo. Kodecytes può essere fisso (es. glutaraldeide / formalina) dopo l&#39;inserimento a condizione che il fissativo non contiene lipidi a eluizione di solventi e il gruppo funzionale è compatibile con il fissativo. Cellule in alternativa fissa possono essere modificati con costrutti FSL. Oltre alla modifica della superficie delle cellule e virione costruisce FSL può essere infuso direttamente nella circolazione degli animali da laboratorio causando una modificazione in vivo di cellule circolanti 7 e per inibire virus 12, tossine, 12 e gli anticorpi 7. Costruisce FLS sono stati utilizzati anche per decorare liposomi e possono essere stampati su superfici di carta 13, dove si immobilizzano, e può quindi essere utilizzato in test diagnostici. La possibilità di modificare facilmente le cellule vive con una gamma crescente di costrutti FSL deve dimostrare di essere una ricerca utile e tool di sviluppo per lo studio della biologia cellulare di superficie.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabella 1"> Tabella 1. Disponibili in commercio costruisce FSL descritte in questo documento.

fsl costruisce: un metodo semplice per la modifica di cell / virion superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

La possibilità di modificare / visualizzare superfici biologiche, e quindi studiare la cellula modificata / virione in una serie di in vitro e in vivo ambienti è fondamentale per acquisire una visione più completa della funzione di molecole specifiche o l&#39;intera entità. Studi di modifica della superficie biologica sono in genere limitati a ingegneria genetica dell&#39;organismo o l&#39;attacco covalente di combinazione di sostanze chimiche al 1,2 superficie cellulare. Tuttavia queste tecniche tradizionali esporre la cellula di reagenti chimici, o richiedono la modifica significativa per ottenere il risultato desiderato, che li rende ingombranti, e possono anche involontariamente influenzare la vitalità / funzionalità della cellula modificata. Un metodo semplice per modificare innocuo superficie delle cellule è necessaria. Recentemente una nuova tecnologia, tecnologia Kode ha introdotto una serie di costrutti romanzo composto da tre componenti: un gruppo di testa funzionale (F), un distanziale (S) e una coda lipidica (L) e sono conosciuti come funzione-Spacer-Lipid o FSL constructs3. Il distanziatore (S) è stata selezionata per fornire un costrutto che si disperde in acqua, ma spontaneamente e stabilmente incorporare in una membrana. FSL costruire frazioni funzionale (F) finora includono una vasta gamma di saccaridi compreso il sangue di gruppo ai determinanti, acidi sialico, polisaccaridi acido ialuronico, fluorofori, biotina, radiolabels, e una serie di peptidi 3-12. Costruisce FSL sono stati utilizzati in embrioni di modificare, spermatozoi, pesce zebra, le cellule epiteliali / endometriali, globuli rossi, e virioni per creare controlli di qualità dei sistemi e pannelli diagnostici, di modificare l&#39;adesione cellulare / interazione / separazione / immobilizzazione, e per in vitro e in imaging in vivo di cellule / virioni 3-12. Il processo di modifica di cellule / virioni è generico ed estremamente semplice. La procedura più comune è l&#39;incubazione di cellule (in lipidi media liberi) con una soluzione per FSL costruisce per 1-2 ore a 37 ° C 4-10. Durante l&#39;incubazione del FSL costruisce spontaneamente incorporare nella membrana, e il processo è completo. Lavaggio è opzionale. Cellule modificate da costrutti FSL sono conosciuti come kodecytes 6-9, mentre virioni sono kodevirions 10. FSL costruisce come infusi diretta e kodecytes / kodevirions sono stati utilizzati in modelli sperimentali animali 7,8,10. Tutti kodecytes / kodevirions sembrano mantenere la loro vitalità e la funzionalità normale guadagnando la nuova funzione della frazione F 7,8,10,11. La combinazione di disperdibilità nei media biocompatibile, incorporazione spontanea nelle membrane cellulari, e apparente bassa tossicità, rende FSL costruisce preziosi strumenti di ricerca per lo studio delle cellule e dei virioni.

Funzione-Spacer-Lipid (FSL) costruisce permettere le caratteristiche della superficie delle cellule viventi e virioni essere modificate senza perdita di vitalità. Il metodo richiede solo semplice contatto di una soluzione di costruire una cella con FSL / virione e l&#39;incorporazione superficie spontanea e stabile si verifica.

FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

La capacità di modificare/visualizzare le superfici biologiche e di studiare successivamente la cellula/il virione modificati in una serie di ambienti in vitro e in vivo è essenziale...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare in modo innocuo e rapido le superfici di cellule vive o di S con costrutti bioattivi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una soluzione di costrutti costituiti da uno spacer funzionale, un lipide o un FSL. Successivamente, una parte uguale della soluzione di costrutti viene mescolata con una parte uguale della soluzione di cellule o di VIRs.Come terzo passaggio, la miscela viene incubata per 60 minuti a 37 gradi Celsius. L'ultimo passaggio consiste nel lavare le cellule o citi modificati o VIR modificati o VIR e nell'utilizzarli sperimentalmente come di consueto. In definitiva, le cellule vive o S con superficie modificata possono essere visualizzate mediante tutte le comuni tecniche di analisi sperimentale, inclusi citometria a flusso, microscopia e agglutinazione.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura covalente, è che è rapida, robusta, flessibile e non influisce sulla vitalità della cellula modificata o di Varian. Per preparare la soluzione madre del costrutto FSL, aggiungere innanzitutto un millilitro di diluente al flaconcino del prodotto per ricostituire il prodotto FSL liofilizzato, ottenendo una soluzione madre da un milligrammo per millilitro. Sottoporre il flaconcino a sonificazione per 30 secondi, suddividere la soluzione madre in aliquote da 100 microlitri in contenitori sterili e conservare i contenitori a due-otto gradi Celsius per un massimo di una settimana.Per preparare soluzioni operative di costrutti FSL da inserire immediatamente prima dell'uso, sottoporre nuovamente la soluzione a sonificazione per 30 secondi per omogeneizzare eventuali aggregati cellulari, quindi diluire il costrutto FSL e il tampone alla concentrazione richiesta. Conservare la soluzione operativa a due-cinque gradi Celsius per un massimo di una settimana dopo la risospensione in un mezzo privo di lipidi o in PBS. Centrifugare le cellule per rimuovere i lipidi non legati prima della modifica con FSL. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di diluente e lavare le cellule destinate ai controlli nelle stesse condizioni, portandole a un volume di 100 microlitri di cellule non modificate.Aggiungere 100 microlitri di un'opportuna diluizione della soluzione FSL, se desiderato. In parallelo, creare anche controlli negativi con soluzioni FSL non correlate e/o PBS. Quindi incubare tutti i sottoinsiemi cellulari per un'ora a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione.Lavare tutte le cellule due volte con mezzo privo di lipidi o con PBS per rimuovere eventuali costrutti FSL liberi e preparare un’adeguata sospensione in mezzo privo di lipidi. Una volta completato il processo di modifica con FSL, i costrutti possono essere conservati tra i quattro e gli otto gradi Celsius come un fiore. I costrutti FSL sono costituiti da tre componenti principali: la testa funzionale o F, che può essere costituita da una varietà di gruppi funzionali biologici.Lo spaziatore RS è progettato per indurre un allontanamento della testa funzionale dalla membrana, al fine di migliorare la dispersione in acqua, e per essere non reattivo con il siero umano e con il lipide DAL o L, consentendo così al costrutto di incorporarsi spontaneamente nelle superfici quattro. Gruppi FSL rappresentativi sono mostrati nelle seguenti cinque immagini. Embryoni murini vivi sono stati etichettati direttamente con FSL fluoresceina mediante il metodo di due ore a 37 gradi Celsius in mezzo di coltura cellulare privo di siero, lavati e quindi osservati mediante microscopia a fluorescenza.In questa prima immagine, è possibile osservare un embrione speculare a due cellule privo di zop palita. La colorazione intensa al centro dell'embrione è rappresentativa di una tipica colorazione del corpuscolo polare. Nelle due immagini successive, sono mostrati embrioni speculari a quattro e otto cellule privi di zop palita, che presentano una colorazione sfumata delle cellule situate al di fuori del piano di fuoco del microscopio.Un'immagine di un embrione speculare libero di zop palita a 16 cellule è mostrata in quest'ultima immagine di embrioni speculari vitali etichettati con fluoresceina FSL; embrioni blastocistici speculari integri di quattro-cinque giorni, con sia l'embrione che lo zop LUCITA etichettati, sono mostrati in questa serie successiva di immagini. È mostrata l'etichettatura con fluoresceina FSL del pesce zebra. Questa prima immagine rappresenta una microangiografia di una larva di pesce zebra a 52 ore post-fecondazione a cui è stata iniettata direttamente in circolo la fluoresceina FSL.Qui si può osservare la colorazione della vascolarizzazione del pesce zebra. I citi renali eterogenei del pesce zebra o ZK citi, creati ex vivo, sono stati microiniettati nella circolazione di un pesce zebra ricevente a 52 ore post-fecondazione; osservazioni in vivo dei ZK citi sono state effettuate due ore dopo l'iniezione, mediante imaging della vascolarizzazione in fluorescenza con microscopia a tempo-lampo. Viene mostrato un singolo fotogramma video con cellule di grandi dimensioni, lente o immobili, indicate da frecce arancioni, e cellule veloci, che appaiono sfocate a causa del loro movimento, indicate da frecce verdi. In questa immagine, la marcatura con FSL fluoresceina ottenuta per assunzione orale del costrutto, raggiunta immergendo embrioni di pesce zebra in un mezzo contenente FSL fluoresceina per un periodo fino a cinque giorni, è mostrata.La microscopia in campo chiaro del pesce zebra trattato con fluoresceina FSL a sinistra corrisponde all'immagine fluorescente adiacente a destra. La fluorescenza era localizzata preferenzialmente nel tratto intestinale. Nessuna colorazione è stata osservata negli embrioni di controllo non trattati mostrati qui.Qui il virus della stomatite vescicolare o VSV, direttamente marcato con 10 microgrammi per millilitro di FSL fluoresceina per due ore a 37 gradi Celsius, seguito da fissazione con paraformaldeide al 4% e successivamente analizzato mediante scansione FACS, è mostrato senza purificazione del virione VSV. È stato richiesto un ulteriore marcatore FSL. Questo istogramma mostra cellule testicolari suine infettate con il virus umano A Puerto Rico 8 19 34 o H1N1 marcato con FSL fluoresceina.Le cellule non infette non fluorescenti sono rappresentate dalla linea nera, mentre la fusione del coronavirus H1N1 con le cellule suine, che ha prodotto fluorescenza, è indicata dalla linea rossa. Nella seguente serie di immagini, le cellule sono state inizialmente marcate con biotina FSL per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi lavate e fatte reagire con avidina marcate con Fluor 4, successivamente lavate e montate in vetrina umida per la microscopia a fluorescenza. La prima immagine mostra un'immagine confocale ricostruita di blastocisti di embrione murino, mentre questa figura mostra una sezione confocale centrale dell'embrione proveniente dall'immagine precedente.Ecco degli spermatozoi umani mobili in vita. L'effetto di sfocatura è dovuto al loro movimento. Un'immagine rappresentativa più nitida di spermatozoi umani fissati con paraformaldeide al 4% dopo l'inserimento è visibile in questa figura qui.Nei globuli rossi umani marcati con biotina FSL, la fissazione con paraformaldeide al 4% prima dell'inserimento non influenza l'etichettatura FSL, come illustrato nelle due figure seguenti. Qui si possono osservare cellule di carcinoma endometriale umano RL 95 fissate con paraformaldeide al 4%. Mentre in questa immagine, le cellule di carcinoma endometriale umano RL 95 non sono state fissate. Non si osservano praticamente differenze nell'etichettatura tra le due immagini, con o senza fissazione.Qui a sinistra sono mostrati globuli rossi marcati con biotina FSL osservati in un campione di sangue prelevato due ore dopo l'infusione endovenosa dei citi; a destra, le cellule sono state osservate mediante microscopia ottica. Lo stesso campo di cellule è stato osservato in fluorescenza e i due citi presenti possono essere identificati in verde. Il calcolo del rapporto tra i citi e le cellule non marcate può essere utilizzato come indicatore della sopravvivenza. Quest'ultima immagine di citi umani endometriali vivi marcati con biotina mostra le cellule visualizzate grazie al legame con perle abbattute.Questa serie finale di immagini mostra le interazioni del costrutto FSL con i marcatori dei gruppi sanguigni. La prima immagine mostra eritrociti umani GLI rivestiti con una concentrazione di 500 microgrammi per millilitro di FSLG, testati contro diluizioni di siero umano. Gli eritrociti umani non reagiscono naturalmente con l'antigene Xena né con l'antigene GALI.Pertanto, le citocellule possono essere utilizzate per quantificare i livelli di anticorpi nel siero. In questo esempio, si è determinato che il paziente presentava un titolo di anticorpi di uno a 32, creando citocellule con livelli decrescenti di FSL. In modo analogo alla determinazione del titolo di un antigene, è possibile stabilire il livello ottimale di antigene per rilevare l'anticorpo; si possono quindi creare cellule che diano un risultato positivo solo quando il livello di anticorpo supera un determinato titolo.Il livello di antigene FSL necessario per ottenere un risultato positivo dipende dalla qualità e dalla concentrazione dell'anticorpo che si intende rilevare. Tipicamente, per antigeni di tipo carboidrato, una soluzione FSL di 100 microgrammi per millilitro determina una reazione positiva intensa. I globuli rossi di gruppo O umano modificati per presentare un livello specifico di antigene a sono definiti standardizzati.I citi vengono utilizzati per quantificare in modo accurato e riproducibile gli anticorpi nel siero umano. In questo esempio, i citi sono stati preparati a partire dai globuli rossi dello stesso donatore e il livello di anticorpi nel siero di gruppo O testato si è rivelato compreso tra uno e 32. Nella sesta provetta mostrata, antigeni del gruppo sanguigno A e B sono stati inseriti contemporaneamente in un singolo campione di globuli rossi di gruppo O per creare citi con debole reattività A e debole reattività B.Queste emazie possono essere utilizzate per finalità di controllo qualità VO. L'analisi delle emazie formulate specificamente per la settimana A e per la settimana B, testate con reagenti anti A e anti B, fornisce le reazioni deboli previste, come evidenziato in questa figura dalle reazioni che si verificano nella zona centrale inferiore dei tubi. Questa semplice tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.

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FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

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