Name: Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri un sistema sperimentale per studiare la meccanotrasduzione in cellule epiteliali di tipo II e fibroblasti polmonari fetali di topo. Questo metodo in vitro permette di analizzare gli effetti delle forze meccaniche sulla differenziazione cellulare.

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1. Rivestimento di piastre con proteine ​​ECM <ol><li> In condizioni sterili, miscelare 120 mg di laminina con 12 ml di freddo sterile 1X PBS per piastra. </li><li> Prendere BioFlex lastre non trattate e aggiungere 2 ml della soluzione in ogni pozzetto (concentrazione finale di laminina è 2 ug / cm 2). In alternativa, altre proteine ​​ECM potrebbero essere utilizzati, come collagene-1 [10 pg / cm 2], fibronectina [5 pg / cm 2], vitronectina [0,5 mg / cm 2] o elastina [10 pg / cm 2]. La tecnica di rivestimento è simile a quanto descritto per la laminina-rivestimento. Assicurarsi che i pozzetti sono completamente coperti dalla soluzione. </li><li> Avvolgere le piastre con plastica e mettere a 4 ° C su una superficie piana notte per consentire la laminina di adsorbire al fondo dei pozzetti. In queste condizioni, piastre possono essere conservate per almeno una settimana, pur mantenendo buona funzione ECM. </li><li> Il giorno dopo, in condizioni sterili, lavare i pozzetti per 3 volte con PBS 1X. </li><li&gt; Aggiungere 1 ml di 1% BSA in 1X PBS ad ogni pozzetto ed incubare a 37 ° C per 1 ora per bloccare i siti di legame non specifici sulle membrane. </li><li> Lavare le piastre 3 volte con PBS 1X per rimuovere le proteine ​​non adsorbito. </li><li> Conservare le piastre a 37 ° C in DMEM finché le cellule sono isolate dal passaggio 2,14. </li></ol> 2. Isolamento di cellule fetali di tipo roditore epiteliali polmonari II Il giorno prima di isolamento hanno le coppe dello schermo con diverse maglie in nylon dimensioni autoclave e pronto. <ol><li> Ottenere polmoni fetali da timed-incinta topo / ratto sulla E17-19 di gestazione. Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenenti terreno DMEM e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Effettuare tampone digestione in una provetta da 50 ml: (10 ml). Per questo volume, il tessuto polmonare di circa 20 feti di topo / ratto viene utilizzato. 8,5 ml di DMEM 0,5 ml di 500 mM HEPES pH 7.4 5 mg Collagenasi 1 5 mg Collagenasi 1A 1 ml di siero di pollo, inattivato a caldo </li><li>Mescolare bene fino a quando tutti i componenti sono sciolti e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron siringa all&#39;interno della cappa sterile. Posizionare il tubo conico contenente il tampone di digestione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il mezzo DMEM dal tubo conico da passo 2,1 e trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile. </li><li> Macinare i polmoni e con forbici sterili o lama di rasoio per rendere pezzi di tessuto meno di 1 mm e trasferire il tessuto nel tubo conico contenente preriscaldata dal passaggio tampone digestione 2,3. </li><li> Digerire il tessuto pipettando su e giù: 100 volte con 10 ml pipetta 100 volte con 5 ml pipetta 100 volte con pipetta Pasteur </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato a 1.300 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in 15 ml di DMEM più 20% FBS. </li><li> Togliere le tazze schermo con 100 -, 30 - e 15-micron in nylon e mesh ° postoem su sterili 150 ml bicchieri. </li><li> Aggiungi omogeneizzato cella dal punto 2.8 e filtrare in modo sequenziale attraverso il 100 -, 30 - e 15 micron tazze mesh. </li><li> Raccogliere aggregata non filtrati cellule dal 30 - e 15-micron maglie dopo numerosi lavaggi con DMEM + 10% FBS per facilitare la filtrazione di non-cellule epiteliali. </li><li> Eliminare il filtrato dai 15 micron in rete che contiene la maggior parte dei fibroblasti. </li><li> Purificare ulteriormente cellule di tipo II incubando le cellule da 2,11 a passo 75-cm 2 flaconi per 30 min (approximatelly10 ml di sospensione cellulare per pallone). </li><li> Raccogliere il supernatante e centrifugare a 1300 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in DMEM privo di siero. Il volume di risospensione dipende dalla quantità di tessuto trattati. Approssimativamente, si piastra l&#39;equivalente di cellule ottenute da un feto in ciascun pozzetto (2 ml) per Achieve tra il 60-70% di confluenza il giorno seguente. </li><li> Piastra di sospensione della cella BioFlex sei pozzetti rivestiti con laminina e fibronectina. </li></ol> 3. Isolamento di fibroblasti fetali polmonari roditori <ol><li> Seguire la stessa procedura descritta in precedenza per l&#39;isolamento delle cellule di tipo II fino a 2.11. </li><li> Prendere il filtrato dal 15-micron mesh (senza lavaggio precedente; volume approssimativo è 10-15 ml) e sulla piastra 75-cm 2 a 37 ° C per 30-60 min per permettere fibroblasti di aderire. </li><li> Aspirare il supernantant e sostituirlo con DMEM privo di siero e incubare durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, raccogliere le cellule con 0,25% (peso / vol) in tripsina 0,4 mM EDTA e piastra sulle placche BioFlex prerivestite con fibronectina. </li></ol> 4. Sistema sperimentale per fornire stimolazione meccanica alle cellule polmonari <ol><li> Seed le cellule (circa il 50% confluenti) su piastre di coltura BioFlex in DMEM privo di siero (2 ml / pozzetto) e farli attaccare e SPREad almeno 6 ore prima degli esperimenti. In generale il nostro laboratorio dispone di cellule in coltura per circa 24 ore prima di applicare sollecitazioni meccaniche. Se un numero specifico di cellule sono necessari per gli esperimenti, dopo l&#39;isolamento, cellule di tipo II sono mantenute in DMEM privo di siero da 75 cm 2 flaconi ed il giorno successivo, le cellule vengono tripsinizzate, contate e quindi seminate. </li><li> Il giorno dopo, vengono sostituiti con mezzi freschi DMEM privo di siero (2 ml / pozzetto) e le piastre BioFlex sono montati in un FX-5000 Flexcell unità Strain. Monostrati dovrebbe essere non superiore al 80% confluenti prima dell&#39;inizio degli esperimenti. </li><li> Ceppo Equibiaxial viene applicato alle membrane. Il regime di deformazione varia a seconda simulazione di forze meccaniche in vivo (si veda la discussione). </li><li> Le cellule cresciute su membrane non stirati coltivate in parallelo vengono usati come controlli. </li><li> Al termine degli esperimenti, monostrati possono essere elaborati per analizzare i cambiamenti di espressione genica (per esempio C proteina tensioattivo)dall&#39;abbondanza proteina-PCR in tempo reale, mediante Western blot, ecc Inoltre, monostrati può essere fissata per esperimenti immunocitochimica. Per questa tecnica, dopo la fissazione, membrane silastic vengono tagliati dalle piastre e montate su vetrini utilizzando 10-20 microlitri di acqua come agente di montaggio prima permeabilizzante e l&#39;incubazione con anticorpi. Il supernatante può anche essere usato per studiare la presenza di fattori di crescita, citochine, ecc </li></ol> 5. Rappresentativi risultati Figura 1 e Figura 2 mostrano rappresentativi contrasto di fase fotografie di E18 cellule fetali di topo di tipo II isolato impiegando la tecnica descritta in questo manoscritto. Figura 3 dimostra che induce sollecitazioni meccaniche differenziazione delle cellule fetali di tipo II epiteliali usando tensioattivo proteina-C come marcatore. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" /> Figura 1. Reppresentante a contrasto di fase fotografia scattata subito dopo l&#39;isolamento che illustra l&#39;aspetto agglomerato di cellule fetali di tipo II. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" /> Figura 2. E18 fetali di tipo II cellule epiteliali sono state isolate come descritto qui e piastrata su piastre rivestite con BioFlex laminina. Fotografia è stata scattata il giorno seguente, dopo non stirati cellule sono state fissate in paraformaldeide. La purezza delle cellule è stato determinato in 90 ± 5% mediante analisi microscopica della morfologia delle cellule epiteliali e immunocolorazione per SP-C. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" /> Figura 3. Fetali di tipo II, cellule epiteliali sono state esposte a deformazione ciclica del 5% a 40 cicli al minuto per 16 ore. A) Northern blot della proteina C surfattante (SP-C) espressione di mRNA mostrano che il ceppo induce la differenziazione delle cellule di tipo II utilizzando diversi substrati ECM . Segni + / - rappresentano l&#39;esposizione o di non sformare, rispettivamente. I dati sono presentati come media + / - SEM, n = 3; * P &lt;0,05 B) immagini Immunocitochimica fluorescenza che dimostrano SP livelli di proteina-C (verde) nelle cellule fetali di tipo II o non esposti (controllo) alle sollecitazioni meccaniche.. I nuclei sono state contrastate con DAPI (blu). Bar, 10 pm. C) i risultati Western Blot di tre esperimenti che mostrano che si estendono meccanica aumenta la proteina SP-C. N = 3; * P &lt;0,05.

<ol><li>Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+forces+on+lung-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression.</a> Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).</li>
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<li>Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+protects+cultured+fetal+rat+type+II+epithelial+cells+from+injury+induced+by+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).</li>
<li>Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+inflammatory+cytokines+released+by+fetal+mouse+lung+fibroblasts+exposed+to+mechanical+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch.</a> Pediatric Pulmonology. , (2011).</li>
<li>Kitterman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+fetal+lung+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Perinatol%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on fetal lung growth.</a> Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).</li>
<li>Harding, R. Fetal breathing movements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarding%2C+R+%22The+Lung%3A+Scientific+Fountations%22">The Lung: Scientific Fountations</a>. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).</li>
<li>Harding, R., Liggins, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thoracic+dimensions+induced+by+breathing+movements+in+fetal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep.</a> Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo manoscritto, si descrive un metodo per isolare le cellule fetali di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con l&#39;apparecchiatura di Strain Flexcell. Abbiamo utilizzato questa tecnica per valutare la differenziazione delle cellule epiteliali 1,2 e di studiare recettore e vie di segnalazione attivate da tratto 3-9. Inoltre, questo metodo può anche essere usato per studiare le risposte delle cellule indotte da lesioni meccaniche 10,11. La pro...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Serum di pollo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Bicchieri per setacciatura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>Maglia in nylon da 100 micron</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>Maglia da 30 micron</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>Maglia da 15 micron</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collagene-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Vitronettina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>Elastina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Bioflex</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>Non rivestita</td></tr><tr><td>Unità di stiramento Flexcell</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Forze meccaniche generate in utero da ripetitivi respiro, come movimenti e dalla distensione fluida sono fondamentali per lo sviluppo polmonare normale. Una componente chiave dello sviluppo del polmone è la differenziazione delle cellule epiteliali alveolari di tipo II, la principale fonte del surfattante polmonare. Queste cellule partecipano anche l&#39;omeostasi del liquido nel lume alveolare, la difesa ospite, e la riparazione del pregiudizio. Inoltre, cellule parenchimatiche polmonari distali possono essere direttamente esposti al tratto esagerata durante la ventilazione meccanica dopo la nascita. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari e cellulari con cui le cellule polmonari rilevano stimoli meccanici di influenzare lo sviluppo del polmone e per promuovere danno polmonare non sono completamente compresi. Qui, forniamo un metodo semplice e di elevata purezza per isolare cellule di tipo II e fibroblasti dai polmoni fetali roditori. Poi, ci descrivono un sistema in vitro, The Unit Strain Flexcell, per fornire la stimolazione meccanica alle cellule fetali, la simulazione di forze meccaniche insviluppo fetale del polmone o lesioni ai polmoni. Questo sistema sperimentale fornisce un ottimo strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari in cellule polmonari fetali esposte per allungare. Usando questo approccio, il nostro laboratorio ha identificato diversi recettori e proteine ​​di segnalazione che partecipano in meccanotrasduzione nello sviluppo del polmone fetale e danno polmonare.

Forze meccaniche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo del polmone e danno polmonare. Qui, descriviamo un metodo per isolare i roditori le cellule fetali del polmone di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema.

Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Le forze meccaniche generate in utero dai movimenti ripetitivi simili alla respirazione e dalla distensione fluida sono fondamentali per il normale sviluppo polmonare. Un elemento chiave...

Lo scopo di questa procedura è descrivere un sistema sperimentale per lo studio della trasduzione meccanica in cellule polmonari fetali. Questo viene ottenuto rivestendo piastre di coltura con proteine della matrice extracellulare. Successivamente vengono isolate cellule epiteliali di tipo due da polmone di topo fetale, seguite dall'isolamento di fibroblasti di topo fetale.L'ultimo passaggio descrive un sistema in vitro per fornire stimolazione meccanica alle cellule polmonari. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un aumento della differenziazione delle cellule di tipo due mediante PCR in tempo reale, western blot e immagini di immunoistochimica a fluorescenza. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della meccanotrasduzione, come lo sviluppo polmonare fetale e il danno polmonare.Il procedimento sarà dimostrato da Julian Gu, un tecnico del mio laboratorio. Mentre lavoriamo in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili, prepariamo 120 microgrammi di laminina con 12 millilitri di PBS sterile freddo 1X per piastra. Possono essere utilizzate altre proteine della matrice extracellulare per il rivestimento. Consultare il protocollo scritto per i dettagli, quindi prendere una piastra BioFlex non trattata e aggiungere due millilitri della soluzione di laminina in ogni pozzetto, ottenendo una concentrazione finale di due microgrammi per centimetro quadrato.Assicurarsi che le pozzette siano completamente ricoperte dalla soluzione. Coprire interamente la piastra con pellicola trasparente e posizionarla su una superficie piana in un ambiente a quattro gradi Celsius per tutta la notte, in modo da permettere al laminato di assorbirsi sul fondo delle pozzette. Le piastre rivestite possono essere conservate in queste condizioni per almeno una settimana mantenendo una buona funzionalità della matrice extracellulare anche il giorno successivo.In condizioni sterili, lavare i pozzetti tre volte con un XPBS. Quindi aggiungere un millilitro di 1% BSA in un XPBS a ciascun pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per bloccare i siti di legame non specifici sulle membrane.Quindi, lavare nuovamente le pozzette tre volte con un XPBS. Per rimuovere le proteine non assorbite, aggiungere un millilitro di DMEM in ciascuna pozzetta della piastra. Successivamente, conservare la piastra a 37 gradi Celsius fino all'isolamento delle cellule epiteliali di tipo II del polmone di roditore fetale e al loro utilizzo per la semina.Il giorno prima di iniziare la procedura di isolamento cellulare, assemblare i contenitori con filtri in nylon da 130 e 15 micron e sterilizzarli mediante autoclave. Autoclavare anche lo stesso numero di beute in vetro da 150 millilitri nel giorno della coltura. Ottenere i polmoni fetali da topo gravido a termine programmato tra il giorno E 17 e il giorno E 19 della gestazione.Trasferire il tessuto in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente mezzo DMEA e posizionarlo sul ghiaccio. Preparare un buffer di digestione fresco in un tubo da centrifuga da 50 millilitri seguendo la ricetta indicata nel protocollo scritto. Durante il lavoro in cappa a flusso laminare, sterilizzare filtrando attraverso un filtro da siringa da 0,2 micron.10 millilitri di questo tampone sono sufficienti per il tessuto polmonare ottenuto da circa 20 feti di topo. Posizionare il tubo conico contenente il tampone di digestione in un bagno termico a 37 gradi Celsius. Aspirare il mezzo dal tubo conico contenente il tessuto polmonare fetale e trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile utilizzando forbici sterili o una lametta, quindi tritare il tessuto in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro.Quindi trasferire il tessuto nel tubo conico contenente il buffer di digestione preriscaldato. Successivamente, favorire meccanicamente la digestione del tessuto pipettando su e giù cento volte ciascuna la sospensione cellulare di polmone fetale, utilizzando pipette con diametro decrescente. Al termine del processo di digestione, centrifugare l'omogeneato a 1.300 giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in 15 millilitri di DMEM aggiunto di FBS al 20%. Successivamente, prendere le coppette con filtri in nylon da 130 e 15 micron e posizionarle sopra becher sterili da 150 millilitri. Pipettare l'omogenato cellulare sulla maglia da 100 micron.Raccogliere il filtrato e trasferirlo con una pipetta sulla maglia da 30 micron. Lavare più volte la maglia da 30 micron con DMEM fresco più 10% di FBS. La maggior parte delle cellule di tipo due si aggrega e non passa attraverso la maglia.Questi lavaggi rimuovono le cellule non epiteliali che potrebbero essere attaccate agli aggregati. Applicare il filtrato dalla maglia da 30 micron al bicchiere con setaccio da 15 micron. Lavare nuovamente più volte come in precedenza.Questo passaggio recluta le cellule di tipo due che potrebbero aver attraversato il filtro da 30 micron. Raccogliere le cellule aggregate non filtrate dai filtri da 30 e da 15 micron per un ulteriore arricchimento delle cellule di tipo due. Conservare il filtrato del filtro da 15 micron se si prevede di coltivare fibroblasti polmonari di roditore fetale.In caso contrario, scartare questo filtrato. Successivamente, purificare la popolazione di cellule epiteliali di tipo due aggiungendo mezzo e incubando le cellule non filtrate provenienti dai contenitori con maglie da 30 e 15 micron in un’ampolla per colture cellulari da 75 centimetri quadrati per 30 minuti; dopo questa incubazione, centrifugare il sopranatante come in precedenza, rimuovere il pellet cellulare e quindi risospendere il pellet in due millilitri di DMEM senza siero per il feto. Pipettare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre BioFlex a sei pozzetti rivestite con laminina. A questo punto, le cellule appaiono raggruppate quando osservate al microscopio. Incubare la piastra in un’incubatrice per colture cellulari regolata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Un'incubazione di 24 ore è ottimale, ma è richiesta un'incubazione minima di sei ore.Prima di iniziare gli esperimenti di stress meccanico, prelevare il filtrato dalla maglia da 15 micron e trasferirlo in un’aliquota di 75 centimetri quadrati di fiala per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti, in modo da permettere l’adesione dei fibroblasti, quindi aspirare e scartare il surnatante. Successivamente, sostituire il volume nella fiala con DMEM privo di siero e incubare tutta la notte. Il giorno successivo, raccogliere le cellule con tripsina 0,25% in EDTA 0,4 millimolare e seminare su piastre BioFlex rivestite con fibronectina, incubando in un incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, idealmente per 24 ore prima di iniziare gli esperimenti di stress meccanico.È richiesta un'incubazione minima di sei ore se è necessario un numero specifico di cellule per gli esperimenti. Le cellule di tipo due vengono mantenute in fiaschi DMEM privi di siero di 75 centimetri quadrati dopo l'isolamento e, il giorno successivo, le cellule vengono trattate con tripsina, contate e quindi seminate. Il monolayer non deve superare l'80% di confluenza prima dell'inizio degli esperimenti. Nel giorno dell'esperimento di stimolazione meccanica, il mezzo di coltura cellulare viene sostituito con due millilitri di DMEM fresco privo di siero per pozzetto, e quindi la piastra viene montata su un'unità di stiramento Flexcell FX 5,000.Successivamente, applicare una deformazione biaxiale EQU alle membrane. Il regime di deformazione varia a seconda della simulazione delle forze meccaniche in vivo. Come discusso nel protocollo scritto, le cellule cresciute su membrane non ST stirate.Vengono utilizzati coltivati in parallelo come controlli per l'esperimento. Al termine dell'esperimento, i monociti possono essere sottoposti ad analisi per valutare le variazioni nell'espressione genica mediante PCR in tempo reale o le variazioni nell'abbondanza proteica mediante western blot. Inoltre, i monociti possono essere fissati per esperimenti di immunoistochimica relativi a questa tecnica.Dopo la fissazione, le membrane astiche vengono ritagliate dalle piastre e montate su vetrini utilizzando da 10 a 20 microlitri di acqua come agente di montaggio, prima della permeabilizzazione e dell'incubazione con anticorpi. I dati super ottenuti dall'esperimento possono essere utilizzati anche per indagare la presenza di sostanze rilasciate, come fattori di crescita o citochine. Questa immagine mostra cellule epiteliali fetali di tipo due a E 18 fissate con parmal, isolate secondo questo protocollo e seminate su piastre BioFlex rivestite con laminina.Le cellule sono state fissate ed è stata scattata la fotografia. Il giorno successivo, le cellule non sottoposte a stiramento ST sono state seminate. La purezza delle cellule è stata determinata essere del 90 più o meno 5% mediante analisi microscopica della morfologia delle cellule epiteliali e immunomarcatura per la proteina C del surfattante. Le figure seguenti presentano dati ottenuti da cellule epiteliali di tipo II fetali esposte a una deformazione ciclica del 5% a 40 cicli al minuto per 16 ore.Questo blot settentrionale dell'espressione dell'mRNA della proteina C del surfattante illustra che la deformazione indotta promuove la differenziazione delle cellule di tipo due mediante l'uso di diversi substrati di matrice extracellulare (ECM). I segni più e meno rappresentano rispettivamente l'esposizione o la mancata esposizione alla deformazione. I dati di espressione sono presentati nell'istogramma come media ± errore standard della media (SEM), con N uguale a tre; l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05.Queste immagini di immunofluorescenza mostrano i livelli della proteina C del surfattante in verde. Nelle cellule fetali di tipo due non esposte a sollecitazione meccanica a sinistra ed esposte a sollecitazione meccanica a destra, i nuclei sono stati controcolorati con DAPI, che appare blu. Questo istogramma quantifica i risultati di immunoblotting derivati da tre esperimenti, dimostrando che lo stiramento meccanico aumenta i livelli della proteina C del surfattante.In questo esperimento, N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come accelerare le cellule polmonari fetali ed esporle a una trazione meccanica.

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