Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Lo scopo di questa procedura è descrivere un sistema sperimentale per lo studio della trasduzione meccanica in cellule polmonari fetali. Questo viene ottenuto rivestendo piastre di coltura con proteine della matrice extracellulare. Successivamente vengono isolate cellule epiteliali di tipo due da polmone di topo fetale, seguite dall'isolamento di fibroblasti di topo fetale.

L'ultimo passaggio descrive un sistema in vitro per fornire stimolazione meccanica alle cellule polmonari. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un aumento della differenziazione delle cellule di tipo due mediante PCR in tempo reale, western blot e immagini di immunoistochimica a fluorescenza. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della meccanotrasduzione, come lo sviluppo polmonare fetale e il danno polmonare.

Il procedimento sarà dimostrato da Julian Gu, un tecnico del mio laboratorio. Mentre lavoriamo in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili, prepariamo 120 microgrammi di laminina con 12 millilitri di PBS sterile freddo 1X per piastra. Possono essere utilizzate altre proteine della matrice extracellulare per il rivestimento. Consultare il protocollo scritto per i dettagli, quindi prendere una piastra BioFlex non trattata e aggiungere due millilitri della soluzione di laminina in ogni pozzetto, ottenendo una concentrazione finale di due microgrammi per centimetro quadrato.

Assicurarsi che le pozzette siano completamente ricoperte dalla soluzione. Coprire interamente la piastra con pellicola trasparente e posizionarla su una superficie piana in un ambiente a quattro gradi Celsius per tutta la notte, in modo da permettere al laminato di assorbirsi sul fondo delle pozzette. Le piastre rivestite possono essere conservate in queste condizioni per almeno una settimana mantenendo una buona funzionalità della matrice extracellulare anche il giorno successivo.

In condizioni sterili, lavare i pozzetti tre volte con un XPBS. Quindi aggiungere un millilitro di 1% BSA in un XPBS a ciascun pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per bloccare i siti di legame non specifici sulle membrane.

Quindi, lavare nuovamente le pozzette tre volte con un XPBS. Per rimuovere le proteine non assorbite, aggiungere un millilitro di DMEM in ciascuna pozzetta della piastra. Successivamente, conservare la piastra a 37 gradi Celsius fino all'isolamento delle cellule epiteliali di tipo II del polmone di roditore fetale e al loro utilizzo per la semina.

Il giorno prima di iniziare la procedura di isolamento cellulare, assemblare i contenitori con filtri in nylon da 130 e 15 micron e sterilizzarli mediante autoclave. Autoclavare anche lo stesso numero di beute in vetro da 150 millilitri nel giorno della coltura. Ottenere i polmoni fetali da topo gravido a termine programmato tra il giorno E 17 e il giorno E 19 della gestazione.

Trasferire il tessuto in un tubo da centrifuga da 50 millilitri contenente mezzo DMEA e posizionarlo sul ghiaccio. Preparare un buffer di digestione fresco in un tubo da centrifuga da 50 millilitri seguendo la ricetta indicata nel protocollo scritto. Durante il lavoro in cappa a flusso laminare, sterilizzare filtrando attraverso un filtro da siringa da 0,2 micron.

10 millilitri di questo tampone sono sufficienti per il tessuto polmonare ottenuto da circa 20 feti di topo. Posizionare il tubo conico contenente il tampone di digestione in un bagno termico a 37 gradi Celsius. Aspirare il mezzo dal tubo conico contenente il tessuto polmonare fetale e trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile utilizzando forbici sterili o una lametta, quindi tritare il tessuto in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro.

Quindi trasferire il tessuto nel tubo conico contenente il buffer di digestione preriscaldato. Successivamente, favorire meccanicamente la digestione del tessuto pipettando su e giù cento volte ciascuna la sospensione cellulare di polmone fetale, utilizzando pipette con diametro decrescente. Al termine del processo di digestione, centrifugare l'omogeneato a 1.300 giri al minuto per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in 15 millilitri di DMEM aggiunto di FBS al 20%. Successivamente, prendere le coppette con filtri in nylon da 130 e 15 micron e posizionarle sopra becher sterili da 150 millilitri. Pipettare l'omogenato cellulare sulla maglia da 100 micron.

Raccogliere il filtrato e trasferirlo con una pipetta sulla maglia da 30 micron. Lavare più volte la maglia da 30 micron con DMEM fresco più 10% di FBS. La maggior parte delle cellule di tipo due si aggrega e non passa attraverso la maglia.

Questi lavaggi rimuovono le cellule non epiteliali che potrebbero essere attaccate agli aggregati. Applicare il filtrato dalla maglia da 30 micron al bicchiere con setaccio da 15 micron. Lavare nuovamente più volte come in precedenza.

Questo passaggio recluta le cellule di tipo due che potrebbero aver attraversato il filtro da 30 micron. Raccogliere le cellule aggregate non filtrate dai filtri da 30 e da 15 micron per un ulteriore arricchimento delle cellule di tipo due. Conservare il filtrato del filtro da 15 micron se si prevede di coltivare fibroblasti polmonari di roditore fetale.

In caso contrario, scartare questo filtrato. Successivamente, purificare la popolazione di cellule epiteliali di tipo due aggiungendo mezzo e incubando le cellule non filtrate provenienti dai contenitori con maglie da 30 e 15 micron in un’ampolla per colture cellulari da 75 centimetri quadrati per 30 minuti; dopo questa incubazione, centrifugare il sopranatante come in precedenza, rimuovere il pellet cellulare e quindi risospendere il pellet in due millilitri di DMEM senza siero per il feto. Pipettare un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre BioFlex a sei pozzetti rivestite con laminina. A questo punto, le cellule appaiono raggruppate quando osservate al microscopio. Incubare la piastra in un’incubatrice per colture cellulari regolata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Un'incubazione di 24 ore è ottimale, ma è richiesta un'incubazione minima di sei ore.

Prima di iniziare gli esperimenti di stress meccanico, prelevare il filtrato dalla maglia da 15 micron e trasferirlo in un’aliquota di 75 centimetri quadrati di fiala per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti, in modo da permettere l’adesione dei fibroblasti, quindi aspirare e scartare il surnatante. Successivamente, sostituire il volume nella fiala con DMEM privo di siero e incubare tutta la notte. Il giorno successivo, raccogliere le cellule con tripsina 0,25% in EDTA 0,4 millimolare e seminare su piastre BioFlex rivestite con fibronectina, incubando in un incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, idealmente per 24 ore prima di iniziare gli esperimenti di stress meccanico.

È richiesta un'incubazione minima di sei ore se è necessario un numero specifico di cellule per gli esperimenti. Le cellule di tipo due vengono mantenute in fiaschi DMEM privi di siero di 75 centimetri quadrati dopo l'isolamento e, il giorno successivo, le cellule vengono trattate con tripsina, contate e quindi seminate. Il monolayer non deve superare l'80% di confluenza prima dell'inizio degli esperimenti. Nel giorno dell'esperimento di stimolazione meccanica, il mezzo di coltura cellulare viene sostituito con due millilitri di DMEM fresco privo di siero per pozzetto, e quindi la piastra viene montata su un'unità di stiramento Flexcell FX 5,000.

Successivamente, applicare una deformazione biaxiale EQU alle membrane. Il regime di deformazione varia a seconda della simulazione delle forze meccaniche in vivo. Come discusso nel protocollo scritto, le cellule cresciute su membrane non ST stirate.

Vengono utilizzati coltivati in parallelo come controlli per l'esperimento. Al termine dell'esperimento, i monociti possono essere sottoposti ad analisi per valutare le variazioni nell'espressione genica mediante PCR in tempo reale o le variazioni nell'abbondanza proteica mediante western blot. Inoltre, i monociti possono essere fissati per esperimenti di immunoistochimica relativi a questa tecnica.

Dopo la fissazione, le membrane astiche vengono ritagliate dalle piastre e montate su vetrini utilizzando da 10 a 20 microlitri di acqua come agente di montaggio, prima della permeabilizzazione e dell'incubazione con anticorpi. I dati super ottenuti dall'esperimento possono essere utilizzati anche per indagare la presenza di sostanze rilasciate, come fattori di crescita o citochine. Questa immagine mostra cellule epiteliali fetali di tipo due a E 18 fissate con parmal, isolate secondo questo protocollo e seminate su piastre BioFlex rivestite con laminina.

Le cellule sono state fissate ed è stata scattata la fotografia. Il giorno successivo, le cellule non sottoposte a stiramento ST sono state seminate. La purezza delle cellule è stata determinata essere del 90 più o meno 5% mediante analisi microscopica della morfologia delle cellule epiteliali e immunomarcatura per la proteina C del surfattante. Le figure seguenti presentano dati ottenuti da cellule epiteliali di tipo II fetali esposte a una deformazione ciclica del 5% a 40 cicli al minuto per 16 ore.

Questo blot settentrionale dell'espressione dell'mRNA della proteina C del surfattante illustra che la deformazione indotta promuove la differenziazione delle cellule di tipo due mediante l'uso di diversi substrati di matrice extracellulare (ECM). I segni più e meno rappresentano rispettivamente l'esposizione o la mancata esposizione alla deformazione. I dati di espressione sono presentati nell'istogramma come media ± errore standard della media (SEM), con N uguale a tre; l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05.

Queste immagini di immunofluorescenza mostrano i livelli della proteina C del surfattante in verde. Nelle cellule fetali di tipo due non esposte a sollecitazione meccanica a sinistra ed esposte a sollecitazione meccanica a destra, i nuclei sono stati controcolorati con DAPI, che appare blu. Questo istogramma quantifica i risultati di immunoblotting derivati da tre esperimenti, dimostrando che lo stiramento meccanico aumenta i livelli della proteina C del surfattante.

In questo esperimento, N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come accelerare le cellule polmonari fetali ed esporle a una trazione meccanica.