Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Forze meccaniche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo del polmone e danno polmonare. Qui, descriviamo un metodo per isolare i roditori le cellule fetali del polmone di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con un

Lo scopo di questa procedura è quello di descrivere un sistema sperimentale per studiare la trasduzione meccanica in cellule polmonari fetali. Ciò si ottiene codificando piastre di coltura con proteine della matrice extracellulare. Quindi vengono isolate le cellule epiteliali del polmone fetale di topo di tipo due, seguite dall'isolamento dei fibroblasti fetali di topo.

La fase finale descrive un sistema in vitro per fornire stimolazione meccanica alle cellule polmonari. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un aumento della differenziazione delle cellule di tipo due attraverso PCR in tempo reale, western blot e immagini immunochimiche a fluorescenza. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trasduzione meccano, come lo sviluppo polmonare fetale e le lesioni polmonari.

A dimostrare la procedura sarà Julian gu, un tecnico del mio laboratorio Mentre stiamo lavorando in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili produce 120 microgrammi di laminina con 12 millilitri di freddo sterile un XPBS per piastra. Altre proteine della matrice extracellulare possono essere utilizzate per il rivestimento. Consultare il protocollo scritto per i dettagli, quindi prendere una piastra BioFlex non trattata e aggiungere due millilitri della soluzione laminata a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di due microgrammi per centimetro quadrato.

Assicurati che i pozzetti siano completamente coperti dalla soluzione. Coprire completamente la piastra con pellicola trasparente e posizionarla su una superficie piana in un ambiente a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire al laminato di assorbire sul fondo dei pozzetti. Le piastre rivestite possono essere conservate in queste condizioni per almeno una settimana, mantenendo una buona funzione ECM il giorno successivo.

In condizioni sterili, lavare i pozzetti tre volte con un XPBS. Quindi aggiungere un millilitro di 1% BSA in un XPBS a ciascuno. Incubare bene a 37 gradi Celsius per un'ora per bloccare i siti di legame aspecifici sulle membrane.

Poi di nuovo, lavare i pozzetti tre volte con un XPBS. Per rimuovere le proteine non assorbite, aggiungere un millilitro di DMEM a ciascun pozzetto della piastra. Quindi conservare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule epiteliali del polmone fetale di roditore di tipo due sono isolate e pronte per la piastra.

Il giorno prima di iniziare la procedura di isolamento cellulare, assemblare le coppette con reti di nylon da 130 e 15 micron e sterilizzarle in autoclave. Inoltre in autoclave lo stesso numero di picchi di vetro da 150 millilitri il giorno della coltura. Ottenere polmoni fetali da topo gravido cronometrato da E 17 a 19 di gestazione.

Trasferire il fazzoletto in una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente terreno DMEA e metterlo sul ghiaccio. Preparare un tampone di digestione fresco in una provetta da centrifuga da 50 millilitri secondo la ricetta nel protocollo scritto. E mentre si lavora in un filtro a cappa a flusso laminare, sterilizzare attraverso un filtro per siringa da 0,2 micron.

10 millilitri di questo tampone sono sufficienti per il tessuto polmonare ottenuto da circa 20 feti di topo. Mettere il tubo conico contenente il tampone di digestione a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Estrarre il dium dal tubo conico contenente il tessuto polmonare fetale e trasferire il tessuto in una capsula di Petri sterile utilizzando forbici sterili o una lama di rasoio, tritare il tessuto in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro.

Quindi trasferire il tessuto nel tubo conico contenente il tampone di digestione preriscaldato. Successivamente, aiutare meccanicamente la digestione del tessuto pipettando la sospensione di cellule polmonari fetali su e giù un centinaio di volte ciascuna utilizzando pipette di dimensioni decrescenti dell'apertura. Al termine del processo di digestione, centrifugare l'omogeneizzato a 1.300 giri/min per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere con cura il supino per aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in 15 millilitri di DMEM più il 20% di FBS. Quindi, recupera le tazze del vaglio con reti di nylon da 130 e 15 micron e posizionale sopra i becher sterili da 150 millilitri. Pipettare l'omogeneizzato di cellule sulla maglia da 100 micron.

Raccogliere il filtrato e pipettarlo sulla maglia da 30 micron. Lavare più volte la rete da 30 micron con DMEM fresco più il 10% di FBS. La maggior parte delle cellule di tipo due si aggrega e non passa attraverso la rete.

Questi lavaggi rimuovono le cellule non epiteliali che possono essere attaccate ai grumi. Applicare il filtrato dalla maglia da 30 micron alla coppa del vaglio da 15 micron. Ancora una volta, lavare più volte come prima.

Questo passaggio recluta le cellule di tipo due che potrebbero essere passate attraverso la maglia da 30 micron. Raccogliere le cellule raggruppate non filtrate dalle maglie da 30 e 15 micron per un ulteriore arricchimento delle cellule di tipo due. Trattenere il filtrato dalla maglia da 15 micron se si devono coltivare fibroblasti polmonari fetali di roditori.

In caso contrario, scartare questo filtrato. Ulteriore. Purificare la popolazione di cellule epiteliali di tipo due aggiungendo terreni e incubando le cellule non filtrate dalle coppe a rete da 30 e 15 micron in un pallone di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati per 30 minuti dopo questa centrifuga di incubazione il nome super come prima, de pellet le cellule e poi risospendere il pellet in due millilitri di siero libero DMEM pro fetus pipetta un millilitro della sospensione cellulare in ciascun pozzetto del laminato rivestito Piastre BioFlex a sei pozzetti a questo punto, le cellule appaiono in grumi se osservate al microscopio, incubano la piastra in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Un'incubazione di 24 ore è ottimale ed è richiesta un'incubazione minima di sei ore.

Prima di iniziare gli esperimenti di deformazione meccanica, prelevare il filtrato dalla maglia da 15 micron e trasferirlo in un pallone di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti per consentire ai fibroblasti di aderire, aspirare e scartare lo stato. Quindi sostituire il volume nel pallone con DMEM privo di siero e incubare per una notte. Il giorno successivo, raccogliere le cellule con tripsina allo 0,25% in EDTA da 0,4 millimolari e piastarle su piastre BioFlex rivestite di fibronectina, incubare in un incubatore di coltura tissutale impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, idealmente per 24 ore prima di iniziare gli esperimenti di deformazione meccanica.

È necessaria un'incubazione minima di sei ore se per gli esperimenti è richiesto un numero specifico di cellule. Le cellule di tipo due vengono mantenute in fiasche di DMEM da 75 centimetri quadrati prive di siero dopo l'isolamento e il giorno successivo le cellule vengono contate con tripli e quindi posizionate Il monostrato non deve essere superiore all'80% confluente prima dell'inizio degli esperimenti. Il giorno dell'esperimento di stimolazione meccanica, il terreno di coltura cellulare viene sostituito con due millilitri di DMEM fresco privo di siero per pozzetto e la piastra viene quindi montata in un'unità di ceppo FX 5.000 a celle flessibili.

Quindi, applicare la deformazione biassiale EQU alle membrane. Il regime di deformazione varia a seconda della simulazione delle forze meccaniche in vivo. Come discusso nel protocollo scritto, le cellule cresciute su membrane allungate non ST

I coltivati in parallelo vengono utilizzati come controlli per l'esperimento. Al termine dell'esperimento, i monostrati possono essere elaborati per analizzare i cambiamenti nell'espressione genica mediante PCR in tempo reale o i cambiamenti nell'abbondanza proteica mediante western blot. Inoltre, i monostrati possono essere fissati per esperimenti di immunochimica per questa tecnica.

Dopo il fissaggio, le membrane astiche vengono ritagliate dalle piastre e montate su vetrini utilizzando da 10 a 20 microlitri di acqua come agente di montaggio prima della permeazione e dell'incubazione con anticorpi. La super datina dell'esperimento può essere utilizzata anche per studiare la presenza di sostanze rilasciate come fattori di crescita o citochine. Questa immagine mostra le cellule epiteliali fetali E 18 di tipo 2 fissate parmali che sono state isolate come in questo protocollo e piastrate su piastre BioFlex codificate con laminina.

Le celle sono state fissate ed è stata scattata la fotografia. Il giorno dopo sono state piastrate le cellule di stiramento non-ST. La purezza delle cellule è stata determinata al 90% più o meno il 5% mediante analisi microscopica della morfologia delle cellule epiteliali e immunocolorazione per la proteina C del tensioattivo. Le figure seguenti presentano i dati delle cellule epiteliali fetali di tipo due che sono state esposte a una deformazione ciclica del 5% a 40 cicli al minuto per 16 ore.

Questo northern blot dell'espressione dell'mRNA della proteina C del tensioattivo illustra che il ceppo induce la differenziazione cellulare di tipo due utilizzando diversi substrati della ECM. I segni più meno rappresentano rispettivamente l'esposizione alla tensione o la nessuna esposizione alla tensione. I dati dell'espressione sono presentati nell'istogramma come media più o meno SEM, N uguale a tre e l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05.

Queste immagini immunochimiche a fluorescenza mostrano i livelli di proteina C del tensioattivo in verde. Nel tipo fetale due cellule non esposte a sollecitazioni meccaniche a sinistra e esposte a sollecitazioni meccaniche sui nuclei destri sono state controcolorate con dapi, che appare blu. Questo istogramma quantifica i risultati del western blot di tre esperimenti che dimostrano che l'allungamento meccanico aumenta i livelli della proteina C del tensioattivo.

In questo esperimento, N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,05. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come accelerare le cellule polmonari fetali ed esporle all'allungamento meccanico.