Name: Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da Xenopus Nervo-muscolo Co-colture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Impara a ottenere colture primarie di neuroni spinali e cellule muscolari sinapticamente accoppiate da embrioni di Xenopus. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche simultanee pre- e post-sinaptiche per studiare la fisiologia sinaptica.

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1. Pre-sperimentale Preparazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni (cfr. tabella 1 per le composizioni): (a) 1 NFR litro (Ringer Rana normale), (b) soluzione fisiologica 100 ml al 10%, (c) 100 ml di CMF (Ca 2 + / Mg 2 + soluzione senza ), (d) 1 ml ITS (Insulin-transferrina-selenio, Sigma I1884), (e) 100 ml di mezzo L-15 cultura, (f) 10 ml HCG (gonadotropina corionica umana Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-soluzione interna, (h) 100 ml K +-interna soluzione Amfotericina B. La forza osmotica della soluzione 1 dovrebbe essere controllata per assicurarsi che esso è di circa 260 mOsm osmometro utilizzando una pressione di vapore (ad esempio modello Wescor # 5100C) . </li><li> Filtrare sterilizzare soluzioni (b) e (c). Soluzioni (a) (b) e (c) possono essere memorizzati fino a tre mesi a 4 ° C. Preparare la soluzione (d) aggiungendo 1 ml H 2 O deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale cun essere conservato a 4 ° C per 30 giorni. </li><li> Preparare la soluzione (e) in una cappa a flusso laminare combinando tutti i componenti in un becher o beuta. Filtrare sterilizzare la soluzione finale e trasferire aliquote da 10 ml in provette per centrifuga sterili. Conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare la HCG (soluzione (f)) aggiungendo 10 ml H 2 0 deionizzata al flaconcino contenente la polvere liofilizzata attraverso un ago calibro 25 e filtro siringa siringa. Questa soluzione finale può essere conservato a 4 ° C per 30 giorni. </li><li> Realizzare almeno due utensili microdissezione incollando un perno Minutien (26.002-10, Science Tools Belle) alla fine di una pipetta Pasteur di vetro con colla di cianoacrilato. Consentire la punta del perno di estendere oltre la fine della pipetta circa 0,5 cm. </li><li> Due giorni prima la preparazione culture, indurre l&#39;allevamento con la seguente procedura. Identificare un allevamento-ready paio di Xenopus osservando un importante, cloaca rossastro sulla pigmentazione scura femminile e sul do planarerfaccia delle zampe anteriori del maschio. Uno alla, tempo netto ogni rana e tenerlo lato ventrale verso il basso su un lavandino con la rete in modo che non può sfuggire. Iniettare 1 ml di soluzione di (f) attraverso la rete e per via sottocutanea in una delle sacche linfatici dorsali. </li><li> Posizionare la coppia di riproduttori insieme in una coperta dieci galloni di acqua. Per garantire che gli animali non possano calpestare le uova di recente e di cui fecondato, installare un pavimento schermato con maglie di dimensioni pari a circa ½ &quot;montati circa 1-2 centimetri sopra il fondo del serbatoio (Figura 1A). </li><li> Lasciare inalterate le rane per 12-48 ore fino a quando gli animali sono in amplexus e uova fecondate si osservano al piano di sotto dello schermo (Figura 1B). </li><li> Rimuovere gli animali dal serbatoio, ma lasciare le uova indisturbati per almeno 24 ore più a lungo. Questa coppia di rane possono essere fatte fecondare dopo sei settimane. </li><li> Allentare gli embrioni dal fondo del serbatoio e trasferirli a quattro o cinque millimetri culto 60x15piatti ure contenenti 10% salina (soluzione B). Ordina gli embrioni per fase secondo lo schema di Niewkoop e Faber (rif. 20). Embrioni utili saranno quelli in fase di 22-24. Figura 2A mostra un embrione allo stadio di circa 22 mentre 2B figura mostra un embrione che è troppo avanti in fase di sviluppo per essere utile (circa fase 28). E &#39;importante scegliere gli embrioni che sono sani: quelli che sono lisce in apparenza con chiazze marrone chiaro e bianco sono l&#39;ideale. Gli embrioni che hanno grandi macchie nere o bianche sono generalmente malsana e inutilizzabile. </li></ol> 2. Microdissezione di embrioni di Xenopus <ol><li> All&#39;interno di una cappa a flusso laminare, etichetta e riempire a metà strada circa tre piastre di coltura sterile 60x15 mm con 10% di soluzione salina, e uno con CMF. </li><li> Utilizzando una sterile, vetro trasferimento pipetta Pasteur 5-10 22-24 embrioni in stadio uno dei piatti contenenti 10% di soluzione salina. Con l&#39;aiuto di uno zoom stereo sezionaremicroscopio zione all&#39;interno della cappa (0,6-5x con oculari 10 x), rimuovere lo strato di gelatina e la membrana vitellina da ciascun embrione con due coppie di pinze sterili N ° 5 (11251-30, strumenti per le scienze Arti). (Vedi Figure 3A e 3B). </li><li> Lavare gli embrioni nudi facendoli passare, uno alla volta, attraverso i rimanenti due piatti di 10% soluzione salina ed infine nel piatto contenente CMF. Utilizza una nuova pipetta sterile per ogni trasferimento e ridurre al minimo il volume della soluzione è trasferito da piatto a piatto. </li><li> A sua volta, ciascun embrione tenere saldamente ma delicatamente con una pinza e, utilizzando lo strumento microdissezione modellato nel passo 1,5, rimuovere il tubo neurale e myotomes associati che si trovano al aspetto più dorsale dell&#39;animale. Farlo facendo tre sezioni, una a ciascuna estremità del percorso del tubo neurale e un terzo solo ventrale ad esso (Figura 4A). Spostare ogni tubo neurale sezionato / myotome ad una parte pulita del piatto dal Granul tuorloES e altri detriti (Figura 4B). Il dorso-ventrale asse, e le posizioni del tubo neurale e myotomes sono indicati in figura 4. </li><li> Dopo circa quindici minuti in questa soluzione (CMF) pinze uso per sollevare la pelle pigmentata libera del tessuto sezionato e scartare. Dopo un ulteriore 30-60 min, le cellule formano un &quot;mucchio di sabbia&quot; come si dissociano uno dall&#39;altro (Figura 4C). </li></ol> 3. Preparazione del nervo-muscolo co-colture <ol><li> Scongelare una provetta da 10 ml di terreno di coltura e in asepsi aggiungere 70 microlitri ITS e 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Etichetta e riempire 35 capsule di Petri sterili mm (FD35-100 Strumenti di precisione del mondo) circa a metà strada con L-15 terreno di coltura (soluzione (e)), uno per ogni embrione sezionato. </li><li> Fabbricare una pipetta placcatura afferrando ciascuna estremità di una pipetta Pasteur di vetro mentre si tiene la porzione rastremata sulla fiamma. Tirare le estremità a parte per circa 10 centimetri e poi si staccano alla fine per ottenere una punta di circa 0,2 mm. </li><li> Utilizzare la pipetta placcatura per aspirare la &quot;pila sabbia&quot; da un embrione minimizzare la quantità di soluzione disegnata. Espellere le cellule sul fondo di un piatto di coltura. Piastra le cellule in diverse righe. Osservare placcati cellule indifferenziate (Figura 5A e 5B). </li><li> Lasciare i piatti a base di cellule placcati indisturbati per almeno quindici minuti per lasciare il tempo alle cellule di attaccarsi al piatto. </li></ol> 4. Patch di serraggio nervo-muscolo Sinapsi <ol><li> Dopo 12-24 ore di coltura, le cellule placcati assumono distinte caratteristiche morfologiche: cellule muscolari diventano fusiforme e neuroni spinali estendere i processi lunghi (Figura 6). Funzionale contatto sinaptico tra varicosità dei neuriti e le cellule muscolari possono essere confermate con registrazioni simultanee coppie elettrofisiologiche. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; e &quot;V&quot; si riferiscono rispettivamente alla cellula muscolare, neuronalesoma e varici presinaptica. </li><li> Preparare due elettrodi di patch per la registrazione: uno per il varici presinaptica e uno per la cellula muscolare. </li><li> Per l&#39;elettrodo presinaptica, preparare una soluzione contenente amfotericina come segue: Aggiungere 100 microlitri di DMSO in una provetta da 1,5 ml contiene 5 mg di amfotericina B (Sigma A4888). Vortex questa soluzione per 10 sec. Successivamente, aggiungere 10 ml di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga seconda contiene 625 K + ul-interno soluzione per Amfotericina B (soluzione di (h)). Vortice come sopra. </li><li> Riempire il pre-sinaptica elettrodo con l&#39;amfotericina contenente K +-interna soluzione preparata nella fase 4.3 e il post-sinaptica elettrodo con K +-interna soluzione (soluzione (g)). </li><li> Sostituire i media nel piatto cultura con NFR e si stabilisce in un microscopio invertito dotato di ottica di contrasto di fase. </li><li> Posizionare entrambi gli elettrodi appena sopra i rispettivi obiettivi. Ottenere l&#39;intera co-cellnfiguration con l&#39;elettrodo cellula muscolare prima configurazione di patch perforato con l&#39;elettrodo varici. </li><li> Per confermare la funzionalità della sinapsi, depolarizzare il varici con un amplificatore patch clamp (es Axopatch 200B, Molecular Devices) sotto controllo software (ad esempio pClamp 9, Molecular Devices) sia per la corrente simultanee presinaptici e postsinaptici. Figura 7 mostra le correnti viste in risposta a depolarizzante fasi di tensione dati al varici presinaptico con incrementi di 10 mV da -30 mV a +40 mV. Le correnti attivo visti nella cellula presinaptica sono portati da Na + e Ca 2 + e le correnti esteriori di K +. Le correnti registrate nella cellula postsinaptica sono risposte a neurotrasmettitore rilasciato dal varici e si svolgono per lo più da Na + attraverso i canali recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi chiave nel successo di co-coltura dei motoneuroni e le cellule muscolari sono l&#39;uso di embrioni prodotti opportunamente messo in scena dalla riproduzione indotta delle rane Xenopus, e la dissezione attenta asettica dei neuroni spinali e mioblasti indifferenziati. Uova fecondate deve essere lasciato indisturbato fino a raggiungere circa il 10 o in scena in modo da farli muovere prima spesso si ferma il loro sviluppo. Embrioni sani sono identificati da un aspetto liscio e una colorazione marrone e bianco screziato. Fase 22-24 embrioni sono i più utili, perché questo è il punto durante lo sviluppo solo dopo la chiusura del tubo neurale e prima che i miociti sono differenziate in modo significativo. Inoltre, le cellule di embrioni anziani non dissociare bene in CMF. Si deve prestare attenzione durante la rimozione della membrana vitellina quanto aderisce fortemente l&#39;embrione. La membrana deve essere lacerato usando pinze taglienti modo che l&#39;embrione emerge intatto. Un altro importante precaution è quello di posizionare con cura le cellule sul fondo del piatto cultura (piuttosto che lasciare a sistemarsi lì). Questo metodo è preferito poiché ciò aumenta la probabilità che le cellule aderiscono al piatto di coltura. Neurotrasmissione funzionale tra nervo e muscolo può essere determinato con la registrazione solo postsinaptico e spesso può essere accertata con l&#39;osservazione di contrazione muscolare spontanea dopo innervazione. Un-cellule muscolari innervate non contorcersi nella cultura. Registrazione postsinaptico solo è utile per registrare correnti endplate in miniatura o potenziali, ma le misure di rilascio evocato richiede la stimolazione presinaptica, e la correlazione delle correnti pre-e postsinaptici richiede il doppio del patch-clamp. Oltre al paired-cerotto metodo di registrazione descritto qui, questa preparazione offre la possibilità di introdurre una pipetta terzo al neuronale soma 5 Questo consente la generazione di un potenziale d&#39;azione that può propagare al varici presinaptica e portare al rilascio di neurotrasmettitore. Inoltre, agenti putativi che si pensa di mediare o modulare la trasmissione sinaptica può essere introdotto per entrambi i lati della sinapsi: tramite la pipetta cellula muscolare o per diffusione da una pipetta terzo posto al soma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / Forniture </td><td> Venditore </td><td> Catalogo / Numero di modello </td><td></td></tr><tr><td> Insulina-transferrina-selenio </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> Gonadotropina corionica umana </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pressione di vapore osmometro </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione Nome </td><td> Ricetta </td></tr><tr><td> (A) NFR (Ringer rana normale (in mM) </td><td> 116 NaCl, KCl 2, CaCl 2 1,8, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) soluzione salina al 10% </td><td> 10 ml NFR 90 ml di H 2 O deionizzata </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + senza soluzione) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) Media L-15 Cultura </td><td> 50 ml L-15 supporti (Sigma L1518) + 50 NFR ml. </td></tr><tr><td> (G) + K-soluzione interna (in mM) </td><td> 116 KCl, NaCl 1, 1 MgCl 2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-interna soluzione Amfotericina B (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, EGTA 1, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; xenopus</em&gt; nervo-muscolo co-colture

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Molte informazioni circa l&#39;accoppiamento di presinaptici correnti ioniche, con il rilascio di neurotrasmettitore è stato ottenuto da preparati invertebrati, in particolare il calamaro gigante sinapsi 1. Tuttavia, fatta eccezione per la preparazione descritto qui, preparazioni vertebrati esistono pochi in cui è possibile effettuare misure simultanee di rilascio di neurotrasmettitore e presinaptici correnti ioniche. Embrionali motoneuroni Xenopus e cellule muscolari possono essere coltivate insieme in mezzo di coltura semplice a temperatura ambiente; formeranno sinapsi funzionali entro 12-24 ore, e può essere usato per studiare nervo e lo sviluppo delle cellule muscolari e interazioni sinaptiche per diversi giorni (fino crescita eccessiva si verifica). Alcuni vantaggi di questi co-colture oltre preparazioni vertebrati comprendono la semplicità di preparazione, la capacità di mantenere le culture e lavorare a temperatura ambiente, e la pronta accessibilità delle sinapsi formate 2-4. Il preparato è stato ampiamente utilizzato per studiare le proprietà biofisiche dei canali ionici presinaptici e la regolamentazione di rilascio del trasmettitore 5-8. Inoltre, la preparazione si è prestata ad altri usi compresi lo studio dei neuriti e sinaptogenesi 9-12, meccanismi molecolari di neurotrasmettitore rilascio 13-15, il ruolo di messaggeri diffusibili in neuromodulazione 16,17, e nella plasticità sinaptica vitro 18 - 19.

Figura 4B mostra la vista dorsale di un isolato midollo spinale / myotome immediatamente dopo la sua rimozione da uno stadio embrionale di Xenopus 22. Figura 4C mostra che, dopo la soluzione per la rimozione della pelle e incubazione in Ca 2 +-Mg 2 + senza soluzione (CMF, ( c)), le cellule si dissociano in un &quot;mucchio di sabbia&quot; e sono pronti per la placcatura. Subito dopo la placcatura in cellule terreno di coltura mostrano poca variabilità morfologica (Figura 5B), ma assumono forme distinte dopo ventiquattro ore di cultura. Cellule muscolari diventano fusiforme mentre neuroni rimangono sferica mentre neuriti che si estendono varicosites elaborati in sinapsi con cellule muscolari (Figura 6). Registrazione simultanea di patch accoppiato dal varici presinaptica e postsinaptica delle cellule muscolari (Figura 7) rivela le correnti presinaptici entrata e di uscita associati con il rilascio di neurotrasmettitore e il resultant eccitatori correnti postsinaptiche. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 A:.. Paio Allevamento di rane nel secchio di accoppiamento in cima schermo B: Frogs in amplexus con le uova fecondate. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:.. Fase di &quot;adatto&quot; 22 embrione B: fase di &quot;non idoneo&quot; 28 embrioni. Barra della scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3:. Tappa 22 embrione prima della rimozione della membrana vitellina e cappotto gelatina. La freccia indica il bordo esterno del mantello gelatina. La membrana vitellina aderisce strettamente alla Embranni ed è praticamente invisibile B:. embrione Bare. Barra della scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4 A: Fase 22 embrione con una linea tratteggiata che indica a essere sezionato parte B:.. Acuto isolato porzione dorsale dell&#39;embrione, &quot;d&quot; e &quot;v&quot; si riferiscono agli aspetti dorsale e ventrale degli embrioni, mentre &quot;m&quot; e &quot;n&quot; indica la posizione approssimativa dei mytomes e il tubo neurale C:. &quot;mucchio di sabbia&quot; di cellule dopo 60 min in CMF. Barra della scala rappresenta 1 mm per A, e 0,5 mm per B e C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5 A:. Vista potenza 5x di cellule in coltura immediatamente dopo fasciame. B: la cultura stessa a 40x. Scalabarra rappresenta 40 pm per A, e 5 micron per la B. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Giunzione neuromuscolare in coltura con identificazione del soma neuronale (S), varici presinaptico (V), e la cellula muscolare postsinaptica (M). Scala bar: 5 micron. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Figura 7. Presinaptici (in alto) e postsinaptici (basso) correnti osservate in risposta all&#39;applicazione di tensione 10 mV incrementale passaggi presentati al varici presinaptica da -30 mV a +40 mV. Gradini di tensione sono indicati accanto ad alcune delle tracce presinaptici. Il potenziale di mantenimento per entrambe le celle era -70 mV.

Questo video mostra le procedure utilizzate per coltivare colture primarie di embrionale<em&gt; Xenopus</em&gt; Cellule nervose e muscolari e l&#39;utilità di questo preparato per la realizzazione simultanea di pre-e post-sinaptica registrazioni patch clamp.

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è ottenere colture primarie di neuroni spinali e cellule muscolari accoppiati sinapticamente da embrioni di Xenopus. Questo viene realizzato innanzitutto inducendo la riproduzione in Xenopus mediante iniezione di gonadotropina corionica umana e atropina sia nei maschi che nelle femmine, e raccogliendo le uova fecondate. Il secondo passaggio consiste nella rimozione dello strato gelatinoso, del vitello e delle membrane da embrioni allo stadio 22.Successivamente, i neuroni spinali e i muscoli vengono isolati dagli embrioni e la pelle viene rimossa e scartata. L'ultimo passaggio consiste nell'allestire le cellule isolate in piastre di coltura e permettere la formazione di giunzioni neuromuscolari funzionali. In definitiva, connessioni sinaptiche funzionali possono essere dimostrate mediante registrazioni simultanee con tecnica del patch clamp accoppiato su neuroni e cellule muscolari in coltura.Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce un preparato sinaptico vertebrale facilmente accessibile. Può essere utilizzato per monitorare il rilascio di neurotrasmettitori mediante registrazioni elettrofisiologiche postsinaptiche, misurando contemporaneamente la presenza di ioni presinaptici. Inoltre, i metodi sono chiari e semplici, e non richiedono attrezzature speciali oltre a un microscopio stereoscopico, e le colture possono quindi essere conservate a temperatura ambiente in un mezzo di coltura semplice.Questa preparazione può essere utile per rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia sinaptica, come ad esempio il modo in cui gli eventi pre-sinaptici, biochimici e biofisici sono accoppiati al rilascio del neurotrasmettitore. Inoltre, è anche utile per lo studio della neuromodulazione, della sinaptogenesi e della plasticità sinaptica. Per iniziare questa procedura, preparare le soluzioni necessarie seguendo il manoscritto allegato. Successivamente, fabbricare almeno due strumenti di microdissezione incollando un ago minuchin all'estremità di una pipetta di vetro per pasteur.Con la colla acrilica Sano, fare in modo che l'estremità appuntita del perno sporga di circa 0,5 centimetri oltre l'estremità della pipetta. Due giorni prima di preparare le colture, identificare una coppia di XUS pronta per la riproduzione osservando un evidente artiglio rossastro aika nella femmina e una pigmentazione scura sulla superficie piana delle zampe anteriori del maschio. Successivamente, catturare ogni rana con una rete e tenerla con il lato ventrale verso il basso in un lavandino, usando la rete, in modo che possa scappare.Iniettare un millilitro di HCG attraverso la rete e per via sottocutanea in una delle sacche linfatiche dorsali per assicurarsi che gli animali non calpestino le uova appena deposte e fecondate. Installare un fondo con schermo con una maglia da mezzo pollice posizionato da uno a due pollici dal fondo della vasca. Quindi posizionare la coppia riproduttiva insieme in una vasca da 10 galloni coperta contenente acqua.Lasciare le rane indisturbate per 12-48 ore, fino a quando si osservano uova fecondate sul fondo al di sotto della griglia. Successivamente, rimuovere gli animali dalla vasca, ma lasciare le uova indisturbate per almeno altre 24 ore. Questa coppia di rane può essere accoppiata nuovamente dopo sei settimane.Successivamente, staccare delicatamente gli embrioni dal fondo del recipiente e trasferirli in quattro o cinque piastre di coltura da 60 per 15 millimetri contenenti soluzione salina al 10%. Ordinare gli embrioni in base allo stadio, seguendo lo schema di Newcombe e Faber: gli embrioni ideali sono quelli dall'aspetto liscio, con modellatura chiara, bruna e bianca, come quelli mostrati a sinistra. Al contrario, gli embrioni che presentano ampie chiazze nere o bianche, come quelli a destra, sono generalmente non sani e non utilizzabili.All'interno di una cappa a flusso laminare, etichettare e riempire fino a metà circa 360 piastre sterili da 15 millimetri con soluzione salina al 10% e una con CMF. Utilizzando una pipetta di vetro sterile, trasferire da cinque a dieci embrioni allo stadio 22-24 in una delle piastre contenente soluzione salina al 10%, quindi, sotto un microscopio stereoscopico a zoom all'interno della cappa, rimuovere la membrana gelatinosa e la membrana vitellina da ciascun embrione usando due paia di pinzette sterili. Lavare gli embrioni nudi passandoli, uno alla volta, attraverso le restanti due piastre contenenti soluzione salina al 10%, e infine trasferirli nella piastra contenente CMF.Successivamente, tenere ogni embrione delicatamente ma con fermezza con un paio di pinzette ed utilizzare lo strumento per micro-dissezione per rimuovere il tubo neurale e i miotomi associati, situati nella parte più dorsale dell'animale. Eseguire questa operazione effettuando tre tagli: uno a ciascuna estremità della sede del tubo neurale e un terzo appena al di sotto di esso. Quindi, spostare ogni miotomo con il tubo neurale dissezionato in una zona pulita della piastra, lontano dai granuli di tuorlo e da altri detriti.Dopo circa 15 minuti in CMF, utilizzare la pinzetta per sollevare il tessuto cutaneo pigmentato dal tessuto dissezionato e scartare la pelle. Dopo ulteriori 30-60 minuti, le cellule formeranno un ammasso simile a un mucchio di sabbia mentre si dissociano l'una dall'altra. In questo procedimento, scongelare un tubo da 10 millilitri di mezzo di coltura, quindi aggiungere 70 microlitri di ITS a 35 nanogrammi per millilitro, etichetta BDNF e riempire parzialmente (circa a metà) le capsule di coltura sterili da 35 millimetri con mezzo di coltura L 15.Utilizzare una piastra per ogni embrione dissecato. Per fabbricare una pipetta per il trapianto, afferrare entrambe le estremità di una pipetta di vetro di Pasteur e posizionare la parte conica sopra una fiamma. Successivamente, allungare le estremità fino a circa 10 centimetri.Successivamente, spezzare l'estremità in modo da ottenere una punta di circa 0,2 millimetri. In seguito, utilizzare la pipetta per piastre per aspirare l'accumulo di sabbia da un singolo embrione. Prestare attenzione a minimizzare la quantità di soluzione aspirata.Successivamente, espellere le cellule sul fondo di una piastra per colture e seminarle in diverse linee. Lasciare quindi le piastre con le cellule seminate indisturbate per almeno 15 minuti, in modo da permettere alle cellule di aderire alla piastra. Dopo 12-24 ore di coltura, le cellule seminate svilupperanno caratteristiche morfologiche distinte.Ad esempio, le cellule muscolari assumono una forma fusiforme e i neuroni spinali sviluppano prolungamenti lunghi. Il contatto sinaptico funzionale tra urato, varicosità e cellule muscolari può essere confermato mediante registrazioni elettrofisiologiche accoppiate simultanee. A tale scopo, preparare due elettrodi per la registrazione, uno per la varicosità presinaptica e uno per la cellula muscolare.Quindi riempire l'elettrodo presinaptico con la soluzione contenente info terin e l'elettrodo postsinaptico con la soluzione interna a base di potassio. Successivamente, sostituire il mezzo nella piastra di coltura con NFR. Trasferire quindi il campione su un microscopio invertito dotato di ottica a contrasto di fase, effettuare il patch dell'ingrossamento presinaptico con l'elettrodo contenente anfotericina e della cellula muscolare postsinaptica con l'altro elettrodo per confermare la funzionalità della sinapsi, depolarizzare l'ingrossamento mediante un amplificatore per patch clamp e osservare le correnti presinaptiche e postsinaptiche simultanee.Questa figura mostra una vista a ingrandimento cinque volte di cellule e colture subito dopo la semina, e questa è la stessa coltura a 40 x. Qui è visibile la giunzione neuromuscolare in coltura, che mostra il corpo cellulare neuronale, la terminazione presinaptica, la varicosità e la cellula muscolare postsinaptica. Qui mostrati sono i correnti presinaptici e postsinaptici.In risposta all'applicazione di incrementi di tensione di 10 millivolt applicati alla varicosità presinaptica da -30 millivolt a +40 millivolt, il potenziale di mantenimento per entrambe le cellule era di -70 millivolt. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa due ore. Colture cellulari vitali possono quindi essere ottenute già in 24 ore e possono essere mantenute per diversi giorni. Questa preparazione è già in uso da alcuni anni e ha contribuito a chiarire alcune delle proprietà fondamentali della trasmissione neuromuscolare.È nostra speranza che questo video permetta la prosecuzione della scoperta, aiutando i ricercatori a familiarizzare maggiormente con questa tecnica potente e semplice.

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