Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da Xenopus Nervo-muscolo Co-colture

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere colture primarie di neuroni spinali e cellule muscolari accoppiati sinapticamente da embrioni di xenopus. Ciò si ottiene inducendo prima la riproduzione in xenopus mediante iniezione di corio umano in atropina in rane sia maschi che femmine e raccogliendo uova fecondate. Il secondo passo consiste nel rimuovere il rivestimento gelatinoso e il fatel e le membrane dagli embrioni allo stadio 22.

Successivamente, i neuroni spinali e i muscoli vengono isolati dagli embrioni e la pelle viene rimossa e scartata. Il passaggio finale consiste nel placcare le cellule isolate in piastre di coltura e consentire la formazione di giunzioni neuromuscolari funzionali. In definitiva, le connessioni sinaptiche funzionali possono essere dimostrate con registrazioni simultanee di patch clamp accoppiate da neuroni e cellule muscolari in coltura.

La bellezza di questa tecnica è che produce una preparazione sinaptica di vertebrati facilmente accessibile. Può essere utilizzato per monitorare il rilascio di neurotrasmettitori con registrazioni elettrofisiologiche postsinaptiche, misurando contemporaneamente la presenza di ioni presinaptici. Inoltre, i metodi sono chiari e semplici e non richiedono attrezzature speciali oltre a un microscopio da dissezione, e le colture possono quindi essere conservate a temperatura ambiente in un semplice terreno di coltura.

Questa preparazione può essere utile per rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia sinaptica, incluso il modo in cui gli eventi presinaptici, biochimici e biofisici sono accoppiati con il rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, è utile anche per lo studio della sinaptogenesi e della plasticità sinaptica della neuromodulazione: Per iniziare questa procedura, preparare le soluzioni richieste secondo il manoscritto di accompagnamento. Quindi fabbricare almeno due strumenti di micro dissezione incollando uno spillo da minuchin all'estremità di una pipetta di pasta di vetro.

Con la colla acrilica Sano, lasciare che l'estremità affilata del perno si estenda oltre l'estremità della pipetta di circa 0,5 centimetri. Due giorni prima di preparare le colture, identificare una coppia di XUS pronta per la riproduzione osservando un prominente aika artiglio rossastro sulla femmina e una pigmentazione scura sulla superficie planare delle zampe anteriori del maschio. Quindi rete ogni rana e tienila con il lato ventrale rivolto verso il basso in un lavandino con la rete in modo che possa scappare.

Iniettare un millilitro di HCG attraverso la rete e per via sottocutanea in una delle sacche linfatiche dorsali per assicurarsi che gli animali non calpestino le uova appena deposte e fecondate. Installare un pavimento schermato con una dimensione della maglia di mezzo pollice montato da uno a due pollici sul fondo del serbatoio. Quindi metti insieme la coppia riproduttiva in un serbatoio coperto da 10 galloni d'acqua.

Lasciare le rane indisturbate per 12-48 ore fino a quando non si osservano le uova fecondate sul pavimento sotto lo schermo. Quindi rimuovere gli animali dalla vasca, ma lasciare le uova indisturbate per almeno 24 ore in più. Questa coppia di rane può essere riprodotta dopo sei settimane.

Quindi, allentare gli embrioni dal fondo della vasca e trasferirli in quattro o cinque piastre di coltura da 60 x 15 millimetri contenenti il 10% di soluzione fisiologica. Ordina gli embrioni per stadio secondo lo schema della nuova coupé e gli embrioni Faber che hanno un aspetto liscio con una modellazione chiara, marrone e bianca come quelli a sinistra sono l'ideale. D'altra parte, gli embrioni che hanno grandi macchie nere o bianche come quelle a destra sono generalmente malsani e inutilizzabili.

All'interno di una cappa a flusso laminare etichettare e riempire a circa metà piastre di coltura sterili da 360 x 15 millimetri con soluzione fisiologica al 10% e una con CMF. Utilizzando una pipetta sterile per pastier di vetro, trasferire da cinque a 10, stadio da 22 a 24 embrioni in una delle piastre contenenti il 10% di soluzione salina con l'otto di un microscopio da dissezione zoom stereo all'interno del cappuccio, rimuovere il rivestimento gelatinoso e la membrana del viello da ciascun embrione utilizzando due paia di pinze sterili. Lavare gli embrioni nudi passandoli uno alla volta attraverso le restanti due piastre di soluzione salina al 10% e infine nella capsula contenente CMF.

Quindi, tieni ogni embrione delicatamente ma saldamente con un paio di pinze e usa lo strumento di micro dissezione per rimuovere il tubo neurale e i miotomi associati, che si trovano nella parte più dorsale dell'animale. Fallo facendo tre fette, una alle due estremità della posizione del tubo neurale e una terza appena ventrale ad esso. Quindi spostare ogni miotomo del tubo neurale sezionato in una parte pulita del piatto, lontano dai granuli di tuorlo e da altri detriti.

Dopo circa 15 minuti in CMF, utilizzare la pinza per sollevare la pelle pigmentata dal tessuto sezionato e scartare la pelle. Dopo altri 30-60 minuti, le cellule formeranno un mucchio di sabbia man mano che si dissociano l'una dall'altra. In questa procedura, scongelare una provetta da 10 millilitri di terreno di coltura, quindi a 70 microlitri di ITS in 35 nanogrammi per millilitro, etichettare BDNF e riempire le piastre di coltura sterili da 35 millimetri circa a metà con terreno di coltura L 15.

Usa una piastra di coltura per ogni embrione che hai sezionato. Per fabbricare una pipetta per la piastratura, tenere entrambe le estremità di una pipetta per pastiere di vetro e posizionare la parte affusolata su una fiamma. Quindi separare le estremità a circa 10 centimetri.

Successivamente rompere l'estremità per cedere alla punta di circa 0,2 millimetri. Successivamente, usa la pipetta di placcatura per aspirare il mucchio di sabbia da un embrione. Fare attenzione a ridurre al minimo la quantità di soluzione prelevata.

Quindi, espellere le cellule sul fondo di una piastra di coltura e piastrelarle in diverse linee. Quindi lasciare indisturbate le piastre delle celle piastrate per almeno 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi alla capsula. Dopo 12-24 ore in coltura, le cellule piastrate svilupperanno caratteristiche morfologiche distinte.

Ad esempio, le cellule muscolari diventano a forma di fuso e i neuroni spinali sviluppano processi lunghi. Il contatto sinaptico funzionale tra urato, varici e cellule muscolari può essere confermato con registrazioni elettrofisiologiche accoppiate simultanee. Per fare ciò, preparare due elettrodi patch per la registrazione, uno per la varicosità presinaptica e uno per la cellula muscolare.

Quindi riempire l'elettrodo presinaptico con una soluzione contenente infoterina e l'elettrodo postsinaptico con una soluzione interna di potassio. Dopodiché, sostituisci il terreno nel piatto di coltura con NFR. Quindi trasferirlo in un microscopio invertito dotato di ottica a contrasto facciale, applicare un patch alla varicosità presinaptica con l'elettrodo contenente amfotericina e alla cellula muscolare post-sinaptica con l'altro elettrodo per confermare la funzionalità della sinapsi, depolarizzare la varici con un amplificatore patch clamp e osservare le correnti presinaptiche e postsinaptiche simultanee.

Questa figura mostra una vista di potenza cinque volte delle cellule e della coltura subito dopo la piastra, e questa è la stessa coltura a 40 volte. Ecco la giunzione neuromuscolare in coltura, che mostra il soma neuronale, la cellula muscolare presinaptica, varicosa e postsinaptica. Qui sono mostrate le correnti presinaptiche e postsinaptiche.

In risposta all'applicazione di gradini di tensione incrementale di 10 millivolt presentati alla varicosità presinaptica da meno 30 millivolt a più 40 millivolt, il potenziale di tenuta per entrambe le celle era di meno 70 millivolt. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa due ore. Le colture cellulari vitali possono quindi essere ottenute in appena 24 ore e possono essere mantenute per diversi giorni. Questo preparato è già in uso da diversi anni, contribuendo a spiegare alcune delle proprietà fondamentali della trasmissione neuromuscolare.

La nostra speranza è che questo video consenta la continuazione della scoperta aiutando gli investigatori a familiarizzare con questa tecnica potente e semplice.