Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e analizzare l'effetto delle interazioni tra cellule e matrice sull'allineamento delle fibre e sul rimodellamento della matrice in un sistema di gel di fibrina. Questo viene ottenuto innanzitutto polimerizzando un gel di fibrina tridimensionale contenente microsfere su un vetrino coprioggetto contenuto all'interno di un bioricettore a condizioni ambientali controllate. Il secondo passaggio consiste nel preparare una sospensione cellulare altamente concentrata, utilizzata per posizionare gruppi di fibroblasti o espianti X in schemi geometrici sulla superficie del gel.

Successivamente, il campione viene acquisito ogni 15 minuti mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale nell'arco di 48 ore. L'ultimo passaggio consiste nel misurare il grado di riorganizzazione e rimodellamento del fibrina sotto forma di deformazione (strain) in diverse regioni del gel utilizzando la correlazione digitale delle immagini. In definitiva, questo sistema di espianto consente di disporre le cellule in semplici schemi geometrici, facilitando la visualizzazione e l'analisi dei meccanismi alla base del rimodellamento matriciale e del riallineamento delle fibre indotti dalle cellule.

Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia meccanica, ad esempio quali sono gli effetti di stimoli meccanici altamente specifici dal punto di vista spaziale e temporale sul comportamento cellulare e sui cambiamenti conseguenti che questi inducono nella matrice tissutale circostante. In questa procedura verrà illustrato Arabic de Jesus, uno studente laureando del mio laboratorio, che scioglie delicatamente il fibrinogeno in soluzione salina preriscaldata a 37 gradi Celsius durante la notte per ottenere una soluzione madre da 33,3 milligrammi per millilitro. Preparare una maschera su perfil per definire la posizione di ciascun espianto x in base alla geometria e alla distanza desiderate.

Ogni punto distante circa uno o due millimetri dall'altro. Questa distanza corrisponde a un'ideale spaziatura per generare allineamento delle fibre tra gli espianti. Successivamente, pulire accuratamente tutti i componenti del bioricettacolo utilizzando etanolo al 70% e posizionare i componenti puliti sotto la luce UV di una cappa da coltura tissutale per due o tre ore prima della menzione.

Dopo aver sterilizzato i componenti del bioreattore, applicare lo stencil al di sotto della zona del vetrino da 60 millimetri di diametro dove verrà preparato il campione, utilizzando del nastro adesivo. Successivamente, preparare la sospensione di microsfere, seguita da fibrinogeno e trombina. Le soluzioni stock vengono ottenute mescolando 0,017 millilitri di soluzione stock di microsfere e 0,149 millilitri di DMEM in un tubo da microcentrifuga, ottenendo una concentrazione di 10 milioni di microsfere per millilitro.

Quindi sottoporre la sospensione a sonicazione per 10 minuti per disperdere le perline e omogeneizzare la soluzione. Aggiungere 0,22 millilitri della soluzione madre di fibrinogeno a 0,44 millilitri di tampone HEPES 20 millimolare e 0,1667 millilitri della soluzione di microperline in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Mescolare delicatamente i componenti, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio all'interno di un altro tubo da centrifuga da 15 millilitri.

Miscelare insieme: 32,8 µL di trombina disciolta in soluzione salina a 25 unità per millilitro, 131 µL di buffer HEPES 20 millimolari e 2,46 µL di cloruro di calcio 2 molar.

Successivamente, mescolare con attenzione le soluzioni di trombina e fibrinogeno preparate, aspirando e dispensando da cinque a dieci volte fino a quando la soluzione non risulta uniformemente distribuita. Cercare di minimizzare l'introduzione di bolle nella miscela evitando di svuotare completamente la pipetta durante il mescolamento. Trasferire al più presto la soluzione mescolata in stampi quadrati in PDMS di otto millimetri su vetrini, lasciando poi polimerizzare il gel a temperatura ambiente.

L'aggiunta di trombina farà gelificare rapidamente la soluzione in circa 30 secondi dopo la polimerizzazione; sigillare il bioreattore e preparare gli espianti cellulari per iniziare la raccolta di cellule di fibroblasti dermici umani al 70-90% di confluenza da una fiala T75 utilizzando tripsina, quindi centrifugare a 200 × g per cinque minuti. Trasferire il bioreattore in una cappa a sicurezza biologica e rimuovere con attenzione il coperchio rispettando le condizioni asettiche. Successivamente, aspirare il mezzo e risospendere il pellet cellulare a una concentrazione finale di 20 milioni di cellule per millilitro in DMEM con il 10% di FBS.

Successivamente, crea gli espianti caricando le cellule in una pipetta micrometrica e iniettando 0,3 microlitri della sospensione cellulare nel gel di fibrina polimerizzato. Seguendo il modello indicato sulla maschera, ogni espianto deve contenere circa 6.000 cellule. Una volta posizionati gli espianti sul gel, sigilla il bioreattore.

Successivamente, inserire i blocchi riscaldanti e collegare le termocoppie al controllore di temperatura. Impostare il controllore di temperatura a 37 gradi Celsius ed incubare i gel per un'ora per consentire alle cellule di depositarsi e aderire alla matrice di fibrina. Quindi aggiungere direttamente nella camera del biorreattore circa cinque millilitri di DMEM che è stato condizionato per due-tre ore con il 5% di anidride carbonica e integrato con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina-streptomicina, lo 0,1% di anfotericina B e 10 microgrammi per millilitro di aprotinina.

Quindi sigillare nuovamente il biorreattore. Utilizzare una siringa per aggiungere i cinque millilitri aggiuntivi di mezzo condizionato con anidride carbonica attraverso il raccordo a barbetta presente sul porto di ingresso, riempiendo completamente il biorreattore; rimuovere con attenzione eventuali bolle d'aria formatesi. Preparare una pompa per siringa con una siringa da 10 millilitri o da 30 millilitri riempita con ulteriore mezzo condizionato al 5% di anidride carbonica. Collegare la siringa direttamente al porto di ingresso del coperchio del biorreattore mediante un tubo sterile dotato di connettore Luer lock.

Impostare la velocità di perfusione sulla pompa a siringa a 0,01 millilitri al minuto. Quindi collegare dei pezzi di tubo modificati a entrambe le uscite e posizionare le estremità in un becher da 100 millilitri. Per raccogliere gli scarti, utilizzare un supporto regolibile per impostare le altezze dei collegamenti di ingresso e uscita in modo che non si crei un gradiente di pressione nell’alimentazione del bioricettore.

Aggiungere continuamente nel biorreattore mezzo condizionato al 5% di anidride carbonica durante l'intero esperimento. Per mantenere il pH, fornire i nutrienti ed eliminare i prodotti di scarto, si utilizzerà una siringa da 10 millilitri piena di mezzo, che durerà circa 16 ore. Posizionare l'obiettivo 20 XDIC sotto il portavista del microscopio e verificare che polarizzatore, analizzatore e prisma siano tutti al loro posto.

Quindi aprire il software di acquisizione immagini. Mettere a fuoco l'obiettivo sulla zona compresa tra i tre x explan e salvare le coordinate X, Y e Z di questa posizione all'interno del software di acquisizione. Per acquisire immagini dell'intera area compresa e circostante il x explan, selezionare l'opzione per acquisire un'immagine di grandi dimensioni e specificare la dimensione dell'area.

Questo permetterà l'acquisizione di più immagini intorno all'area specificata e la creazione di un'immagine ampia composta da tasselli; impostare l'intensità della luce e il tempo di esposizione ai valori più bassi possibili. Ciò aiuterà a evitare la morte cellulare causata dalla fototossicità, pur fornendo una risoluzione sufficiente per distinguere tra cellule, microsfere e fibre di fibrina. Si noti che in questo particolare esperimento, le fibre di fibrina non sono visibili a causa dell'elevata densità di microsfere che causano scattering della luce nel gel; ridurre la densità delle microsfere o lo spessore del gel per poter osservare le fibre di fibrina.

Successivamente, iniziare il tracciamento della deformazione. Creando o scaricando innanzitutto un codice MATLAB personalizzato, quindi registrare le immagini utilizzando microsfere nel gel come punti di riferimento. La registrazione delle immagini garantirà che le immagini ottenute siano acquisite esattamente nella stessa posizione ogni volta.

Il riallineamento delle fibre è stato osservato tra gli esplantati acquisendo immagini affiancate ogni 15 minuti. Nel corso di un periodo di 48 ore, singole regioni sono state estratte dalle immagini affiancate e analizzate mediante l'algoritmo di tracciamento della deformazione. Per misurare le deformazioni locali a partire dallo spostamento dei microbeads, le mappe di contorno mostrano la distribuzione della deformazione principale massima nell'area di riallineamento delle fibre corrispondente alla cinghia.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre o quattro ore se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'etichettatura fluorescente del collagene e delle proteine citoscheletriche, nonché la quantificazione della migrazione cellulare, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali vie meccanobiologiche siano coinvolte nel rimodellamento dei tessuti e come questi processi siano modulati da vari composti biochimici.