Name: Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Scopri la microscopia time-lapse per osservare la compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti in un bioreattore controllato. Questo metodo permette di analizzare il riallineamento delle fibre e il rimodellamento della matrice cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo George Giudice e Steven Eliason per aver donato fibroblasti dermici umani e Ramesh Raghupathy per l'aiuto con l'algoritmo di tracciamento del ceppo. Il sostegno a questo lavoro è stato fornito da un Dipartimento dell'Assistenza ai laureati del Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti nelle aree della National Need Fellowship (GAANN P200A120071).

1. Preparazione stencil
Preparare uno stencil su Parafilm per disartillare la posizione di ogni espianto, seguendo lageometria desiderata (figure 1A e 1B). Distanziare ciascuno di circa 1-2 mm di distanza. Questa distanza corrisponde a una spaziatura ideale per generare l'allineamento delle fibre tra le espianto. Attaccare lo stencil sotto l'area del vetro di copertura in cui il campione verrà preparato con nastro adesivo.
2. Sterilizzazione
Pulire accuratamente tutti i componenti del bioreattore utilizzando il 70% di etanolo e sterilizzare per 2-3 ore sotto la luce UV prima della sperimentazione. Se si utilizza un recipiente alternativo al posto di un bioreattore, si dovrebbero utilizzare adeguate tecniche di sterilizzazione. Vedere il passaggio 4.12 per i commenti sull'uso di una piastra di Petri con fondo di vetro.
3. Preparazione gel fibrina
Dopo che i componenti del bioreattore sono stati sterilizzati, gettare un sottile strato di gel di fibrina sulla superficie del vetro di copertura. I dettagli per la preparazione di soluzioni di fibrinogeno e thrombin stock per la produzione di gel di fibrina da 6,6 mg/ml sono descritti in Sander et al. 13 Un protocollo analogo di Ye et al. 19 per la produzione di gel di fibrina da 3,3 mg / ml possono anche essere visualizzati sul sito Web JoVE.
<ol><li>Preparare una soluzione di microperline fluorescenti in DMEM ad una concentrazione di 10 milioni di perline/ml. Le perline verranno utilizzate per aiutare a tenere traccia degli spostamenti del gel. Per raggiungere questa concentrazione, unire 0,017 ml di soluzione di calcio di microperline e 0,149 ml di DMEM in un tubo di microcentrifugo.</li>
	<li>Sonicare questa sospensione per 10 minuti per disperdere le perline e omogeneizzare la soluzione.</li>
	<li>Soluzione di fibrina — In un tubo c da 15 ml, mescolare 0,22 ml di soluzione di soluzione di fibrinogeno con 0,44 ml di tampone HEPES da 20 mM. Aggiungere lo 0,1667 ml di DMEM con microperline create nel passaggio 3.1.</li>
	<li>Soluzione di trombina — In un tubo c separato da 15 ml, mescolare 0,0328 ml di soluzione di stock di trombina, 0,131 ml di tampone HEPES da 20 mM e 0,00246 ml di 2 M CaCl2.</li>
	<li>Mescolare con cura la soluzione di trombina (fase 3.4) con la soluzione di fibrinogeno (fase 3.3) tubazione su e giù 5-10x fino a quando la soluzione non viene distribuita uniformemente. Evitare di introdurre bolle il più possibile. Per ridurre la quantità di bolle prodotte, fare attenzione a non scaricare completamente la pipetta durante la miscelazione.</li>
	<li>L'aggiunta di trombina farà gelare rapidamente la soluzione (~ 30 sec). Pipettare la soluzione mista sul vetro di copertura il prima possibile. Lasciare che il gel polimerizzi a RT.</li>
	<li>Sigillare il bioreattore, inserire i blocchi riscaldanti e collegare le termocopia al regolatore di temperatura. Incubare il gel a 37 °C per 15-30 min.</li>
</ol>4. Preparazione dell'espianto cellulare
<ol><li>Rimuovere il mezzo dal pallone T-75 contenente le cellule fibroblatrici dermiche umane.</li>
	<li>Risciacquare con cura la superficie con circa 5 ml di soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) per rimuovere le proteine del siero. Aggiungere 1 ml di tripside-EDTA e incubare per 3 minuti o fino a quando le cellule non si sono alzate.</li>
	<li>Dopo che le cellule sono state sollevate, ruotare la sospensione verso il basso in una centrifuga a 200 x g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e resospendare il pellet in un volume di DMEM che consentirà una concentrazione finale di 20 milioni di cellule/ml.</li>
	<li>Mentre le cellule girano verso il basso nella centrifuga scollegare il bioreattore dai blocchi riscaldanti e dalle termocopia. Trasferire il bioreattore in un armadio di biosicurezza e rimuovere con cura il coperchio seguendo tecniche ascettiche.</li>
	<li>Creare esplant pipettando 0,3 μl della sospensione cellulare sul gel di fibrina polimerizzato, seguendo il modello sullo stencil. Ogni espianto deve contenere circa 6.000 cellule. Assicurarsi che le punte di micropipette a basso volume siano utilizzate (0,1-10 μl).</li>
	<li>Lasciare che le cellule si sistemino e si colleghino alla matrice di fibrina per 1 ora a 37 °C.</li>
	<li>Con il bioreattore ancora aperto, aggiungere circa 5 ml di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% (FBS), 1% penicillina-streptomicina, 0,1% ampotericina B e 10 mg/ml di aprotinina direttamente nella camera del bioreattore. DMEM è tamponato al bicarbonato e richiede il 5% di CO2 per mantenere un pH neutro. Poiché il bioreattore non viene fornito con CO 2 ,condizionareil mezzo in un incubatore con 5% di CO2 per 2-3 ore prima dell'uso. L'aprotinina è un inibitore della proteasi della serina ampiamente utilizzato per ridurre il tasso di degradazione della fibrina20.</li>
	<li>Resealare il bioreattore. Utilizzare una siringa per fornire ulteriori 5 ml di mezzo condizionato di CO2 tramite il raccordo spinato sulla porta di ingresso. Distribuire lentamente il mezzo e assicurarsi che l'intero volume della camera del bioreattore sia riempito. Rimuovere con cura le bolle che si formano nel bioreattore.</li>
	<li>Fornire un mezzo fresco, 5% condizionato di CO2 al bioreattore durante l'esperimento al fine di mantenere il pH, fornire nutrienti e rimuovere i prodotti di scarto. Impostare una pompa per siringhe con una siringa da 10 ml o 30 ml riempita con mezzo condizionato al 5% di CO2. Collegare la siringa direttamente alla porta di ingresso sul coperchio del bioreattore con tubi sterili montati su Luer-lock. Rimuovere il raccordo maschile e attaccare il tubo al raccordo spinato sul bioreattore (vedere figura 1C).</li>
	<li>Impostare la velocità di perfusione su 0,01 ml/min. Collegare pezzi di tubi modificati a entrambe le porte di uscita e posizionare le estremità in un becher da 100 ml per raccogliere i rifiuti.</li>
	<li>Utilizzare un jack da laboratorio per impostare le altezze degli alimenti di ingresso e uscita in modo che un differenziale di pressione non si sviluppi nel bioreattore (consultare la figura 1D come riferimento).</li>
	<li>Se non è disponibile un bioreattore, preparare i campioni in 35 mm di vetro inferiore piastre petri con piani in vetro. Usane uno con una dimensione di copriscivolo ottimizzata per l'insieme specifico di obiettivi da utilizzare. I campioni preparati nelle piastre di Petri devono essere mantenuti in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Nota: il polistirolo depolarizza la luce e interferisce con l'imaging DIC, quindi i piani in vetro devono essere utilizzati se verrà condotta l'imaging DIC. Il contrasto di fase è un'adeguata modalità di imaging alternativa. Il trasferimento di piatti tra l'incubatore e il microscopio renderà difficile la registrazione delle immagini. Se le immagini non sono registrate correttamente, il ceppo calcolato nella sezione 6 non sarà accurato.</li>
</ol>5. Imaging time-lapse
<ol><li>Una volta preparato il campione, ricollegare il bioreattore, ricollegare i blocchi riscaldanti e le termocopia e impostare la temperatura del bioreattore a 37 °C.</li>
	<li>Impostare il bioreattore sullo stadio motorizzato montato al microscopio. Posizionare l'obiettivo 20X DIC sotto la porta di visualizzazione. Un obiettivo di ingrandimento inferiore è accettabile, in particolare se non è disponibile uno stadio motorizzato di precisione. Assicurarsi che polarizzatore, analizzatore e prisma siano tutti a posto. In alternativa, i campioni possono anche essere immagini utilizzando il contrasto di fase.</li>
	<li>Aprire il software di imaging.</li>
	<li>Focalizzare l'obiettivo sull'area tra i tre espianto.</li>
	<li>Salvare le coordinate (x, y e z) di questa posizione nel software di imaging.</li>
	<li>Per immaginiare l'intera area tra e intorno agli espianto, selezionare l'opzione per acquisire un'immagine di grandi dimensioni e specificare le dimensioni dell'area. Ciò consentirà l'acquisizione di più immagini intorno all'area specificata e creerà un'immagine piastrellata che rappresenta un'area più ampia dell'esempio.</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione e l'intensità della luce sui valori più bassi possibili per evitare la morte cellulare causata dalla fototossicità, pur fornendo una risoluzione sufficiente per discriminare tra cellule, microperline e fibre di fibrina.</li>
</ol>6. Tracciamento dello sforzo
Per i dettagli e le istruzioni sul software di tracciamento delladeformazione (Figura 2)utilizzato, vedere Raghupathy et al. 21 L'algoritmo è un codice MATLAB personalizzato che può essere scaricato <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">da http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>. Si noti che le immagini DIC hanno spesso una trama sufficiente per il tracciamento dello sforzo. Le microperline sono incluse per fungere da controllo sui campi di deformazione calcolati. Se verrà eseguito il tracciamento della deformazione, è fondamentale che le immagini ottenute siano scattate esattamente nella stessa posizione in modo che le immagini siano registrate. Le immagini non registrate produrranno ceppi spuri.

<ol><li>Grinnell, F., Petroll WM, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSander%2C+EA+%22Biomimetic+collagen+tissues%3A+collagenous+tissue+engineering+and+other+applications.+In%3A+Collagen%3A+Structure+and+Mechanics%22">Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics</a>. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Pedersen JA,, Swartz MA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li>
<li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li>
<li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li>
<li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li>
<li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels%3A+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li>
<li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li>
<li>Stopak, D., Harris AK, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction%3A+I.+tissue+culture+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li>
<li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li>
<li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).</li>
<li>Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valves+with+commissural+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valves with commissural alignment.</a> Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).</li>
<li>Robinson PS,, Robinson PS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+biaxial+behavior+of+fibrin-based+tissue-engineered+heart+valve+leaflets%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li>
<li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li>
<li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+an+optically+accessible%2C+low-volume%2C+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).</li>
<li>Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+cardiomyocytes+in+a+fibrin+hydrogel+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).</li>
<li>Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regional+mechanical+anisotropy+in+soft+tissue+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs.</a> J. Biomech. Eng. 133, (2011).</li>
<li>Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue-engineered+valves+from+cell-remodeled+fibrin+with+commissural+alignment+of+cell-produced+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li>
<li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li>
<li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+collagen+matrices%3A+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li>
<li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).</li>
<li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo protocollo è stato sviluppato allo scopo di osservare e quantificare la meccanica coinvolta nel rimodellamento ECM mediato dalle cellule. Tali processi sono alla base di una serie di fenomeni biologici e hanno importanti implicazioni per i tessuti ingegneristici2,22, riducendola cicatrice 1,23e comprendendo il rimodellamento patologico deitessuti 12,24. L'uso della microscopia DIC time-lapse consente di risolvere e quantificare lo spostamento e l'allineamento delle fibre di fibrina...

Uno strumento importante per studiare le interazioni cellula-matrice è il gel di collagene popolato dallecellule 1,2. Il gel fornisce un ambiente 3D più vicino al carattere in vivo del tessuto e più adatto per comprendere il comportamento cellulare di quanto offerto dalle colture 2D tradizionali3. I primi studi in cui i fibroblasti sono stati distribuiti omogeneamente all'interno di un gel di collagene hanno scoperto che le cellule consolidano rapidamente le fibre di collagene e compattano il gel4,5. I fibroblasti contrattili in gel galleggianti liberi poi si trasformano in uno stato quiescente subito dopo che il gel ha raggiunto completamente lacompattazione 1,6,7. I fibroblasti nei gel vincolati ai confini rimangono in uno stato attivo e sintetico8 e generano l'allineamento delle fibre in modo dipendente dalla geometria del gel e dai vincoliesterni 5,9. Le differenze nell'attività cellulare sembrano essere il risultato della tensione interna (o della sua mancanza) che si sviluppa man mano che le cellule esercitano forze di trazione attraverso integrine sulle fibre di collagene nel gel.
Una variante di questa tecnica prevedeil posizionamento di espianto di fibroblasti (cioè ciuffi di cellule) a una distanza all'interno di un gel di collagene e l'osservazione delle interazioni cellula-matrice e il graduale sviluppo dell'allineamento delle fibre tra le espianto (a volte chiamate cinghie simili a legamenti)10-12. Il vantaggio principale del sistema di espianto è che consente di disporre le cellule in semplici motivi geometrici, il che rende più facile visualizzare e sondare i meccanismi alla base del riallineamento delle fibre guidato dalle cellule. Questi modelli di allineamento - che dipendono principalmente dall'interazione tra le forze di trazione cellulare, la distribuzione spaziale cellulare, la geometria del gel e i vincoli meccanici sul gel - sono importanti da capire perché svolgono un ruolo centrale nell'organizzazione globale dei tessuti, nella funzione meccanica e nell'ambiente meccanicolocale 13.
Nel campo dell'ingegneria tissutale, una strategia per la produzione di tessuti ingegnerizzati meccanicamente funzionali comporta il controllo del modello di allineamento delle fibre che si sviluppa dalla compattazione cellulare in modo che il tessuto ingegnerizzato possieda un allineamento delle fibre che imita quello del tessutonativo 14,15. Tale allineamento si ritiene necessario per i tessuti ingegnerizzati per replicare il complesso comportamento meccanico dei tessuti nativi. Una modifica di questa strategia è sostituire il gel di collagene con un gel di fibrina16. Il gel di fibrina sviluppa un modello di allineamento simile a un gel di collagene durante la compattazione. Nel corso del tempo la fibrina viene degradata e sostituita con ECM sintetizzato a cella che segue il modello iniziale di allineamento della fibra di fibrina. Il costrutto ingegnerizzato risultante ha migliorato significativamente le proprietà meccaniche rispetto ai costrutti derivati dal gel dicollagene 17.
Il processo di allineamento e i successivi eventi di rimodellamento nei gel di fibrina procedono in modo complicato e poco compreso. Per caratterizzare meglio queste interazioni e il loro effetto sul comportamento cellulare e sul rimodellamento di ECM, abbiamo sviluppato una procedura basata sul metodo di espianto. In questo metodo, le espianto di fibroblasti sono posizionate su un gel di fibrina in diversi motivi geometrici. I gel sono mantenuti in un bioreattore18controllato dall'ambiente e montato al microscopio e il processo di compattazione e riallineamento delle fibre viene monitorato con microscopia DIC (Differential Interference Contrast) time-lapse. I campi di spostamento vengono quantificati con algoritmi personalizzati. I dati ottenuti da questi esperimenti hanno implicazioni ad ampio raggio per una serie di processi, tra cui l'ottimizzazione delle strategie di ingegneria tissutale, il miglioramento della guarigione delle ferite e il trattamento del rimodellamento patologico dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreattore Biotense</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Ti-Eclipe</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 0 Piastra di Petri con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr> <tr><td># 0 Piastra di Petri superiore in vetro da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi Luer in plastica, tubi in PVC con estremità Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Le cellule incorporate nei gel di collagene e fibrina attaccano ed esercitano forze di trazione sulle fibre del gel. Queste forze possono portare alla riorganizzazione locale e globale e al riallineamento della microstruttura del gel. Questo processo procede in modo complesso che dipende in parte dall'interazione tra la posizione delle celle, la geometria del gel e i vincoli meccanici sul gel. Per comprendere meglio come queste variabili producono modelli globali di allineamento delle fibre, utilizziamo la microscopia DIC (Time-Lapse Differential Interference Contrast) abbinata a un bioreattore controllato dall'ambiente per osservare il processo di compattazione tra espianto geometricamente distanziato (ammassi di fibroblasti). Le immagini vengono quindi analizzate con un algoritmo di elaborazione delle immagini personalizzato per ottenere mappe del ceppo. Le informazioni ottenute da questa tecnica possono essere utilizzate per sondare la meccanobiologia di varie interazioni cellula-matrice, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei processi nella guarigione delle ferite, nello sviluppo di malattie e nelle applicazioni di ingegneria tissutale.

Il rimodellamento dei tessuti è un processo complesso che è guidato in parte da interazioni fisiche reciproche tra le cellule e la matrice circostante. Le cellule riorganizzano le fibre circostanti e generano tensione nella rete in fibra. L'allineamento delle fibre e dell'ambiente meccanico a sua volta controlla il comportamento delle cellule, in modo che sia le cellule che la matrice si riorganizzno globalmente per produrre tessuti rimodellati. In questo esperimento, le cellule delle espianto, inizialmente rotonde nella...

La microscopia time-lapse e le tecniche di elaborazione delle immagini sono state utilizzate per osservare e analizzare la compattazione del gel mediata da fibroblasti e il riallineamento della fibra di fibrina in un bioreattore controllato dall'ambiente per un periodo di 48 ore.

Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e analizzare l'effetto delle interazioni tra cellule e matrice sull'allineamento delle fibre e sul rimodellamento della matrice in un sistema di gel di fibrina. Questo viene ottenuto innanzitutto polimerizzando un gel di fibrina tridimensionale contenente microsfere su un vetrino coprioggetto contenuto all'interno di un bioricettore a condizioni ambientali controllate. Il secondo passaggio consiste nel preparare una sospensione cellulare altamente concentrata, utilizzata per posizionare gruppi di fibroblasti o espianti X in schemi geometrici sulla superficie del gel.Successivamente, il campione viene acquisito ogni 15 minuti mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale nell'arco di 48 ore. L'ultimo passaggio consiste nel misurare il grado di riorganizzazione e rimodellamento del fibrina sotto forma di deformazione (strain) in diverse regioni del gel utilizzando la correlazione digitale delle immagini. In definitiva, questo sistema di espianto consente di disporre le cellule in semplici schemi geometrici, facilitando la visualizzazione e l'analisi dei meccanismi alla base del rimodellamento matriciale e del riall

observing-and-quantifying-fibroblast-mediated-fibrin-gel-compaction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo video dimostra il protocollo di un test in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi di angiogenesi. Time-lapse immagini di germinazione, formazione lumen, ramificazione e anastomosi - caratteristiche fondamentali di angiogenesi - sono mostrati.

Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Questo video mostra la microscopia time-lapse quantitativa per valutare la disseminazione di Listeria monocytogenes dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare attraverso le cellule endoteliali. Un idrogel più morbido facilita una più rapida diffusione batterica attraverso le cellule endoteliali rispetto alle controparti più rigide, evidenziando l'influenza della rigidità della matrice sulla disseminazione batterica.

Microscopia quantitativa time-lapse per la valutazione della disseminazione batterica dipendente dalla rigidità della matrice extracellulare

Questo sistema modello parte da un gel di fibrina myofibroblast popolata che può essere usato per studiare collagene endogeno (ri) organizzazione in tempo reale in modo non distruttivo. Il sistema modello è molto sintonizzabile, in quanto può essere usato con sorgenti cellulari differenti, additivi medie, e può essere facilmente adattato alle esigenze specifiche.

Ingegneria fibrina a base di tessuto costrutti da miofibroblasti e applicazione di vincoli e la tensione per indurre Organizzazione cellulare e collagene (Re)

In questo manoscritto vengono presentate tecniche sperimentali, tra cui la preparazione del sangue, la microscopia confocale e l'analisi della velocità di lisi, per esaminare le differenze morfologiche tra strutture di coaguli normali e anormali dovute a stati patologici.

Tecniche sperimentali e di imaging per l&#39;esame Strutture coagulo di fibrina in normali e patologiche Uniti

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Il metodo presentato prevede lo stiramento uniassiale di idrogel morbidi 3D incorporati nella gomma siliconica, consentendo al contempo la microscopia confocale viva. Vengono dimostrate la caratterizzazione dei ceppi idrogel esterni e interni e l'allineamento delle fibre. Il dispositivo e il protocollo sviluppati possono valutare la risposta delle cellule a vari regimi di deformazione.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.

Idrogel fotoregistrabili in bioprinting 3D per studiare l'attivazione dei fibroblasti

La frazione vascolare stromale (SVF) isolata meccanicamente in combinazione con un idrogel di fibrina offre un vettore facile ed efficiente per cellule stromali vitali di derivazione adiposa per varie indicazioni, tra cui l'ingegneria tissutale e/o la guarigione delle ferite. Qui, presentiamo la preparazione di un costrutto meccanico di SVF (mSVF)-fibrina idrogel per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

La combinazione di frazione vascolare stromale isolata meccanicamente e idrogel di fibrina: un protocollo di elaborazione

Scopri la microscopia time-lapse per osservare la compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti in un bioreattore controllato. Questo metodo permette di analizzare il riallineamento delle fibre e il rimodellamento della matrice cellulare.

Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

Esplora altri video