Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e analizzare l'effetto delle interazioni della matrice cellulare sulle attività di riallineamento delle fibre e di rimodellamento della matrice in un sistema di gel di fibrina. Ciò si ottiene polimerizzando in primo luogo, un gel di fibrina tridimensionale contenente microsfere su un vetro di copertura contenuto all'interno di un bioreattore controllato dal punto di vista ambientale. Il secondo passo consiste nel preparare una sospensione cellulare altamente concentrata che viene utilizzata per posizionare gruppi di fibroblasti o espianti X in motivi geometrici sulla superficie del gel.

Successivamente, il campione viene ripreso ogni 15 minuti utilizzando la microscopia a contrasto interferenziale differenziale nel corso di 48 ore. Il passo finale consiste nel misurare l'entità della riorganizzazione e del rimodellamento della fibrina sotto forma di deformazione da diverse regioni del gel utilizzando la correlazione delle immagini digitali. In definitiva, questo sistema di espiantazione consente di organizzare le cellule in semplici schemi geometrici, il che rende più facile visualizzare e sondare i meccanismi alla base del rimodellamento della matrice cellulare e del riallineamento delle fibre.

Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia meccanica, come ad esempio quali sono gli effetti di segnali meccanici molto spaziali e temporali sul comportamento cellulare e i conseguenti cambiamenti che questi generano nella matrice tissutale circostante. Dimostrare in questa procedura sarà Arabic de Jesus, uno studente laureato del mio laboratorio Sciogliere delicatamente il fibrinogeno in soluzione salina precalda a 37 gradi Celsius durante la notte per creare una soluzione madre da 33,3 milligrammi per millilitro. Prepara uno stencil su perfil per tracciare la posizione di ogni espianto x seguendo lo spazio geometrico desiderato.

Ogni punto è distante circa uno o due millimetri l'uno dall'altro. Questa distanza corrisponde a una spaziatura ideale per generare l'allineamento delle fibre tra gli espianti. Successivamente, pulire accuratamente tutti i componenti del bioreattore utilizzando etanolo al 70% e posizionare i componenti puliti sotto l'UV di una cappa di coltura tissutale per due o tre ore prima della registrazione.

Dopo che i componenti del bioreattore sono stati sterilizzati, attaccare lo stencil sotto l'area del vetro di copertura di 60 millimetri di diametro dove il campione verrà preparato utilizzando del nastro adesivo. Quindi, preparare la sospensione di microsfere, seguita dal fibrinogeno e dalla trombina. Le soluzioni madre combinano 0,017 millilitri della soluzione madre di Microbead e 0,149 millilitri di DMEM in una provetta da microcentrifuga per ottenere una concentrazione di 10 milioni di perle per millilitro.

Quindi sonicare la sospensione per 10 minuti per disperdere le perle e omogeneizzare la soluzione. Aggiungere 0,22 millilitri della soluzione madre di fibrinogeno a 0,44 millilitri di tampone cumulari da 20 millimolari e 0,1667 millilitri della soluzione di microsfere in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Mescolare delicatamente i componenti e quindi posizionare la provetta con ghiaccio in una provetta da centrifuga separata da 15 millilitri.

Mescolati insieme. 32,8 microlitri di trombina disciolti in soluzione salina a 25 unità per millilitro, 131 microlitri di tampone da 20 millimolari e 2,46 microlitri di cloruro di calcio a due molari.

Successivamente, mescolare accuratamente le soluzioni di trombina e fibrinogeno preparate pipettando su e giù da cinque a 10 volte fino a quando la soluzione non è distribuita uniformemente. Cercare di ridurre al minimo l'introduzione di bolle nella miscela non scaricando completamente la pipetta durante la miscelazione. Pipettare la soluzione miscelata in stampi PDMS quadrati da otto millimetri sul vetro di copertura il prima possibile, lasciare polimerizzare il gel a temperatura ambiente.

L'aggiunta di trombina costerà alla soluzione di gelificare rapidamente in circa 30 secondi dopo la polimerizzazione, sigillare il bioreattore e preparare gli espianti cellulari per iniziare a raccogliere dal 70 al 90% di cellule di fibroblasti dermici umani confluenti da un pallone T 75 utilizzando la tripsina e farle girare a 200 volte G per cinque minuti. Trasferire il bioreattore in una cabina di biosicurezza e rimuovere con cautela il coperchio in condizioni asettiche. Quindi aspirare il terreno e risospendere il pellet di cella fino a una concentrazione finale di 20 milioni di cellule per millilitro in DMEM con il 10% di FBS.

Successivamente, creare espianti caricando le cellule in una micropipetta e iniettando 0,3 microlitri della sospensione cellulare nel gel di fibrina polimerizzato. Seguendo lo schema sullo stencil, ogni explan dovrebbe contenere circa 6.000 celle. Una volta posizionati gli espianti sul gel, sigillare il bioreattore.

Successivamente, inserire i blocchi riscaldanti e collegare le termocoppie al termoregolatore. Impostare il regolatore di temperatura a 37 gradi Celsius e incubare i gel per un'ora per consentire alle cellule di depositarsi e attaccarsi alla matrice di fibrina. Quindi, a circa cinque millilitri di DMEM, che è stato condizionato per due o tre ore con il 5% di anidride carbonica e integrato con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina, la streptomicina, lo 0,1% di amfotericina B e 10 microgrammi per millilitro, l'aprotinina direttamente nella camera del bioreattore.

Quindi richiudere il bioreattore. Utilizzare una siringa per erogare gli ulteriori cinque millilitri di terreno condizionato con anidride carbonica attraverso il raccordo spinato sulla porta di ingresso per riempire completamente il bioreattore, rimuovere con cura eventuali bolle che si formano, impostare una pompa a siringa con una siringa da 10 millilitri o 30 millilitri riempita con un ulteriore mezzo condizionato con anidride carbonica al 5%. Collegare la siringa direttamente alla porta di ingresso sul coperchio del bioreattore con il tubo sterile con blocco dell'esca.

Impostare la velocità di perfusione sulla pompa a siringa su 0,01 millilitri al minuto. Quindi collegare i pezzi di tubo modificati a entrambe le porte di uscita e posizionare le estremità in un becher da 100 millilitri. Per raccogliere i rifiuti, utilizzare un martinetto da laboratorio per impostare le altezze delle alimentazioni di ingresso e di uscita in modo che non si sviluppi un differenziale di pressione nell'alimentazione del bioreattore.

Mezzo fresco condizionato con anidride carbonica al 5% al bioreattore durante l'esperimento. Al fine di mantenere il pH e rimuovere i prodotti di scarto, una siringa da 10 millilitri riempita con terreno durerà circa 16 ore. Posizionare l'obiettivo 20 XDIC sotto la finestra di visualizzazione del microscopio e assicurarsi che l'analizzatore polarizzatore e il prisma siano tutti in posizione.

Quindi aprire il software di imaging. Focalizza l'obiettivo sull'area compresa tra le tre x explan e salva le coordinate X, Y e Z di questa posizione nel software di imaging. Per visualizzare l'intera area tra e intorno all'esempio x, selezionare l'opzione per acquisire un'immagine di grandi dimensioni e specificare le dimensioni dell'area.

Ciò consentirà l'acquisizione di più immagini attorno all'area specificata e creerà un'immagine affiancata di grandi dimensioni, imposterà l'intensità della luce e il tempo di esposizione sui valori più bassi possibili. Ciò contribuirà a evitare la morte cellulare causata dalla fototossicità, pur fornendo una risoluzione sufficiente per discriminare tra cellule, microsfere e fibre di fibrina. Si noti che in questo particolare esperimento, le fibre di fibrina non sono visibili a causa dell'alta densità delle perle di diffusione della luce nel gel, ridurre la densità delle perle o lo spessore del gel per osservare le fibre di fibrina.

Quindi, inizia il monitoraggio della deformazione. Creando o scaricando prima il codice MATLAB personalizzato, quindi registra le immagini utilizzando le microsfere in tutto il gel come punti di riferimento. La registrazione dell'immagine garantirà che le immagini ottenute vengano scattate ogni volta nella stessa identica posizione.

Il riallineamento delle fibre è stato osservato tra explan catturando immagini affiancate ogni 15 minuti. Per un periodo di 48 ore, le singole regioni sono state estratte dalle immagini affiancate e analizzate con l'algoritmo di tracciamento della deformazione. Per misurare le deformazioni locali dallo spostamento delle microsfere, i grafici di contorno mostrano la distribuzione della massima deformazione principale nell'area di riallineamento delle fibre corrispondente alla reggia.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre o quattro ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la marcatura fluorescente del collagene e delle proteine del citoscheletro, nonché la quantificazione della migrazione cellulare, al fine di rispondere a ulteriori domande come quali percorsi meccanobiologici sono coinvolti nel rimodellamento dei tessuti e in che modo questi processi sono modulati da varie sostanze biochimiche.