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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Manutenzione

<em>C. elegans</em> Maintenance

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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Maintenance

3.3: An Introduction to Caenorhabditis elegans

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Ceanorhabditis elegans è stato, ed è tuttora, utilizzato con grande successo come organismo modello per lo studio di una varietà di fenomeni di sviluppo, genetici, molecolari e persino fisici. Al fine di utilizzare C. elegans al suo pieno potenziale, è essenziale una cura adeguata e un’attenzione al mantenimento di base di questo potente organismo.

In questo video imparerai i requisiti di base di alloggiamento e alimentazione di C. elegans, come gestire e manipolare correttamente i vermi usando un worm pick e come congelare e recuperare importanti stock di vermi. Verso la fine del video visiteremo alcune applicazioni di modifica dell’alloggiamento, dell’alimentazione e della manipolazione di questi importanti animali.

Procedure

La corretta cura e il mantenimento della Caenorhabditis elegans sono essenziali per esperimenti di successo.

Richiedono pochissimo spazio, sono economici da ospitare, hanno un’alta fecondità e sono facili da manipolare. Ma solo perché sono semplici da tenere in giro non significa scienza stravagante. In effetti, Sydney Brenner ha notoriamente chiamato C. elegans “Il dono della natura alla scienza”, e sin dalla sua introduzione nel 1974 il verme è stato descritto in una serie di esperimenti vincitori del premio Nobel.

In questo video dimostreremo i metodi di base per il mantenimento di C. elegans in laboratorio, tra cui: alloggiamento e alimentazione, manipolazione, nonché congelamento e scongelamento dei vermi.

In natura, C. elegans si trova nel terreno e si nutre di materia vegetale in decomposizione. In laboratorio, è importante mantenere i nematodi il più felici possibile, e quindi li ospitiamo e li nutriamo usando metodi molto specifici.

C. elegans può essere coltivato a 16, 20 o 25 °C a seconda delle esigenze dell’esperimento e può essere coltivato su mezzi solidi o liquidi. In entrambi i casi vengono alimentati con OP50, un ceppo standardizzato di E. coli utilizzato specificamente per la coltura di nematodi in ogni laboratorio di vermi in tutto il mondo.

Se coltivati a 25 °C, i C. elegans completano il loro ciclo di vita 2,1 volte più velocemente rispetto a quando vengono coltivati a 16 °C. Un ciclo di vita più veloce significa che i vermi maturano più velocemente, depongono più uova e consumano più cibo. Se ai vermi viene permesso di morire di fame o diventare troppo affollati, entrano in uno stadio larvale chiamato stadio dauer. Le larve di Dauer sono resistenti allo stress e non invecchiano.

Se mantenuti su mezzi solidi, I C. elegans vengono coltivati su piastre di agar preparate con mezzi di crescita di nematodi o mezzi NGM. Il giorno prima di fare le piastre, inoculare i mezzi LB liquidi con una singola colonia di OP50 E. coli. Incubare il mezzo a 37 °C durante la notte con agitazione.

Per produrre mezzi solidi, misurare e combinare le quantità appropriate di questi ingredienti con acqua deionizzata in un matraccio Erlenmeyer.

Dopo l’autoclave per almeno 15 minuti, lasciare raffreddare l’agar a 55 °C a bagnomaria. Una volta che il supporto si è raffreddato a 55 °C si dovrebbe essere in grado di tenere comodamente il contenitore di vetro a mani nude. Utilizzando una corretta tecnica asettica, additivi come farmaci o antibiotici possono essere aggiunti in questo momento. Vortice da mescolare. Quindi, pipettare NGM fuso in piastre di Petri fino a quando non sono 2/3 pieni. Lasciare asciugare i piatti appena fatti sulla panca durante la notte.

La mattina successiva pellet l’OP50 a 3500 x g per 10 minuti e poi riconsedia i batteri in mezzo LB a una concentrazione di 10X. Ora, pipettare un prato centrale su ogni piatto. Evitare di toccare la punta del pipetto sulla superficie dell’NGM e fare attenzione a non permettere alla coltura di toccare le pareti della piastra. Lasciare asciugare i piatti sul banco durante la notte. Una volta asciutte, esporre le piastre alla luce UV per sterilizzarle. Ora sono pronti per essere utilizzati durante la coltivazione di vermi.

C. elegans viene manipolato individualmente utilizzando uno strumento noto come worm pick. Il plettro è in genere realizzato con filo di platino calibro 30% 90% e filo di iridio al 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni metalliche leggermente diverse. Per fare una scelta, inizia rompendo la punta di una pipetta Pasteur alla lunghezza preferita.

Tagliare circa 3-4 cm di filo e posizionarne 0,5 cm all’interno della punta del pipetto. Sigillare il filo al vetro sopra un bruciatore Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm ma può variare in base alle preferenze individuali.

Appiattire l’estremità del filo utilizzando un bordo duro. Quindi piegare la porzione appiattita verso l’alto per formare uno scoop. Infine, carteggiare i bordi del plettro per evitare di danneggiare il verme o l’agar.

Per raccogliere i vermi sterilizzare il filo del plettro su una fiamma. Quindi rivestire la punta con OP50 E. coli spessa e appiccicosa da una piastra NGM. Prestare attenzione a non forare o cicatrizzare la superficie dell’agar.

Mentre guardi attraverso un cannocchiale di dissezione, raccogli leggermente il verme sul plettro appiattito e appiccicoso fino a quando il verme non si attacca al plettro.

Una volta che il verme è sul plettro, trasferire immediatamente tenendo leggermente la punta sulla nuova superficie di una nuova piastra e facendola scorrere sul prato batterico. Il verme dovrebbe strisciare fuori dal plettro. Il verme non dovrebbe rimanere sul plettro troppo a lungo o potrebbe asciugarsi.

Uno dei motivi per cui C. elegans è un modello popolare per la ricerca è perché le colture possono essere conservate per lunghi periodi di tempo senza alcun effetto negativo.

In primo luogo, lavare le larve appena affamate usando 0,5 ml di M9 Buffer, ruotare delicatamente per allentare tutte le larve e gli animali adulti, quindi trasferirli in un microcentrifuga o criotubo. Quindi, aggiungere la stessa quantità di glicerolo al 30% in M9 Buffer. Infine, imballare il flaconcino in una scatola isolata e conservare a -80 °C.

Per recuperare i vermi, rimuovere il tubo da un congelatore -80 e lasciare scongelare a temperatura ambiente fino a quando il contenuto non si scioglie completamente. Pipettare il liquido su una piastra NGM fresca con prato OP50 e incubare a 20 °C. Dopo 2-3 giorni, trasferire 10-15 animali in un nuovo piatto e consentire loro di riprodursi per una generazione. Raccogli la progenie e il punteggio per i fenotipi corretti.

Ora che abbiamo visto come C. elegans viene mantenuto in laboratorio, diamo un’occhiata a come le condizioni di alimentazione, alloggiamento e manipolazione vengono modificate per gli esperimenti.

La scoperta vincitrice del Nobel dell’interferenza dell’RNA ha permesso ai ricercatori di silenziare qualsiasi gene C. elegans per determinarne la funzione.

Possiamo indurre RNAi in C. elegans preparando prima piastre con E. coli che esprimono il gene bersaglio dsRNA, che i vermi mangeranno.

Quindi i vermi del 4 ° stadio larvale vengono trasferiti alle piastre RNAi e autorizzati a depostare le uova. Nella fase desiderata di sviluppo la progenie viene raccolta e valutata per fenotipi. Poiché condividiamo circa la metà del nostro genoma con il verme, molte delle intuizioni raccolte sono applicabili alle malattie umane.

A causa del suo rapido ciclo di vita, C. elegans è particolarmente adatto come modello di invecchiamento.

In primo luogo, viene generata una popolazione sincronizzata nel tempo di C. elegans, consentendo agli ermafroditi adulti di deportare le uova su piastre NGM. I vermi depongono le uova per 6-8 ore e poi vengono rimossi.

Quando i vermi sono nella fase desiderata, vengono trasferiti in nuove piastre NGM contenenti ampicillina per prevenire la contaminazione batterica e FUDR per impedire la riproduzione.

Da questo punto in avanti i vermi adulti vengono osservati ogni 2-3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. I vermi morti vengono rimossi dalla piastra e viene registrato il numero di vermi vivi e morti.

Analizzare la durata della vita nel contesto di insulti genetici o ambientali può fornire informazioni significative sul processo di invecchiamento.

Utilizzando i laser è possibile eseguire assotomie o il taglio di singoli assoni, in C. elegans vivo per studiare come si rigenerano le cellule nervose.

Ma, poiché i vermi non si fermano mai, vengono posti su cuscinetti di agarose al 10% in soluzione di microsfere. Una scivolata di copertura è posizionata sopra. Le microsfere aumentano il coefficiente di attrito dell’interazione pad-coverslip, congelando efficacemente il verme in posizione.

La diapositiva è ora preparata per l’esecuzione di astomie. I neuroni vengono portati in vista e centrati sul microscopio. Il laser viene quindi sparato utilizzando il pedale. La potenza laser ottimale speterrà il neurone senza danneggiare le strutture adiacenti. Il maggior numero possibile di assoni viene tagliato per animale.

Il tampone di agarose viene quindi accuratamente rimosso dal vetrino e i vermi possono recuperare su una piastra NGM seminata a 20 °C. Tra 8-48 ore dopo l’astomia, i neuroni possono essere preparati a segnare per la rigenerazione. Nella parte distale del taglio, il neurone forma un moncone. Tuttavia, nella porzione prossimale il neurone si rigenera formando neuriti allungati.

Hai appena visto l’opinione di JoVE sulla manutenzione di base di Ceanorhabditis elegans. In questo video abbiamo esaminato: alloggio e alimentazione di C. elegans, manipolazione e congelamento e recupero dei nematodi.

Abbiamo anche fatto un breve tour attraverso alcune applicazioni che rendono C. elegans uno strumento di ricerca così potente. Sebbene C. elegans sia dissimile dai mammiferi in molti modi, il loro corredo genetico simile, la facilità di manutenzione e la semplice manipolazione li rendono un modello importante nella ricerca della comprensione della biologia e delle malattie dei mammiferi. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Correct care and maintenance of Caenorhabditis elegans is essential for successful experiments.

They require very little space, are cheap to house, have high fecundity, and are easy to manipulate. But just because they are simple to keep around does not mean wimpy science. In fact, Sydney Brenner famously called C. elegans “Nature’s gift to science,” and since its introduction in 1974 the worm has been featured in a number of Nobel prize winning experiments.

In this video we will demonstrate basic methods for maintaining C. elegans in the lab, including: housing and feeding, handling, as well as freezing and thawing of worms.

In the wild, C. elegans are found in the soil and feed upon decomposing plant matter. In the lab, it’s important to keep nematodes as happy as possible, and so we house and feed them using very specific methods.

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending upon the requirements of the experiment, and can either be grown on solid or in liquid media. In both cases they are fed OP50, a standardized strain of E. coli used specifically for nematode culture in every worm lab around the world.

When grown at 25 °C, C. elegans complete their life cycle 2.1 times faster than when grown at 16 °C. A faster life cycle means the worms mature faster, lay more eggs and consume more food. If worms are allowed to starve or become too crowded they enter a larval stage called the dauer stage. Dauer larvae are stress resistant and do not age.

When maintained on solid media, C. elegans are grown on agar plates prepared with nematode growth media or NGM media. The day before making plates, inoculate liquid LB media with a single colony of OP50 E. coli. Incubate the media at 37 °C overnight with shaking.

To make solid media, measure and combine the appropriate amounts of these ingredients with deionized water in an Erlenmeyer flask.

After autoclaving for at least 15 minutes, let the agar cool to 55 °C in a water bath. Once the media has cooled to 55 °C you should be able to comfortably hold the glass container with bare hands. Using proper aseptic technique, additives like drugs or antibiotics can be added at this time. Swirl to mix. Then, pipette molten NGM into Petri plates until they are 2/3 full. Let the newly made plates dry on the bench overnight.

The next morning pellet the OP50 at 3500 x g for 10 minutes and then resuspend the bacteria in LB media to a 10X concentration. Now, pipette a central lawn onto each plate. Avoid touching the pipet tip to the surface of the NGM and take care not to allow the culture to touch the plate walls. Leave plates to dry on the bench overnight. Once dry, expose plates to UV light to sterilize them. They are now ready to be used when culturing worms.

C. elegans are individually manipulated using a tool known as the worm pick. The pick is typically is made from 30 gauge 90% platinum and 10% iridium wire, though some researchers may prefer slightly different metal compositions. To make a pick, start by breaking the tip of a Pasteur pipet to the preferred length.

Cut about 3 to 4 cm of wire and place 0.5 cm of it inside the tip of the pipet. Seal the wire to the glass over a Bunsen burner. The length of the wire protruding from the glass is about 3 to 3.5 cm but can vary according to individual preferences.

Flatten the end of the wire using a hard edge. Then bend the flattened portion upward to form a scoop. Finally, sand the edges of the pick to prevent damaging the worm or the agar.

To pick worms sterilize the wire of the pick on a flame. Then coat the tip with thick, sticky OP50 E. coli from an NGM plate. Use care to not puncture or scar the agar surface.

While looking through a dissection scope, lightly scoop the worm onto the flattened, sticky pick until the worm sticks to the pick.

Once the worm is on the pick, immediately transfer by lightly holding the tip to the new surface of a new plate and sliding it across the bacterial lawn. The worm should crawl off the pick. The worm should not stay on the pick for too long or it might dry out.

One of the reasons why C. elegans is a popular model for research is because cultures can be stored for long periods of time without any adverse effect.

First, wash freshly starved larvae using 0.5 ml M9 Buffer, gently swirl to loosen all larva and adult animals, and then transfer to a microcentrifuge or cryotube. Then, add equal amount 30% glycerol in M9 Buffer. Finally, pack the vial into an insulated box and store at -80 °C.

To recover worms, remove the tube from a -80 freezer and let thaw at room temperature until the contents fully melt. Pipette the liquid onto a fresh NGM plate with OP50 lawn and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer 10-15 animals to a new plate and allow them to reproduce for one generation. Collect the progeny and score for correct phenotypes.

Now that we’ve seen how C. elegans is maintained in the lab, let’s have a look at how feeding, housing, and handling conditions are modified for experiments.

The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function.

We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat.

Then 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes. Since we share about half of our genome with the worm many of the insights gleaned are applicable to human disease.

Because of its quick life-cycle, C. elegans is particularly well suited as a model of aging.

First, a time-synchronized population of C. elegans is generated, by allowing adult hermaphrodites to lay eggs on NGM plates. The worms lay eggs for 6-8 hr and then are removed.

When worms are at the desired stage they are transferred to new NGM plates containing ampicillin to prevent bacterial contamination and FUDR to prevent reproduction.

From this point forward adult worms are observed every 2-3 days until all worms have died. Dead worms are removed from the plate and the number of live and dead worms are recorded.

Analyzing life span in the context of genetic or environmental insults can yield significant insights into the aging process.

Using lasers it is possible to perform axotomies or the cutting of individual axons, in live C. elegans to study how nerve cells regenerate.

But, because worms never keep still, they are placed on 10% agarose pads in solution of microbeads. A cover slip is placed on top. The microbeads increase the coefficient of friction of the pad-coverslip interaction, effectively freezing the worm in place.

The slide is now prepared for performing axotomies. The neurons are brought into view and centered on the microscope. The laser is then fired using the foot pedal. Optimum laser power will sever the neuron without harming adjacent structures. As many axons as possible are cut per animal.

The agarose pad is then carefully removed from the slide, and worms are allowed to recover on a seeded NGM plate at 20 °C. Between 8-48 hr after the axotomy, the neurons can be prepared to score for regeneration. At the distal part of the cut, the neuron forms a stump. However, at the proximal portion the neuron regenerates forming elongated neurites.

You’ve just watched JoVE’s take on basic Ceanorhabditis elegans maintenance. In this video we reviewed: housing and feedings of C. elegans, handling them, and freezing and recovery of nematodes.

We also took a brief tour through some applications that make C. elegans such a powerful research tool. Although C. elegans are dissimilar to mammals in many ways, their similar genetic makeup, ease of maintenance, and simple manipulation make them an important model in the quest for understanding mammalian biology and disease. Thanks for watching!