3.6: C. elegans Manutenzione

La corretta cura e manutenzione di Caenorhabditis elegans è essenziale per il successo degli esperimenti.

Richiedono pochissimo spazio, sono economici da ospitare, hanno un'elevata fecondità e sono facili da manipolare. Ma solo perché sono semplici da tenere in giro non significa scienza debole. In effetti, Sydney Brenner ha notoriamente definito C. elegans "il dono della natura alla scienza" e dalla sua introduzione nel 1974 il verme è stato protagonista di numerosi esperimenti vincitori di premi Nobel.

In questo video dimostreremo i metodi di base per il mantenimento di C. elegans in laboratorio, tra cui: stabulazione e alimentazione, manipolazione, congelamento e scongelamento dei vermi.

In natura, C. elegans si trova nel terreno e si nutre di materia vegetale in decomposizione. In laboratorio, è importante mantenere i nematodi il più felici possibile, quindi li ospitiamo e li nutriamo con metodi molto specifici.

C. elegans può essere coltivato a 16, 20 o 25 ? C a seconda dei requisiti dell'esperimento e può essere coltivato su terreni solidi o liquidi. In entrambi i casi vengono alimentati con OP50, un ceppo standardizzato di E. coli utilizzato specificamente per la coltura di nematodi in ogni laboratorio di lombrichi in tutto il mondo.

Quando viene coltivato a 25 anni ? C, C. elegans completa il suo ciclo di vita 2,1 volte più velocemente rispetto a quando viene coltivato a 16 °C. Un ciclo di vita più veloce significa che i vermi maturano più velocemente, depongono più uova e consumano più cibo. Se i vermi vengono lasciati morire di fame o diventano troppo affollati, entrano in uno stadio larvale chiamato stadio di dauer. Le larve di Dauer sono resistenti allo stress e non invecchiano.

Se mantenuto su terreni solidi, C. elegans viene coltivato su piastre di agar preparate con terreni di crescita di nematodi o terreni NGM. Il giorno prima di preparare le lastre, inoculare il terreno LB liquido con una singola colonia di OP50 E. coli. Incubare i media a 37 anni ? C durante la notte con agitazione.

Per ottenere un terreno solido, misurare e combinare le quantità appropriate di questi ingredienti con acqua deionizzata in un pallone di Erlenmeyer.

Dopo la sterilizzazione in autoclave per almeno 15 minuti, lasciare raffreddare l'agar a 55 ? C a bagnomaria. Una volta che il fluido si è raffreddato a 55 ? C Dovresti essere in grado di tenere comodamente il contenitore di vetro a mani nude. Utilizzando un'adeguata tecnica asettica, in questo momento è possibile aggiungere additivi come farmaci o antibiotici. Agitare per mescolare. Quindi, pipettare l'NGM fuso nelle piastre di Petri fino a riempirle per 2/3. Lascia asciugare i piatti appena fatti sul banco per una notte.

La mattina successiva pellettare l'OP50 a 3500 x g per 10 minuti e poi risospendere i batteri in terreno LB a una concentrazione di 10X. Ora, pipetta un prato centrale su ogni piatto. Evitare di toccare la punta della pipetta con la superficie dell'NGM e fare attenzione a non lasciare che la coltura tocchi le pareti della piastra. Lasciare asciugare i piatti sul banco per una notte. Una volta asciutte, esporre le piastre ai raggi UV per sterilizzarle. Ora sono pronti per essere utilizzati durante la coltura dei vermi.

I C. elegans vengono manipolati individualmente utilizzando uno strumento noto come worm pick. Il plettro è in genere realizzato con filo di platino al 90% e al 10% di iridio, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni metalliche leggermente diverse. Per fare un plettro, inizia rompendo la punta di una pipetta Pasteur alla lunghezza che preferisci.

Tagliare circa 3-4 cm di filo e posizionarne 0,5 cm all'interno della punta della pipetta. Sigillare il filo al vetro sopra un bruciatore Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm ma può variare in base alle preferenze individuali.

Appiattire l'estremità del filo usando un bordo duro. Quindi piegare la parte appiattita verso l'alto per formare una paletta. Infine, carteggiare i bordi del piccone per evitare di danneggiare il verme o l'agar.

Per raccogliere i vermi, sterilizzare il filo del plettro su una fiamma. Quindi rivestire la punta con E. coli OP50 denso e appiccicoso da una piastra NGM. Prestare attenzione a non forare o cicatrizzare la superficie dell'agar.

Mentre guardi attraverso un cannocchiale da dissezione, raccogli leggermente il verme sul plettro appiattito e appiccicoso finché il verme non si attacca al piccone.

Una volta che il verme è sul piccone, trasferirlo immediatamente tenendo leggermente la punta sulla nuova superficie di una nuova piastra e facendola scorrere sul prato batterico. Il verme dovrebbe strisciare via dal piccone. Il verme non deve rimanere sul piccone troppo a lungo o potrebbe seccarsi.

Uno dei motivi per cui C. elegans è un modello popolare per la ricerca è perché le colture possono essere conservate per lunghi periodi di tempo senza alcun effetto negativo.

Per prima cosa, lavare le larve appena affamate utilizzando 0,5 ml di tampone M9, agitare delicatamente per allentare tutte le larve e gli animali adulti, quindi trasferirle in una microcentrifuga o in una crioprovetta. Quindi, aggiungere la stessa quantità di glicerolo al 30% in M9 Buffer. Infine, imballare il flaconcino in una scatola termica e conservarlo a -80 °C.

Per recuperare i vermi, rimuovere il tubo da un congelatore a -80 e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente fino a quando il contenuto non si scioglie completamente. Pipettare il liquido su una piastra NGM fresca con prato OP50 e incubare a 20 °C. Dopo 2-3 giorni, trasferire 10-15 animali in un nuovo piatto e lasciarli riprodurre per una generazione. Raccogli la progenie e ottieni un punteggio per i fenotipi corretti.

Ora che abbiamo visto come C. elegans viene mantenuto in laboratorio, diamo un'occhiata a come vengono modificate le condizioni di alimentazione, stabulazione e manipolazione per gli esperimenti.

La scoperta dell'interferenza dell'RNA, vincitrice del premio Nobel, ha permesso ai ricercatori di silenziare qualsiasi gene di C. elegans per determinarne la funzione.

Possiamo indurre l'RNAi in C. elegans preparando prima piastre con E. coli che esprimono il gene bersaglio dsRNA, che i vermi mangeranno.

Quindi i vermi del 4° stadio larvale vengono trasferiti nelle piastre RNAi e lasciati deporre le uova. Allo stadio di sviluppo desiderato, la progenie viene raccolta e valutata per fenotipi. Dal momento che condividiamo circa la metà del nostro genoma con il verme, molte delle intuizioni raccolte sono applicabili alle malattie umane.

A causa del suo rapido ciclo di vita, C. elegans è particolarmente adatto come modello di invecchiamento.

In primo luogo, viene generata una popolazione sincronizzata nel tempo di C. elegans, consentendo agli ermafroditi adulti di deporre le uova su piastre NGM. I vermi depongono le uova per 6-8 ore e poi vengono rimossi.

Quando i vermi sono allo stadio desiderato, vengono trasferiti in nuove piastre NGM contenenti ampicillina per prevenire la contaminazione batterica e FUDR per prevenire la riproduzione.

Da questo punto in poi i vermi adulti vengono osservati ogni 2-3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. I vermi morti vengono rimossi dalla piastra e viene registrato il numero di vermi vivi e morti.

L'analisi della durata della vita nel contesto di insulti genetici o ambientali può fornire informazioni significative sul processo di invecchiamento.

Utilizzando i laser è possibile eseguire assotomie o il taglio di singoli assoni, in C. elegans vivi per studiare come si rigenerano le cellule nervose.

Ma, poiché i vermi non stanno mai fermi, vengono posti su tamponi di agarosio al 10% in soluzione di microsfere. Sopra viene posizionato un vetrino coprioggetto. Le microsfere aumentano il coefficiente di attrito dell'interazione tampone-vetrino, congelando efficacemente il verme in posizione.

Il vetrino è ora preparato per l'esecuzione delle assotomie. I neuroni vengono portati in vista e centrati sul microscopio. Il laser viene quindi sparato utilizzando il pedale. Una potenza laser ottimale reciderà il neurone senza danneggiare le strutture adiacenti. Vengono tagliati il maggior numero possibile di assoni per animale.

Il tampone di agarosio viene quindi rimosso con cura dal vetrino e i vermi vengono lasciati riprendersi su una piastra NGM seminata a 20 °C. Tra 8-48 ore dopo l'assotomia, i neuroni possono essere preparati per segnare per la rigenerazione. Nella parte distale del taglio, il neurone forma un moncone. Tuttavia, nella porzione prossimale il neurone si rigenera formando neuriti allungate.

Hai appena visto l'approccio di JoVE alla manutenzione di base del Ceanorhabditis elegans. In questo video abbiamo esaminato: l'alloggiamento e l'alimentazione di C. elegans, la loro manipolazione e il congelamento e il recupero dei nematodi.

Abbiamo anche fatto un breve tour attraverso alcune applicazioni che rendono C. elegans uno strumento di ricerca così potente. Sebbene i C. elegans siano dissimili dai mammiferi in molti modi, il loro corredo genetico simile, la facilità di manutenzione e la semplice manipolazione li rendono un modello importante nella ricerca per la comprensione della biologia e delle malattie dei mammiferi. Grazie per l'attenzione!