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General Laboratory Techniques

Comprendere la concentrazione e misurare i volumi

Understanding Concentration and Measuring Volumes

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Understanding Concentration and Measuring Volumes

1.2: Introduction to the Microplate Reader

1.4: Making Solutions in the Laboratory

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08:51 min

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April 30, 2023

Overview

Le soluzioni sono utilizzate in una certa misura in quasi tutte le applicazioni di ricerca biologica. Pertanto, capire come misurarli e manipolarli è imperativo per qualsiasi esperimento. In questo video vengono introdotti i concetti relativi alla preparazione delle soluzioni. Le soluzioni sono costituite da un soluto disciolto in solvente per produrre una miscela omogenea di sostanze molecolari. Le soluzioni sono generalmente identificate dai loro componenti e dalle concentrazioni corrispondenti. Le soluzioni concentrate vengono diluite attraverso vari metodi, come la diluizione seriale. Questo video getta anche le basi per l’accurata preparazione delle soluzioni. Ad esempio, il video esamina come misurare i volumi con precisione attraverso l’uso del contenitore volumetrico appropriato e come leggere il volume quando è presente un menisco. Vengono quindi presentate alcune applicazioni per la misurazione dei volumi. L’elettroforesi su gel è una procedura di laboratorio comunemente usata che richiede la preparazione di una soluzione di volume percentuale di peso e la diluizione parallela di una soluzione stock concentrata. Viene inoltre dimostrato l’uso di una diluizione seriale per preparare standard per la generazione di una curva standard nella quantificazione delle proteine.

Procedure

Comprendere i concetti alla base della concentrazione della soluzione e misurare i volumi in laboratorio sono due aspetti importanti di quasi tutti gli esperimenti.

Le soluzioni sono costituite da un soluto disciolto in solvente per produrre una miscela omogenea.

Le soluzioni sono generalmente identificate dai loro componenti e dalle concentrazioni corrispondenti.

Per arrivare correttamente alla corretta concentrazione della soluzione, è necessario avere familiarità con i diversi contenitori disponibili per le misurazioni del volume.

Una tecnica scadente nella misurazione dei volumi può portare a concentrazioni errate e fare la differenza tra un esperimento riuscito o fallito.

Quando si eseguono esperimenti, è imperativo conoscere l’esatta concentrazione di soluzioni utilizzate.

La concentrazione è più comunemente espressa come molarità. Una soluzione molare contiene un mol di soluto per litro di soluzione (B + C). Quando si realizzano soluzioni in laboratorio, i moli di soluto possono essere determinati dalla massa misurata della molecola e dal suo peso molecolare.

Le soluzioni possono anche essere preparate e quantificate come concentrazioni percentuali dal peso del soluto per unità di volume di solvente, nota come soluzione percentuale peso-volume.

Tieni presente che il soluto a volte è in forma liquida. In questo caso, la concentrazione percentuale può essere espressa come volume di soluto liquido per unità di volume di solvente, indicato come soluzione volume-volume percentuale.

Per un uso frequente, è possibile preparare soluzioni concentrate di composti stabili, note come soluzioni stock. Le soluzioni stock possono essere etichettate come un multiplo della concentrazione nella soluzione di lavoro finale. Qui vedi una soluzione 10X.

Queste soluzioni stock possono essere diluite secondo necessità con solvente per ottenere la concentrazione desiderata.

In alternativa, una diluizione può essere preparata da una soluzione più concentrata utilizzando una diluizione parallela. Utilizzando questo semplice calcolo, è possibile preparare una soluzione di concentrazione desiderata e volume desiderato da una soluzione stock di concentrazione nota. Il volume risultante può essere diluito al volume totale della soluzione per ottenere la concentrazione desiderata.

Tuttavia, in alcune situazioni, il fattore di diluizione, che è uguale al volume finale diviso per il volume di soluzione stock necessaria per la diluizione, è troppo grande. Ciò rende impraticabile la diluizione parallela in quanto il volume necessario della soluzione stock sarebbe troppo piccolo per essere misurato con precisione.

Con la tecnica di diluizione seriale, è possibile utilizzare una soluzione stock per creare una soluzione diluita, che può quindi essere ulteriormente diluita per creare una soluzione più diluita e così via fino a raggiungere la concentrazione desiderata.

Quando si misurano i volumi in laboratorio ci si imbatte in molti contenitori che possono contenere liquidi. Tuttavia, è importante rendersi conto che non tutti questi vasi sono progettati per misurare con precisione il volume.

I contenitori non volumetrici, come i becchi e i palloni Erlenmeyer, sono progettati per la miscelazione e la conservazione di soluzioni e generalmente non sono calibrati. Invece, le misurazioni, o graduazioni, sul lato rappresentano approssimazioni della capacità liquida.

Al contrario, gli articoli da laboratorio volumetrici sono progettati per misurare volumi esatti di sostanze liquide. Il labware volumetrico è indicato con la capacità che è calibrato per contenere e le lettere TC o TD.

TC sta per “contenere” e si trova generalmente su palloni volumetrici e cilindri graduati, che sono calibrati per contenere un volume preciso di liquido.

TD denota “consegnare” e di solito si trova su dispositivi di misurazione progettati per erogare liquidi, come pipette e siringhe.

I palloni volumetrici sono generalmente utilizzati per preparare soluzioni di una concentrazione specifica. Dopo aver sciolto il soluto, il solvente viene aggiunto al pallone fino a quando il volume totale raggiunge la linea di graduazione. L’aggiunta della “quantità sufficiente” per raggiungere questo volume è nota come Q.S. la soluzione.

Quando si q.s.’ing la soluzione, la parte superiore del liquido curva dove incontra il pallone. Questo è chiamato menisco ed è causato dalla tensione superficiale. In una soluzione acquosa, il menisco è concavo e deve essere letto nel punto più basso della curva.

Esistono diversi recipienti progettati per misurare e fornire volumi specifici di liquido. Quando si sceglie il labware volumetrico, selezionare sempre il dispositivo più piccolo che ospiterà il volume desiderato per ottenere la massima precisione.

Quando si misurano volumi di liquido superiori a 50 ml, i cilindri graduati sono la scelta appropriata.

Le pipette sierologiche sono generalmente utilizzate per misurare ed erogare volumi nell’intervallo da 0,1 a 50 ml.

Per volumi da 0,2 microlitri a 5 ml, devono essere utilizzati micropipettatori.

Quando le punte delle pipette in plastica non sono compatibili con il liquido da misurare, le siringhe Hamilton in vetro sono un’alternativa per la misurazione accurata dei volumi nell’intervallo dei microliti.

Ora che abbiamo trattato le basi del lavoro con le soluzioni, discuteremo di come alcuni di questi concetti vengono applicati nella ricerca.

L’elettroforesi del DNA Gel è una tecnica utilizzata per separare una popolazione mista di frammenti di DNA, per stimarne le dimensioni, applicando un campo elettrico per spostare le molecole caricate negativamente attraverso una matrice gel fatta di acarosio – un carboidrato da alghe marine

Nella preparazione della matrice di gel, le soluzioni di peso / volume percentuale sono comunemente usate per produrre gel di agarose in peso / volume dell’1%.

Generalmente l’elettroforesi richiede grandi quantità di buffer in esecuzione. A causa del loro uso frequente e dei grandi volumi, questi buffer sono solitamente diluiti da soluzioni stock 10x più concentrate.

Per ottenere il buffer 1x desiderato, un volume unitario della soluzione stock viene diluito in volumi unitari di acqua purificata di 9 unità.

Negli esperimenti di lettura di micropiassure, la concentrazione di campioni sconosciuti di proteine è spesso determinata sulla base di una serie di campioni di concentrazioni note chiamate standard.

Le diluizioni seriali sono spesso utilizzate per generare standard di concentrazioni incrementalmente più elevate, in modo che alla fine possa essere generata una curva standard e determinata la concentrazione di campione sconosciuto.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla comprensione della concentrazione e alla misurazione dei volumi. In questo video abbiamo esaminato alcuni concetti di base come il calcolo della concentrazione, l’esecuzione di diluizioni e come vengono utilizzati diversi tipi di labware per misurare i volumi. Le applicazioni di alcuni dei concetti introdotti in questo video sono state discusse anche per la biologia molecolare e la biochimica.

Grazie per aver guardato e ricorda di usare sempre accuratezza e precisione quando si misurano i volumi.

Transcript

Understanding the concepts behind solution concentration and measuring volumes in the lab are two important aspects of nearly every experiment.

Solutions are made up of a solute dissolved in solvent to yield a homogeneous mixture.

Solutions are generally identified by their components and corresponding concentrations.

To correctly arrive at the correct solution concentration, you must be familiar with the many different containers available for volume measurements.

Poor technique when measuring volumes can lead to incorrect concentrations and be the difference between a successful or failed experiment.

When performing experiments, it is imperative to know the exact concentration of solutions used.

Concentration is most commonly expressed as molarity. A one molar solution contains one mol of solute per liter of solution (B+C). When making solutions in the lab, the mols of solute can be determined from the measured mass of the molecule and its molecular weight.

Solutions can also be prepared and quantified as percent concentrations from the weight of solute per unit volume of solvent, known as a percent weight-volume solution.

Keep in mind that the solute is sometimes in liquid form. In this case, the percent concentration can be expressed as the volume of liquid solute per unit volume of solvent, referred to as a percent volume-volume solution.

For frequent use, concentrated solutions of stable compounds, known as stock solutions, can be prepared. Stock solutions may be labeled as a multiple of the concentration in the final working solution. Here you see a 10X solution.

These stock solutions can be diluted as necessary with solvent to achieve the desired concentration.

Alternatively, a dilution can be prepared from a more concentrated solution using a parallel dilution. Using this simple calculation, a solution of desired concentration and desired volume can be prepared from a stock solution of known concentration. The resulting volume can be diluted to the total volume of the solution to achieve the desired concentration.

However, in some situations, the dilution factor, which is equal to the final volume divided by volume of stock solution needed for the dilution, is too large. This makes parallel dilution impractical as the necessary volume of the stock solution would be too small to accurately measure.

With the serial dilution technique, a stock solution can be used to make a dilute solution, which can then be diluted further to make a more dilute solution and so on until the desired concentration is met.

When measuring volumes in the lab you will come across many containers that can hold liquid. However, it is important to realize that not all of these vessels are designed for accurately measuring volume.

Non-volumetric containers, such as beakers and Erlenmeyer flasks, are designed for mixing and storing solutions and are generally not calibrated. Instead, the measurements, or graduations, on the side represent approximations of liquid capacity.

Conversely, volumetric labware is designed to measure exact volumes of liquid substances. Volumetric labware is denoted with the capacity it is calibrated to hold as well as the letters TC or TD.

TC stands for “to contain” and is generally found on volumetric flasks and graduated cylinders, which are calibrated to hold a precise volume of liquid.

TD denotes “to deliver” and is usually found on measuring devices designed to dispense liquid, such as pipettes and syringes.

Volumetric flasks are generally used to prepare solutions of a specific concentration. After dissolving the solute, solvent is added to the flask until the total volume reaches the graduation line. Adding the “quantity sufficient” to reach this volume is known as Q.S.’ing the solution.

When Q.S.’ing the solution, the top of the liquid curves where it meets the flask. This is called the meniscus and is caused by surface tension. In an aqueous solution, the meniscus is concave, and should be read at the lowest point of the curve.

There are several vessels designed to measure and deliver specific volumes of liquid. When choosing volumetric labware, always select the smallest device that will accommodate the desired volume to achieve the highest accuracy.

When measuring volumes of liquid above 50 mL, graduated cylinders are the appropriate choice.

Serological pipettes are generally used to measure and deliver volumes in the range of 0.1 to 50 mL.

For volumes of 0.2 microliters to 5 mL, micropipettors should be used.

When plastic pipette tips are not compatible with the liquid to be measured, glass Hamilton syringes are an alternative for accurate measurement of volumes in the microliter range.

Now that we have covered the basics of working with solutions, we’ll discuss how some of these concepts are applied in research.

DNA Gel electrophoresis is a technique used to separate a mixed population of DNA fragments, to estimate their size, by applying an electric field to move the negatively charged molecules through a gel matrix made of agarose – a carbohydrate from seaweed

In preparing the gel matrix, percent weight/volume solutions are commonly used to make 1% weight/volume agarose gels.

Generally electrophoresis requires large quantities of running buffers. Because of their frequent use and large volumes, these buffers are usually diluted from more concentrated 10x stock solutions.

To achieve the desired 1x buffer, one unit volume of the stock solution is diluted in 9 unit volumes of purified water.

In microplate reader experiments, the concentration of unknown samples of protein are often determined based on a set of samples of known concentrations called standards.

Serial dilutions are often used to generate standards of incrementally-higher concentrations, so that ultimately, a standard curve can be generated and the concentration of unknown sample determined.

You’ve just watched JoVE’s introduction to understanding concentration and measuring volumes. In this video we reviewed some basic concepts such as calculating concentration, performing dilutions , and how different types of labware are used to measure volumes. Applications of some of the concepts introduced in this video were also discussed for molecular biology and biochemistry.

Thanks for watching and remember to always use accuracy and precision when measuring volumes.

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