Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare strutture come l'actina F nella sinapsi litica delle cellule NK utilizzando la microscopia TED. Ciò si ottiene ricapitolando prima la sinapsi sul vetro utilizzando un anticorpo attivante. Il secondo passo della procedura consiste nel fissare la permeazione e colorare le cellule per le strutture di interesse.

Successivamente, i vetrini vengono ripresi mediante microscopia confocale a scansione laser, seguita dall'applicazione della deplezione di stead per una maggiore risoluzione dell'immagine. Il passaggio finale consiste nell'elaborare le immagini utilizzando un algoritmo di deconvoluzione. In definitiva, i risultati possono mostrare una risoluzione inferiore a 100 nanometri delle strutture cellulari grazie al dual color stead e all'endoscopia.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come una relazione tra il citoscheletro e l'esocitosi. Nel nostro caso, siamo interessati alla secrezione di lisosomi specializzati chiamati granuli litici da parte di cellule natural killer. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci sono più variabili che possono essere regolate nell'applicazione del laser a svuotamento TED.

Un'applicazione inappropriata del fascio di esaurimento comporterà un peggioramento anziché un miglioramento della risoluzione In preparazione, scaldare 30 millilitri di media RPMI con il 10% di FCS e separatamente. Un millilitro di BD CY ha effetti cyop perm entrambi a 37 gradi Celsius. Quindi iniziare il processo di rivestimento dei vetrini coprioggetto con anticorpi.

Prendi i vetrini coprioggetto numero 1.5 e usa una penna PAP. Crea dei quadrati delle dimensioni di una monetina sui vetrini. Prepara un quadrato per ogni condizione testata.

Caricare ogni cerchio con 200 microlitri di anticorpi a cinque microgrammi per millilitro in PBS. Per l'attivazione delle cellule NK 92, utilizzare anticorpi anti CD 18 e anti NK P 30. Incubare i vetrini coprioggetti caricati a 37 gradi Celsius per mezz'ora, quindi lavarli via con un tuffo a temperatura ambiente PBS procedere immediatamente con l'aggiunta delle celle per ogni condizione testata, 500.000 celle devono essere pronte per l'uso.

Lavare le celle in 10 millilitri di terreno di preriscaldamento e poi risospenderle nello stesso mezzo riscaldato. A 2,5 milioni di cellule per millilitro con le cellule completamente in sospensione, decantare 200 microlitri in ciascun quadrato di anticorpo sul coperchio Incubare il vetrino coprioggetto con cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 in questo caso. 20 minuti sono sufficienti per polarizzare i granuli nelle cellule NK dopo il lavaggio di incubazione, il coperchio scivola delicatamente nel PBS a temperatura ambiente.

Iniziare aggiungendo un microlitro di TRITTON X 100 a un millilitro di soluzione calda BD CY effects cyto perm. Poi vortice. Applicare 200 microlitri di questa soluzione su ogni quadrato di condizione sui vetrini coprioggetti.

Quindi posizionare le celle al buio a temperatura ambiente e attendere 10 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente i vetrini coprioggetto in un tampone colorante. Quindi asciugare i bordi delle regioni circostanti con un batuffolo di cotone.

Quindi, aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario nel tampone di colorazione alle regioni circostanti e lasciare che i vetrini coprioggetti incubino al buio per mezz'ora. Alcuni buoni anticorpi secondari per l'imaging stead includono Alexa floor 4 88 Pacific orange e Horizon V 500. Ognuno di questi funziona bene con una diluizione da uno a 200.

Dopo il lavaggio di incubazione, il coperchio scivola nella colorazione, tampona e asciuga. Come prima, applicare 200 microlitri di anticorpo secondario su ciascun quadrato della condizione. Poi lasciateli riposare al buio per altri 30 minuti.

A questo punto, è possibile aggiungere ulteriori anticorpi dopo ulteriori lavaggi. Ad esempio, Phin può essere applicato da uno a 200 per rilevare la factina. Per un mezzo di montaggio, scegliere il prolungamento rispetto allo schermo vettoriale, che non è compatibile con lo stead.

Se si utilizza la colorazione con pinna, evitare di utilizzare due tio etanolo mentre va bene, applicare ora da 10 a 20 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino. Con il vetrino coprioggetto capovolto, abbassarlo delicatamente nel fluido, evitando bolle d'aria. Quindi incubare il vetrino per 24 ore.

Con il coperchio, scivolare il giorno successivo, sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e procedere con l'imaging. Avviare i laser e il software. Il laser di esaurimento del suolo dovrebbe riscaldarsi al 100% della potenza ed essere allineato.

Utilizzando l'oculare, mettere a fuoco il campione, quindi passare al software. Scansiona il primo canale, quello con la lunghezza d'onda più lunga. Al quarto piano, ottimizza la potenza del laser, la posizione del raggio di eccitazione e la portata del rivelatore.

Evitare di impostare su un valore superiore a 100. Quindi, acquisisci un'immagine confocale e verifica la presenza di pixel. La saturazione, la linea e la media dei fotogrammi miglioreranno la risoluzione dei pixel.

L'obiettivo è quello di essere al di sotto dei 30 nanometri per pixel. Una certa saturazione è accettabile per la stabilità. Quindi, applicare il raggio di esaurimento del stead al 50% di potenza e acquisire un'immagine.

Se la risoluzione migliora, è possibile applicare più potenza. Inoltre, anche la regolazione della potenza del laser di eccitazione o della media della linea o del guadagno potrebbe migliorare la risoluzione. Per ridurre lo sfondo, applicare 0,3 nanosecondi di time gating e regolare verso l'alto.

La nuova risoluzione deve essere stimata utilizzando un calcolo massimo di mezza larghezza completa. Una volta soddisfatto, ripetere questi passaggi con il secondo canale quando tutti i canali sono stati modificati. Verificare la sovrapposizione spettrale visualizzando i controlli di una singola colorazione con tutte le sequenze di scansione.

La lieve sovrapposizione può essere corretta con l'unmixing spettrale dal software, ma è meglio evitarla o mantenerla al minimo. Ora, acquisisci le immagini per l'imaging quantitativo. Ottenere almeno 20 immagini per condizione in base alle condizioni sperimentali.

Per devolvere le immagini salvate, aprire i file nell'apposito software. Controllare i parametri di ciascun canale, in particolare gli spettri di eccitazione e ammissione, l'emissione di deplezione di stead e la direzione dell'imaging. Quindi applica i calcoli di deconvoluzione del software.

Le impostazioni predefinite di solito sono sufficienti, ma il rapporto segnale/rumore varia in base alla forza del pavimento, quindi questo parametro deve essere impostato manualmente per l'esperimento. Ci sono alcune insidie comuni che possono portare a una risoluzione non ottimale con stead. Uno è in fase di campionamento.

Ciò porta a granulosità e perdita di informazioni sui pixel come in questi filamenti di factina. L'aumento della media delle linee o dei fotogrammi spesso risolve questo problema. Un altro problema è lo sbiancamento o il sovracampionamento causato da pixel lunghi.

Anche il tempo di permanenza, solitamente dovuto a un'eccessiva media delle linee rispetto alla scansione prima dell'acquisizione dell'immagine, può essere il colpevole e può essere corretto utilizzando una scansione più piccola prima di acquisire le immagini o utilizzando una velocità di scansione più elevata. Ridurre la potenza del laser può anche aiutare a far funzionare tutto. L'immagine migliorerà notevolmente.

La deconvoluzione migliorerà ulteriormente l'immagine. Sia quantitativamente che qualitativamente. La risoluzione inferiore a 100 nanometri dovrebbe essere ottenuta di routine durante il tentativo di questa procedura.

È importante ricordare di eseguire l'allineamento del fascio fisso prima di ogni esperimento e circa una volta all'ora dopo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi quantitativa, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti la colocalizzazione, la localizzazione subcellulare e le interazioni molecolari.