Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di recuperare RNA di alta qualità dai motoneuroni del midollo spinale senza contaminazione da parte dell'RNA delle cellule vicine. Ciò si ottiene recuperando, dividendo e incorporando prima il cordone in un mezzo di inclusione criogenico e congelando a una temperatura negativa di 160 gradi Celsius. Il secondo passaggio consiste nel criosezionare il cavo su diapositive della membrana della penna a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Successivamente, i vetrini vengono lavati in etanolo al 70% e colorati con Azure B in etanolo al 70%. La fase finale è la microdissezione a cattura laser dei corpi cellulari dei motoneuroni identificati in tampone di lisi del tiocianato di guina. In definitiva, l'RNA totale viene preparato dai lisati combinati e testato per scoprire differenze nella trascrizione generale o specifica dell'RNA nei neuroni di animali mutanti rispetto a quelli selvatici.

La microdissezione a cattura laser consente il recupero di corpi cellulari di motoneuroni da sezioni di midollo spinale senza contaminazione da parte dei più numerosi Scalia e di altri tipi di cellule. Offrendo la possibilità di preparare l'RNA e confrontare la trascrizione tra i neuroni di un animale malato e uno normale. L'aspetto più difficile nello sviluppo di questa procedura è stato quello di trovare un metodo di colorazione che ci permettesse di rilevare i motoneuroni nelle sezioni del midollo spinale mantenendo alti livelli di integrità dell'RNA e capacità di estrazione, sia prima che durante la cattura laser.

Abbiamo scoperto che le sezioni di colorazione in Azure B e 70% di etanolo soddisfacevano questi criteri se combinate con la raccolta dei corpi cellulari sezionati direttamente nel tampone di lisi del tiocianato di Guinea dimostrando che la procedura è ine Van Padia, un postdoc nel nostro laboratorio per i migliori risultati. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano pulite con una soluzione decontaminante a base di RNA priva di RNA 70% di etanolo dopo l'eutanasia e la perfusione transcardiaca Isolare accuratamente il midollo spinale. Sciacquare il cordone per 10 secondi negli RNA.

Acqua libera per lavare via il sangue residuo e adagiarlo su un vetrino privo di RNA molto delicatamente ma rapidamente. Quindi, dividi il midollo spinale trasversalmente usando una lama di rasoio pulita in nove o 10 pezzi. Posizionare i pezzi in uno stampo criogenico riempito di OCT e allinearli verticalmente utilizzando un ago pulito.

Posizionare lo stampo in un vassoio poco profondo contenente due metilbutano pre-raffreddare con azoto liquido. Per evitare la degradazione dell'RNA, immergere il vassoio in un bagno di azoto liquido. Per congelare velocemente i pezzi del midollo spinale.

Conservare il blocco incorporato nell'OCT a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi prima del sezionamento. Quando è pronto per la posizione di sezionamento, l'OCT ha incorporato il blocco in un criostato raffreddato. Produci fette da 20 micron, ciascuna contenente da nove a 10 sezioni trasversali del midollo spinale.

Posizionare le sezioni sulla membrana della penna libera dagli RNA. Due vetrini micron mantenuti inizialmente a temperatura ambiente per garantire l'adesione delle sezioni. Bene, ricongelare immediatamente la sezione su una superficie negativa di 20 gradi Celsius all'interno del criostato.

Mantenere i vetrini a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati su un rack pulito. Sei provette coniche da 50 millilitri riempite con RNA free.70% di etanolo. La profondità dovrebbe essere sufficiente a coprire tutte le sezioni di un vetrino quando il vetrino è immerso.

Posizionare quindi la soluzione 1% di Azure B nello stesso rack. Per ridurre al minimo il tempo tra il cambio delle soluzioni durante il lavaggio o la colorazione, tenere tre o quattro salviette da laboratorio davanti al rack per drenare rapidamente la soluzione in eccesso. Quando sono pronti, estrarre i vetrini dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi e posizionarli sul ghiaccio secco per scongelare un vetrino posizionandolo su un palmo guantato.

Rimuovere la maggior parte dell'umidità e della condensa sul vetrino strofinandolo con una salvietta da laboratorio, facendo attenzione a non toccare le sezioni. Mettere il vetrino su un essiccante in gel di silice fresco in una capsula di Petri per 30-40 secondi per farlo asciugare completamente. Una volta asciutto, immergere il vetrino nella prima provetta di RNA, etanolo libero al 70%.

Immergere il vetrino per 30 secondi e poi lavare via l'OCT immergendolo su e giù per 45 secondi a un minuto. Quindi, estrarre il vetrino dalla soluzione e scolare il liquido in eccesso sulle salviette da laboratorio. Ripetere questo processo immergendo il vetrino nel secondo tubo di etanolo al 70%.

Se l'OCT rimane attorno alle sezioni del midollo spinale, ripetere il lavaggio nel terzo tubo. Dopo aver drenato il liquido in eccesso, immergere il vetrino in una soluzione di Azure B all'1% in RNA al 70%, etanolo libero per 30-45 secondi. Scolare l'eccesso di Azure B su una salvietta da laboratorio.

A questo punto, l'intera diapositiva sarà blu. Immergere il vetrino nel tubo successivo di etanolo al 70% e immergerlo su e giù rapidamente, tre o quattro volte per rimuovere il colorante in eccesso e per rendere visibile la colorazione specifica del motoneurone. Se le sezioni appaiono molto scure, ripetere la fase di colorazione in una tubetta nuova di etanolo al 70%.

Se la colorazione sembra troppo chiara, riportare il vetrino sulla soluzione Azure B per un altro 32° e ripetere la colorazione des. Se la colorazione è soddisfacente, lasciare asciugare brevemente il vetrino all'aria e procedere al passaggio successivo. Dopo la colorazione e l'essiccazione del DES, la materia grigia sarà azzurra e i motoneuroni colorati di blu intenso saranno facilmente visibili.

Iniziare la dissezione subito dopo aver acceso il microscopio. Scaricare il supporto del tubo per fissare il tappo di un tubo micro fuge da 0,6 millimetri. Per la raccolta del campione, inserire 30 microlitri di tampone di lisi della Guinea e del tiocianato nel tappo e coprire la superficie distribuendo la soluzione.

Con la punta di una pipetta, allineare il tappo con il foro e l'obiettivo. Con il software del microscopio usurato, mantenere il cappuccio in posizione coperta fino all'avvio dell'acquisizione laser. Posizionare il vetrino essiccato all'aria capovolto sul tavolino del microscopio in modo che il lato della membrana sia rivolto verso il basso e la sezione sia allineata con il foro.

Con il vetrino in posizione, concentrarsi su una sezione del midollo spinale con l'obiettivo cinque x e quindi passare all'obiettivo 20 x per la dissezione. Per prima cosa, segna una regione fittizia con la penna ottica e lascia che il laser la ritagli senza raccoglierla. Questo rilassa la membrana e rende possibile marcare e tagliare più regioni in successione.

Successivamente, rifocalizza e identifica i motoneuroni nella regione ventrale del corno. Questi neuroni sono riconoscibili per la loro posizione, la morfologia parmalale, le grandi dimensioni e la colorazione blu scuro con Azure B.Utilizzando la penna ottica, selezionare lo strumento di disegno e segnare lungo il bordo dei motoneuroni creando un contorno completo. Cerca di rendere il contorno il più vicino possibile al motoneurone per evitare la contaminazione da altre cellule.

È possibile contrassegnare più celle prima del taglio poiché il software ricorderà le posizioni quando è pronto per il taglio, porterà il cappuccio sotto la posizione di taglio e farà clic sul pulsante di avvio per avviare la dissezione del motoneurone con il laser. Raccogli tutti i motoneuroni da tutte le sezioni su un vetrino nel tappo di un tubo micro fuge. Al termine della raccolta, estrarre la provetta per microfughe dal supporto scaricando il vassoio e rimuovendo delicatamente la provetta completamente, sciogliere completamente i motoneuroni e tamponare pipettando la soluzione su e giù.

Spostare la soluzione nel corpo della provetta mediante centrifugazione, congelare immediatamente il campione in ghiaccio secco e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius dopo la colorazione con Azure B.I motoneuroni appaiono come grandi corpi cellulari colorati di scuro. Sono confermati dagli anticorpi anti CATT, dalla colorazione e sono facilmente differenziabili dalle cellule vicine più piccole. In questo esempio, i corpi cellulari dei motoneuroni sono stati delineati con la penna ottica e numerati dal software.

Qui i corpi cellulari sono stati tagliati con il laser e fatti cadere nel tubo di raccolta con i contorni spenti. L'entità del danno laser alle regioni vicine è evidente. Di seguito sono riportati i risultati tipici di un'analisi elettroforetica dell'integrità dell'RNA di un campione di circa 4.000 corpi cellulari di motoneuroni di topo raccolti da LMD.

Si notino i picchi prominenti dell'RNA ribosomiale. Questo processo, dalla colorazione del vetrino alla dissezione del motoneurone, deve essere completato entro 30 minuti per tutte le sezioni di un vetrino per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare il più rapidamente possibile, sia nella dissezione iniziale e nell'incorporamento del cordone, sia nelle fasi finali della colorazione e della microdissezione a cattura laser dei motoneuroni.