Valutare Contributi specie-specifiche per lo sviluppo craniofacciale Uso Chimere Quaglia-anatra

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare le chimere del dotto delle quaglie come mezzo per studiare i meccanismi attraverso i quali le cellule della crosta neurale generano modelli specie-specifici durante lo sviluppo craniale facciale. Ciò si ottiene sezionando e rimuovendo prima una striscia della piega neurale dalla regione cerebrale posteriore media e anteriore di un embrione di quaglia allo stadio 9,5. Il secondo passo prevede il trasferimento della piega neurale del donatore di quaglie all'embrione ospite dell'anatra.

La terza fase prevede la dissezione e la rimozione della regione equivalente di un embrione ospite di anatra allo stadio 9.5. Il passaggio finale consiste nel posizionare la piega neurale della bobina nella regione dell'anatra, del rombencefalo medio e anteriore. In definitiva, gli embrioni chimerici risultanti possono individuare i cambiamenti mediati dalla cresta neurale nell'espressione genica attraverso l'ibridazione in C 2 e possono anche rivelare cambiamenti morfologici attraverso analisi istologiche.

Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavo guardando i pellicani marroni volare sopra Ocean Beach a San Francisco. Mi sono reso conto che le cellule della cresta neurale devono essere la fonte del modello specie-specifico poiché danno origine alle ossa e alle cartilagini del loro lungo scheletro a becco. Anche se non sono riuscito a rintracciare le uova di pellicano marrone, sono riuscito a trovare l'anatra bianca alla pechinese.

Dato che San Francisco ha la più grande Chinatown al di fuori dell'Asia sfruttando le differenze nei tassi di maturazione e morfologia tra quaglie e anatre. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo come la comprensione delle origini del modello specie-specifico, A eseguire l'intervento chirurgico sarà la dottoressa Jennifer Fish, che è una borsista post-dottorato Nel mio laboratorio, l'assistenza sarà Kate Ovitz, che è una studentessa laureata Utilizzando un panini e un bruciatore riscaldare l'estremità stretta di una pipetta di pasta fino a quando il vetro lungo il cono inizia a sciogliersi. Rimuoverlo dal fuoco e tirare il puntale fino a quando la pipetta non diventa sigillata.

Assicurarsi che una parte della parte rastremata abbia un diametro esterno compreso tra 0,7 e un millimetro. Quindi rompere l'estremità sigillata a circa quattro centimetri dal cono. Quindi, collegare circa due piedi di tubo di gomma all'estremità aperta del soffio della pipetta sull'altra estremità.

L'aria non deve passare attraverso la connessione o l'altra estremità della pipetta, mentre fornisce una leggera pressione soffiando sul tubo. Utilizzare una matita propano, un cannello a fiamma per riscaldare un'area ovale su un lato della pipetta appena sotto l'inizio del cono. Non appena il vetro inizia a piegarsi verso l'esterno, rimuovere la pipetta dalla fiamma e soffiare delicatamente attraverso il tubo di gomma.

Questo farà sì che la parte riscaldata del bicchiere formi una bolla a forma di salsiccia. Troppa pressione farà scoppiare la bolla di vetro, e questo dovrebbe essere evitato. La finestra risultante nella pipetta dovrebbe essere larga circa un centimetro e lunga da un centimetro e mezzo a due centimetri.

Ora punta l'estremità affusolata verso l'alto e raschia la bolla in un contenitore di vetro per rifiuti soffiando delicatamente attraverso il tubo per evitare che frammenti di vetro entrino nella pipetta. Quindi, usando la fiamma a propano, bruciare con cura i bordi rimanenti della bolla e lucidare a fuoco i lati della finestra aperta. Quindi, tenere la matita a punta di diamante in posizione verticale, utilizzare una matita a punta di diamante per incidere l'estremità affusolata della pipetta a un centimetro dall'inizio della conicità.

Usando una pinza, rompere delicatamente la pipetta in corrispondenza della linea incisa. Per rimuovere la punta, controllare al microscopio per assicurarsi che la rottura sia pulita e non frastagliata. Tenere la pipetta come si terrebbe una matita con un dito indice sopra la finestra aperta a circa 9,5 millimetri dalla punta.

Ammorbidire il vetro della pipetta tenendolo adiacente al bordo della fiamma di un bruciatore ad alcool. Applicare pressione sul puntale con una pinza per piegare l'estremità stretta della pipetta verso il basso con un angolo di 60 gradi sotto un cannocchiale da dissezione. Rapidamente e con attenzione, lucidare a fuoco la punta con il bruciatore ad alcool.

L'apertura finita deve essere arrotondata e non ostruita. Si noti che la punta diventerà ristretta e inutilizzabile se tenuta nella fiamma troppo a lungo. Ora lubrificare un tubo di gomma lungo 2,5 centimetri con etanolo al 70%.

Fallo scorrere sullo stelo della pipetta dal basso verso l'alto per coprire la finestra aperta. Quindi posizionare un bulbo di lattice da due millilitri sull'estremità aperta della pipetta. Per mantenere la pressione dell'aria interna, per prima cosa prepara l'uovo ospite.

Taglia la membrana Vitale usando un ago di tungsteno affilato a fiamma e tira la membrana sopra l'embrione. Quindi richiudi l'ovulo con del nastro adesivo come fatto per l'ovulo della donatrice. Rimuovi il nastro adesivo dalla finestra sull'ovulo della donatrice per tagliare la piega neurale dall'embrione della donatrice.

Fai delle fessure su entrambi i lati del tubo neurale usando un ago di tungsteno affilato a fiamma. Quindi tagliare il tubo neurale ai livelli anteriori e posteriori desiderati dell'innesto e separare l'innesto dal resto del tubo neurale. Prestare attenzione a tutti i dettagli anatomici particolari come la forma anteriore rispetto a quella posteriore dell'innesto, che consentirà al tessuto donatore di essere orientato correttamente.

Quando viene posizionato nell'ostia, assicurarsi che l'ago di tungsteno sia estremamente affilato. Usa movimenti rapidi e deliberati per rimuovere completamente il tessuto e in un unico pezzo, rimuovere la piega neurale dall'embrione del donatore usando una pipetta sciamanica. Aspirare la minor quantità di liquido possibile o il fazzoletto potrebbe galleggiare via durante il trasferimento.

Ora rimuovi il nastro adesivo dalla finestra sull'ovulo ospite e usa la pipetta sciamanica per posizionare la piega neurale del donatore accanto all'embrione ospite adiacente alla regione del tubo neurale che riceverà il trapianto. Ora separa la piega neurale dal tubo neurale dell'embrione ospite come fatto con il donatore. Fare attenzione a rimuovere un innesto di dimensioni uguali a quelle del tessuto donatore.

Spingi delicatamente questo tessuto ospite lontano dall'embrione. Quindi, con un ago di tungsteno smussato o la punta arrotondata di una micropipetta, spostare delicatamente la piega neurale del donatore nel tubo neurale dell'ospite, mantenendo il corretto orientamento delle antere, posteriori e ventrali dorsali. Assicurati che l'innesto sia infilato lungo i lati, ma assicurati di non colpire o danneggiare i tessuti sottostanti.

La soluzione salina sterile deve essere applicata con cura e delicatezza sull'embrione ospite. Se ci sono segni di essiccazione, ora richiudi ed etichetta con cura l'ovulo e rimettilo delicatamente in un'incubatrice ad alta umidità dove l'embrione chimerico può svilupparsi fino allo stadio desiderato. Per l'analisi.

Per l'analisi, raccogli gli embrioni chimerici nel fissativo freddo di Sarah appena fatto. Quindi posizionali immediatamente su un bilanciere a quattro gradi Celsius per un fissaggio notturno. Ciò consentirà un rilevamento più sensibile delle uova di quaglia con l'anticorpo anti quaglia.

Un altro passo importante per l'analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa in tempo reale è il congelamento degli embrioni e dell'azoto liquido prima dell'RNA. Le bobine di estrazione e le anatre mostrano notevoli differenze di dimensioni e forma, e quindi i loro embrioni sono ideali per realizzare un sistema chimerico. Studiare lo sviluppo craniofacciale C.

In particolare, il sistema è utile per studiare il ruolo delle cellule della cresta neurale. Nel modellare lo scheletro facciale nel chimerico qua embrione donatore, le cellule della cresta neurale della quaglia migrano nell'arco mandibolare dell'anatra ospite. In uno schema simile a quello di un'anatra, le cellule donatrici di quaglia in verde sono viste con un anticorpo anti quaglia dal punto di vista ventrale.

In un embrione chimerico allo stadio 12, la cresta neurale del donatore genera uno scheletro mandibolare di dimensioni e forma simili a quelle di una quaglia. Una volta padroneggiato, ogni trapianto può essere eseguito in circa cinque minuti. Se fatto correttamente più a lungo, mette l'embrione a rischio di essiccazione e il tasso di sopravvivenza diminuirà.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante essere consapevoli della propria postura, rilassare le spalle e mantenere una buona posizione delle mani. Inoltre, sviluppa una routine e posiziona gli strumenti chirurgici e i reagenti nello stesso posto ogni volta in modo da poter tenere gli occhi al microscopio e muovere le mani in modo automatizzato.