Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli osteoclasti dal midollo osseo di topo in gran numero. Ciò si ottiene raccogliendo prima le ossa dai topi soppressi. Successivamente, le cellule vengono liberate dal midollo osseo utilizzando un mortaio e un pestello per schiacciare le ossa in un tampone di fatti.

Quindi la soluzione di midollo osseo viene stratificata sul mezzo di separazione cellulare a gradiente di densità e viene eseguita la separazione cellulare a gradiente di densità. Infine, lo strato contenente le cellule di interesse viene aspirato e le cellule vengono poste in un terreno di induzione dei microfagi del midollo osseo. In definitiva, la colorazione a trappola viene utilizzata per mostrare la presenza di un gran numero di osteoclasti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle malattie associate all'alterata funzione degli osteoclasti, che possono variare in gravità dalla malattia neonatale letale dovuta all'incapacità di formare uno spazio midollare per l'emopoiesi a patologie più comunemente riscontrate come l'osteoporosi perché produce un metodo affidabile per isolare un gran numero di osteoclasti dal midollo osseo di topo. Per iniziare, portare 10 millilitri di separazione cellulare a gradiente di densità disponibile in commercio, da media a temperatura ambiente in una provetta conica da 50 millilitri. Posizionare un'aliquota di 50 millilitri di tampone fax a temperatura ambiente da utilizzare con il mezzo di separazione delle celle a gradiente di densità.

Dopo aver preparato ulteriori terreni e soppresso un mouse C 57 black six, secondo il protocollo di testo, posizionare il topo su una tavola di dissezione e utilizzare il 70% di etanolo. Per spruzzarlo, raccogli la fera tibia hum occhio e colonna vertebrale. Quindi posizionare le ossa in un tampone di fatto sul ghiaccio.

Successivamente, usando carta velina pulita, rimuovere il muscolo e i tessuti molli dalle ossa. Mettere le ossa in un mortaio e pestello con tre millilitri di tampone e schiacciarle delicatamente. Quindi aspirare il liquido macchiato di sangue e passarlo attraverso un colino da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.

Aggiungere altri cinque millilitri di tampone per effetti all'osso frantumato e schiacciare ulteriormente prima di trasferire il liquido attraverso il colino nel tubo da 50 millilitri. Continua con questo processo fino a quando il fluido non si macchia più di rosso prima di pellettare il midollo osseo a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per eseguire una separazione in gradiente, aspirare i surnatanti dal pellet cellulare e utilizzare 10 millilitri di tampone fax per risus.

Sospendere il pellet, inclinare la provetta conica del mezzo di separazione cellulare a gradiente di densità a temperatura ambiente a circa 30 gradi e utilizzare una pipetta elettrica con la punta della pipetta contro la superficie superiore interna della provetta. Stratificare lentamente la soluzione di midollo osseo sul terreno utilizzando una centrifuga a temperatura ambiente senza accelerazione o decelerazione. Centrifugare la sfumatura a 200 Gs per 15 minuti.

Quindi aspirare lo strato intermedio torbido, che contiene le cellule di interesse e trasferirle in un nuovo tubo conico. Aggiungere 20 millilitri di tampone fax ghiacciato per lavare le celle. Quindi utilizzare un millilitro di terreno stimolante i microfagi del midollo osseo per risospendere il pellet cellulare finale dopo il conteggio delle cellule.

Ha inserito due millilitri di terreno stimolante per microfagi in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Quindi aggiungere 200.000 cellule a ciascun pozzetto, una densità cellulare che garantirà un'adeguata coltura degli osteoclasti in vitro. Agitare delicatamente la piastra e incubare a 37 gradi Celsius senza cambiare il terreno per tre giorni.

Dopo il terzo giorno, cambia il terreno con il mezzo di induzione degli osteoclasti del midollo osseo e inizia a cambiarlo ogni giorno per cinque-sette giorni. A quel punto dovrebbero essere visibili grandi osteoclasti multinucleati. Fare riferimento al protocollo di testo per la colorazione e il saggio di riassorbimento, come mostrato qui.

Un numero elevato di osteoclasti può essere confermato utilizzando il test di resistenza ai tartrati. Gli osteoclasti che colorano i fosfotati sono visualizzati come grandi cellule viola con nuclei multipli utilizzando il protocollo dimostrato in questo video. È comune isolare gli osteoclasti con un massimo di 30 nuclei per cellula.

L'utilizzo di una superficie mineralizzata è considerato il metodo gold standard per valutare l'attività di riassorbimento degli osteoclasti in vitro. In questa figura, la microscopia in campo chiaro con ingrandimento 10 x dimostra una percentuale di pozzi di superficie mineralizzata o di riassorbimento che si formano come delineato in nero, il che consente di determinare la capacità di riassorbimento degli osteoclasti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare in modo affidabile un gran numero di osteoclasti dal midollo osseo del topo.